Summary
Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.
Abstract
Durchflusszytometrie (FC) ist die Methode der Wahl zur semi-quantitativen Messung der Zelloberfläche Antigen Marker. Vor kurzem hat diese Technik für phänotypische Analysen von extrazellulären Vesikeln (EV) einschließlich Exosomen (Exo) im peripheren Blut und anderen Körperflüssigkeiten verwendet worden. Die geringe Größe des EV schreibt die Verwendung von speziellen Instrumenten mit einer Nachweisgrenze um 50-100 nm. Alternativ kann EV an Latex Microbeads gebunden werden, die vom FC erkannt werden können. Microbeads, konjugiert mit Antikörpern, die EV-assoziierten Marker/Cluster Differenzierung CD63, CD9 und CD81 erkennen kann verwendet werden für EV erfassen. Exo isoliert von CM kann mit oder ohne Voranreicherung durch Ultrazentrifugation analysiert werden. Dieser Ansatz eignet sich für EV-Analysen mit konventionellen FC Instrumenten. Unsere Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Werte und EV-Konzentration. Stören EV durch Beschallung drastisch verringerte MFI, darauf hinweist, dass die Methode nicht Membran Schutt erkennt. Wir berichten über eine genaue und zuverlässige Methode für die Analyse von Oberflächenantigenen EV, die leicht in jedem Labor durchgeführt werden können.
Introduction
Zellen sezernieren extrazelluläre Vesikel (EV) in verschiedenen Größen, einschließlich Microvesicles (MV) und Exosomen (Exo). Letzteres kann aus MV durch Größe und subzelluläre Abteil des Ursprungs unterschieden werden. MV (200 – 1.000 nm Größe) von Vergießen von der Plasmamembran von übergeordneten Zellen freigesetzt werden. Im Gegensatz dazu Exo (30-150 nm) stammen aus Endosomal Membranen und in den Extrazellulärraum freigesetzt werden, wenn die multivesicular Körper (MVB) verschmelzen mit der Zellmembran1,2.
EV werden zunehmend als diagnostischen Biomarkern verwendet, sowie als, potenziell, therapeutische Hilfsmittel in vielen Bereichen, einschließlich Onkologie, Neurologie, Kardiologie und Erkrankungen des Bewegungsapparates3,4,5. Eine große Mehrheit der laufenden Studien mit EV als Therapeutika die Isolation von Vesikeln aus Zelle konditioniertes Medium (CM) der in-vitro kultivierten Zellen nutzen. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) ausüben, wohltuende Wirkung in mehreren Kontexten und MSC-abgeleitete EV haben Vorteile in den Modellen der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen6 und Gehirn Verletzungen7gezeigt. MSC-abgeleitete EV auch ausstellen Immunsystem modulierende Aktivitäten, die zur Immunabwehr, Behandlung genutzt werden können, wie in einem Modell der Therapie-refraktären Graft - Versus - Host-Seuche8gezeigt. Amniotische Flüssigkeit Stammzellen (hAFS) bereichern aktiv CM mit MVs und Exo, heterogen verteilt in der Größe (50-1.000 nm), die mehrere biologische Wirkungen, z. B. Verbreitung von differenzierten Zellen, Angiogenese, Hemmung der Fibrose, vermitteln und Herzschutz-4. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass EV und vor allem Exo, abgesondert von menschlichen Herz-Kreislauf-abgeleitete Vorläuferzellen (Exo-CPC) verkleinern myokardialen Infarkt in Ratten5,9.
Exo-Aktie einen gemeinsamen Satz von Proteine auf ihrer Oberfläche, einschließlich Tetraspanins (CD63, CD81, CD9) und großen Histocompatibility complex Klasse I (MHC-ich). Neben dieser gemeinsamen Reihe von Proteinen Exo enthalten auch Proteine spezifisch für die EV-Teilmenge des Zelltyps Produzent. Exo-Marker gewinnen größter Bedeutung, weil sie eine entscheidende Rolle bei Inter Zellkommunikation, dadurch regulieren viele biologische Prozesse5,10spielen. Aufgrund ihrer geringen Größe, zu finden einer einfachen Möglichkeit, analysieren, EV mit klassischen Flow Cytometry (FC) bleibt eine große Herausforderung.
Hier präsentieren wir Ihnen ein vereinfachtes Protokoll für EV-Analyse mit FC, die in Pre-angereicherten Proben durch Ultrazentrifugation oder direkt in CM (Abbildung 1) angewendet werden können. Die Methode verwendet Perlen mit einem spezifischen Antikörper, der kanonischen Exo-assoziierten Oberfläche Epitope (CD63, CD9, CD81) bindet beschichtet ohne zusätzliche Waschungen. FC-Analysen können mit einer herkömmlichen Cytometer ohne die Notwendigkeit für Anpassungen vor Messungen durchgeführt werden. Methoden zur Charakterisierung von Antigenen auf einzelne kleine Teilchen mit fließen Cytometers wurden von anderen Gruppen in Bezug auf verschiedene Anwendungen11,12,13beschrieben. Hier verwendeten wir funktionalisierten magnetische Beads für den Fang von kleinen Partikeln und Exo, gefolgt von Phänotypisierung von erfassten Partikel von FC. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um die Antigenen Zusammensetzung von kleinen Vesikeln freigesetzt durch jeden Zelltyp in-vitro-zu charakterisieren, hier zur Verfügung gestellten wir bestimmte Zelle Kulturbedingungen, die gelten für die Kultur der menschlichen kardialen Vorläuferzellen (CPC) und die meisten geeigneter Rahmenbedingungen für die Produktion von EV von diesen Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erhebung und Verarbeitung von konditionierten Medien
- 55 cm2 Petrischalen mit 0,02 % Schweinehaut Gelatine mit PBS-Puffer zu beschichten.
- CPC (8.000/cm2) in vorbeschichtete Gerichte-Platte mit 7 mL von Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) ergänzt mit 20 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
Hinweis: Der Begriff "CPC" bezieht sich auf menschliche Explant abgeleitete Zellen, die beschrieben an anderer Stelle14. CM kann von verschiedenen Zelltypen in spezifischen Kulturbedingungen kultiviert gesammelt werden. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten unter einem biologischen Haube. - Sobald Zellen zu erreichen 80 % Zusammenströmen, entnehmen Sie das Kulturmedium waschen zweimal mit Dulbeccos PBS (PBS) Ca und Mg-freie Zellen und ersetzen Sie es mit 10 mL der Exo-Herstellung serumfreien Medium (Dulbeccos geändert Eagle Medium [DMEM] hohe Glukose, 4,5 g/mL).
Hinweis: Fahren Sie mit einer progressiven Abnahme der Serumkonzentration im Kulturmedium, Zellen in serumfreien Zustand (SF) schrittweise anzupassen. Für Zellen, die sind empfindlich gegen serumfreien Medium vorbereiten FBS-haltigem Medium aber erschöpft von EV. Bereiten Sie Medium ergänzt mit allen Nährstoffen, plus 10 – 20 % (V/V) FBS. Zentrifugieren Sie das Medium über Nacht bei 100.000 × g, 4 ° C. Seien Sie sich bewusst, dass dieses Verfahren keine 100 % Entfernung von FBS-abgeleitete EV garantiert. - Nach 7 Tagen sammeln Sie die CM in eine Zentrifuge Polypropylen-Rohren.
Hinweis: Die Zeit für mittlere Klimaanlage richtet sich nach dem Zelltyp. Erhöhen Sie für Zellen, die empfindlich auf serumfreien Medium das Ausgangsvolumen des Mediums zu und verringern Sie die Zeit für CM Sammlung bis 24-48 h. - Klar CM vom Zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 3.000 X g für 20 min bei 4 – 10 ° C. Den Überstand in ein 100 kDa Filter Zentrifugenröhrchen zu sammeln.
- Konzentrat gelöscht CM durch Drehen der Röhre bei 2.000 X g für 20 min bei 4 – 10 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt verringert sich das Ausgangsvolumen cm erlaubt die Verwendung von kleinvolumigen Rohre für high-Speed-Zentrifuge-Schritte und wird dazu beitragen, um kleine Protein-Aggregate zu beseitigen. - Das Konzentrat in einem Microcentrifuge Schlauch zu sammeln. Zentrifuge bei 10.000 X g für 15 min bei 4 – 10 ° C.
- Sammeln Sie den Überstand zu und fahren Sie mit Abschnitt 2 (EV Bereicherung). Wenn eine Ultrazentrifuge nicht verfügbar ist, gehen Sie direkt zu Abschnitt 3 (Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) Quantifizierung).
Hinweis: Voranreicherung der EV-Fraktion verbessert letzten Auslesen in Fluoreszenzintensität (siehe repräsentative Ergebnisse und Abbildung 4). Geräumte CM (von Punkt 1.8) kann nicht länger als 1-2 Tage bei 4 ° C gelagert werden oder alternativ bei −80 ° C für mehrere Monate. 5 CM sollte bereits geräumten Zelltrümmer vor der Lagerung bei-80 ° C zu entfernen, um sicherzustellen, dass Exosom mittlere Schmutz nicht in den Frost-Tausalz-Prozess gebildet wird.
(2) extrazelluläre Vesikel Bereicherung durch Ultrazentrifuge (Optional)
- Ort des Überstands von 1,8 Schritt in einem Polycarbonat dickwandigen Ultrazentrifugen Rohr. Füllen Sie den Schlauch mit 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS), bis es die maximale Kapazität (3,2 mL erreicht).
- Proben in einem Titan feste Winkel Rotor (8 x 3.2 mL, k-Faktor 13) zu laden. Laden Sie den Rotor in eine Tischplatte Ultrazentrifugen. Ultrazentrifugen bei 100.000 X g 3 h bei 4 – 10 ° C.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 µL 1 X PBS Aufschwemmen.
(3) Nanopartikel Tracking Analyse (NTA) Quantifizierung
- Verdünnen Sie 1 µL der Probe (von entweder Schritt 2.3 oder 1,8) in 999 µL 1 X PBS. Laden Sie die Probe in eine 1 mL Spritze, Vermeidung von Blasenbildung. Laden Sie die Spritze in der Ansaugöffnung der Prüfung Kammer.
- Schalten Sie den Laser ein. Öffnen Sie die Kamera mit der Schaltfläche " erfassen ". Schärfe einstellen.
- Erfassen Sie mindestens 3 verschiedene Bilder von 60 s.
- Die 3 verschiedenen Akquisitionen mit der Batch-Prozess -Option in der Software zu analysieren.
Hinweis: Wenn die NTA-Technik nicht verfügbar ist, führen Sie eine Protein Quantifizierung von der Bradford-Test (1 x 108 Partikel entsprechen 1 – 2 µg des gesamten Proteins nach Ultrazentrifugation oder 50 – 60 µg Gesamt-Protein erfolgt die Quantifizierung direkt für CM als Freuen Sie sich auf Proteine Verunreinigungen von EV; siehe Tabelle 1)5.
4. die Probenvorbereitung
- Bereiten Sie einen Pool von den 3 Arten von Capture-Perlen (CD9 Perlen, CD63 Perlen und CD81 Perlen auf eine 1: Verhältnis 1:1; siehe Tabelle der Materialien) und Wirbel.
Hinweis: Der Pool wurde getestet, um für 1 Monat stabil sein. Eine einzige Art der Erfassung Wulst verwendet werden, dadurch wird die Erkennung von EV-Sub-Populationen nicht diskrimierbare mit Pool von Perlen. Mithilfe von einzelnen Antigen Erfassung Perlen werden möglich, zeitgenössische zeigen das Vorhandensein von Tetraspanin Proteine, wie z.B. CD9, CD81 oder CD63, und das Antigen des Interesses durch fluoreszierende Antikörper nachgewiesen. Alternative Aldehyd-Sulfat Latex Perlen sind auch im Handel erhältlich. Diese Perlen präsentieren hydrophobe Oberfläche für die Adsorption von MV und EV. - Fügen Sie in einem Rundboden Röhrchen die Menge des Volumens entspricht bei 1 x 108 Partikel plus 1 µL der Wulst Pool, entspricht 1,2 x 105 Perlen insgesamt (für jeden Test).
- Bereiten Sie ein Röhrchen mit 1 µL Perlen ohne EV, die als Negativkontrolle, hiermit als "Perlen" bezeichnet wird.
- Stellen Sie die Lautstärke auf 100 µL mit 1 X PBS. Legen Sie das Rohr in einem Thermo-Mixer, und schütteln Sie bei 400 u/min über Nacht bei 4 – 10 ° C.
- Verschieben Sie am nächsten Tag die Proben an ein Rundboden-96-Well-Platte (oder Leuchtstoffröhren).
- Fügen Sie des Antikörpers (10 µg/mL CD9_FITC, 10 µg/mL CD63_PE und 5 µg/mL des CD81_PE).
- Inkubieren Sie 1 h bei 4 – 10 ° c
- Fügen Sie 100 µL 1 X PBS in jede Vertiefung.
- Gehen Sie zum Erwerb.
5. Erwerb
- Öffnen Sie die Software zur Datenerfassung und starten Sie das Gerät (Cytometer > System-Startup-Programm). Öffnen Sie ein neues Experiment.
- Erstellen Sie eine experimentelle Vorlage und dann Platte und dann Hinzufügen Platte. Wählen Sie die Position der Proben auf dem Teller und drücken Sie dann Set als Probe gut.
- Geben Sie ein Beispiel (d. h. CPC #1_CD9FITC) in den Naming Rules. Öffnen Sie die Registerkarte " Kanal " und wechseln Sie auf der FITC und PE-Kanäle.
- Die Platte in das Instrument zu laden.
- Drücken Sie Dot-Plot , und erstellen Sie einen neuen Dot-Plot (P1). Stellen Sie nach vorn Scatter Bereich (FSC-A) im Vergleich zu Side Scatter-Bereich (SSC-A).
- Wählen Sie zum Starten des Lasers und der Fluidik zu initialisieren . Drücken Sie erwerben um die Übernahme zu starten.
- Passen Sie die Skalierung um die Bevölkerung in der Mitte der P1 zeigen. In P1 zeichnen die "Perlen" Tor rund um die gesamte Bevölkerung (mit Ausnahme von Schutt) (Abbildung 2A). Drücken Sie Stop.
- Drücken Sie Dot-Plot , und erstellen Sie einen neuen Dot-Plot (P2). Eingestellt nach vorn Scatter-Höhe (FSC-H) im Vergleich zu FSC-A. Tor der neuen Dot-Plot auf "Perlen." P2 zeichnen ein neues Tor um die größere Bevölkerung und nennen es "Unterhemden" (Abbildung 2A).
Hinweis: Diese Strategie wurde entwickelt, um so viel wie möglichen den Einschluss von Perlen Aggregaten in Erfassung und Analyse-Schritte zu vermeiden. - Drücken Sie Dot Plot und erstellen Sie zwei unterschiedliche Dot Grundstücke; ein FITC gegen SSC-A und einem PE gegen SSC-A. Tor des neue Dot-Plots auf "Unterhemden."
- Wählen Sie die Anzahl der Ereignisse zu erfassen (z. B. 20.000). Wählen Sie Datensatz und starten Sie das Experiment zu.
(6) Datenanalyse
- Laden Sie die Übernahme-Dateien in die Analysesoftware.
Hinweis: Die folgenden Schritte müssen für jede Probe einschließlich nur Perlen und jeden unbekannten Probe angewandt werden. - Öffnen Sie ein neues Protokoll und erstellen Sie Punkt plottet nach der gleichen Strategie, die in Schritt 5 beschrieben.
- Legen Sie alle Scatter Achsen linear skaliert und die Fluoreszenz-Achsen Skala anmelden.
- Zeigen Sie die Fluoreszenz geometrischen Mittelwert (X-Gmean-MFI) im FITC und PE-Kanal.
- Berechnen Sie das Verhältnis X-Gbedeuten , der Proben / X-Gbedeuten , der die Perlen gefärbt mit Antikörper ohne Exosom.
- Vergleichen Sie die Falte Änderung MFI von verschiedenen EV Zubereitungen.
(7) extrazelluläre Vesikel Nummer Titration
Hinweis: Abschnitte 7 bis 10 können durchgeführt werden, um die Anzahl der Partikel, Antikörper-Konzentration und Spezifität einrichten, aber können übersprungen werden, wenn der Zelltyp, aus denen EV abgeleitet, und Antikörper bleiben unverändert.
- Verdünnen Sie Partikel aus Schritt 2.3, 1 X PBS zu erhalten eine Reihe von Suspensionen von 5 x 105 bis hin zu 2,5 x 108 Partikel gewonnen.
- Für jede Aussetzung in einem Rundboden Röhrchen fügen Sie 1 µL Erfassung Wulst Pool hinzu.
- Folgen Sie das Protokoll ab Schritt 4.3.
(8) Antikörper-Titration
Hinweis: Antikörper-Titration erfolgt in der Regel durch Zugabe von einem einzigen Antikörper für jedes Rohr.
- Die Anzahl der EV (total Teilchen oder Proteingehalt) in allen Proben konstant zu halten.
Hinweis: Die entsprechende Anzahl wird empirisch bestimmt, wie oben in Abschnitt 7 beschrieben. - Folgen Sie das Protokoll von Stufen 4.1 bis 4.5.
- Testen Sie eine Reihe von Antikörper-Konzentrationen oben und unter dem Betrag von dem Lieferanten empfohlen. Zum Beispiel für einen Antikörper mit einer empfohlenen Konzentration von 10 µg/mL pro Test, test 1, 2, 5, 10, 20 und 50 µg/mL. Umfassen Sie eine Probe mit "Perlen", die höchste Konzentration des Antikörpers hinzufügen.
- Inkubation für 1 h bei 4 – 10 ° C.
- 100 µL 1 X PBS für jede Probe hinzufügen.
- Die Proben zu erwerben.
9. die Inkubationszeit
- Die Inkubationszeit, die Durchführung von Akquisitionen zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. 1 h, 2 h und 5 h) zu überprüfen.
- Folgen Sie das Protokoll ab Abschnitt 4.
- Inkubieren Sie Proben bei 4 – 10 ° C für 1 h.
- Proben zu erwerben.
- Inkubieren Sie Proben bei 4 – 10 ° C für 3 h.
- Proben zu erwerben.
10. Protokoll Validierung
-
EV-Bindung
- Fügen Sie in einem Rundboden Röhrchen die Menge an Volumen, 1 x 108 Partikel oder die entsprechende Menge an Gesamt-Protein entspricht.
- Stellen Sie die Lautstärke auf 100 µL mit 1 X PBS.
- Stören die EV-Membran durch Beschallung (alternativ ein Hitze-Schock-Schritt kann angewendet werden) nach Herstellerangaben. Eingestellte Frequenz und Intensität. Die Beschallung Frist kann empirisch festgelegt werden, setzen eine Zeitverlauf Experiment (d. h., 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc..).
- 1 µL der Wulst Pool hinzufügen.
- Folgen Sie das Protokoll ab Schritt 4.4.
-
Spezifität der Antikörper
- Bereiten Sie eine Röhre für jede Fluorochrom konjugiert IgG und fügen Sie den Komplex der Perlen-EV hinzu, wie in Schritt 4.6 beschrieben.
Hinweis: Die Fluorochrom konjugiert Isotype muss die IgG von der verwendeten Antikörper entsprechen.
- Bereiten Sie eine Röhre für jede Fluorochrom konjugiert IgG und fügen Sie den Komplex der Perlen-EV hinzu, wie in Schritt 4.6 beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gesamtzahl der Partikel für einheitliche Färbung
Da eine einzelne Perle mehr als ein Teilchen binden kann, testeten wir verschiedene Bedingungen, die kleinste Menge des gesamten EV (einzelne Antikörper pro Röhre) festgelegt, um die exponentielle Frühphase der MFI-Kurve zu erreichen. Eine feste Konzentration des Antikörpers wurde verwendet, während die Gesamtzahl der Partikel reichte von 5 x 105 bis 2,5 x 108. Wie in Abbildung 3A, die Anzahl der Partikel, die ermöglicht es uns, sicherzustellen, dass die Antikörper innerhalb einer akzeptablen MFI führt ist der Verzicht auf ein Übermaß an EV, 1 x 108 Partikel/Färbung.
Antikörper-titration
Wir haben die richtige Konzentration des Antikörpers, wodurch die höchste Signal verhindert die unspezifische Antikörperbindung. Dieser Test ist für 1 x 108 Partikel optimiert worden, wie in der vorherigen Einstellung bestimmt. Anti-CD9_FITC Anti-CD63_PE und Anti-CD81_PE wurden mit Konzentrationen von 1 bis 50 µg/mL (Abb. 3 b) getestet. Anti-CD9_FITC und Anti-CD63_PE Antikörper hat eine gute Auflösung des Signals (7,5 und 130-fold Wechsel der MFI vs. Perlen alleine, beziehungsweise) Wenn bei Konzentration von 10 µg/mL während der gewählten Konzentration verwendet, für die Anti-CD81_PE-Antikörper 5 µg/mL (465.3 Fach war Änderung MFI).
Methodenvalidierung
Um zu bestätigen, dass unsere Methode geeignet, nur "becherförmigen" extrazelluläre Vesikel und nicht Membran Ablagerungen zu analysieren, haben wir verschiedene Beschallung Schritte, bei 10 % der Amplitude, die Lösung mit Partikeln angewandt. 100 µL 1 x PBS-Lösung mit 1 x 10-8 -Partikeln unterzog sich verschiedene Beschallung Schritte von 30 Sekunden bis 5 Minuten und die daraus resultierende Vorbereitung mit gebrochenen und formschöne EV wurden analysiert, wie beschrieben (experimentelles Protokoll vom Punkt 3.3). dadurch, wir fanden, dass 30 Sekunden der Zellulite MFI zu verringern, die komplett nach 1 Minute gekippt wurde. Bei diesem Timepoint ist keine Fluoreszenz nachweisbar für eines der EV-Marker (Abbildung 3D).
Flow Cytometry Charakterisierung von HEK293 - und CPC-derived Exosomen
Diese Ergebnisse wurden nach dem oben dargestellten mit der Ultrazentrifuge Isolationsmethode Protokoll generiert. Isolierte Exosomen sind durch NTA Technik quantifiziert und mit 1 µL gemischte Perlen über Nacht geladen (1 X anti-CD9:1 anti-X-CD63:1 x Anti-CD81). Die komplexen Perlen + Exo waren voller Flecken, mit der richtigen Menge der Antikörper Anti-CD9_FITC, Anti-CD63_PE und Anti-CD81_PE (Abbildung 3EF und Tabelle 2).
Darüber hinaus durch die Verwendung von EV-CPC verglichen wir FC Analyse mit oder ohne Voranreicherung durch Ultrazentrifugation. Abbildung 4 zeigt, dass beide Methoden Profil Exo Oberflächenmarker geeignet sind. Voranreicherung der extrazellulären Vesikel Fraktion verbessert Fluoreszenzintensität besonders für CD63_PE und CD81_PE Färbung (Abbildung 4 und Tabelle 3).
Abbildung 1: Protokoll und NTA Grundstücke. (A) schematische Darstellung des experimentellen Protokolls. (B) Vertreter NTA Grundstücke für Medien bedingt, Pre Ultrazentrifugen und Post-Ultrazentrifugen Schritt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Erwerb und Datenanalyse. (A) Flow Cytometry Analyse beginnt mit der Erstellung eines ersten Tores für die gesamte Perlen Bevölkerung "Perlen" (mit Ausnahme von Schutt) und dann ein zweites Tor um "Unterhemden" Ereignisse zu unterscheiden. Unterhemden werden auf einem Grundstück einrichten mit FSC-H als x-Achse und FSC-A als y-Achse angespritzt. (B-D) Repräsentativen Punkt plottet zeigt rechts-Shift von Fluoreszenzintensität für die positive Bevölkerungen der Perlen-Exosomen komplexe (grün, CD9 + rot CD63 +; braun CD81 +). Isotype Kontrolle (violett) überschneiden sich negative grauen farbigen Perlen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Titration Kurven für die Anzahl der Teilchen (Pfeile zeigen die ausgewählte Menge der Partikel, 1 x 10-8). (A) Antikörper-Konzentrationen (Pfeile zeigen die ausgewählten Konzentration für jeden Antikörper verwendet). (B) sowohl Anzahl der Teilchen und Antikörper-Konzentration sind Plot vs. mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). (C)-Kurve zeigt 3 verschiedene Erwerb der Zubereitung mit 1 – 2 h oder 5 h Antikörper Inkubationszeit. (D)-Kurve zeigt den Rückgang der Fluoreszenz nach Beschallung zu verschiedenen Zeitpunkten. (E-F) Falten (Mittelwert ± SD) Änderung der MFI für CD9, CD63 und CD81 Vs Negativkontrolle (Perlen + Antikörper, keine EV) sind für HEK293 EV gezeigt (n = 3 unabhängige Wiederholungen) und für CPC EV (n = 3 Primärzelle Linien von 3 verschiedenen Patienten) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version des Diese Abbildung.
Abbildung 4: MFI Analyse und den Vergleich zwischen zwei Verfahren: direkte EV-Bindung mit Perlen (Perlen-Isolation zu erfassen) und Voranreicherung mit Ultrazentrifugen (Ultrazentrifuge Isolation). Daten werden angezeigt, wie Änderung (Mittelwert ± SD) der MFI für CD9 (A), (B) CD63 und (C) CD81 vs. Negativkontrolle (Perlen + Antikörper, keine EV) Falten. N = 3 Primärzelle Linien von 3 verschiedenen Patienten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| CPC | CONC NTA (Teil/µL) | Konz (µg/µL) |
| CPC #1 Pre-Ultrazentrifuge | 5.02E + 06 | 2.01 |
| CPC #1 Post-Ultrazentrifuge | 6.10E + 07 | 1.04 |
| CPC #2 Pre-Ultrazentrifuge | 5.74E + 06 | 2.30 |
| CPC #2 Post-Ultrazentrifuge | 7.43E + 07 | 0.79 |
| CPC #3 Pre-Ultrazentrifuge | 2.02E + 06 | 1.90 |
| CPC #3 Post-Ultrazentrifuge | 2.91E + 07 | 0,42 |
Tabelle 1: Vergleich zwischen NTA Konzentration und Proteinkonzentration für 3 verschiedene Patienten abgeleitet CPC vor und nach der Ultrazentrifuge.
| ÄNDERUNG DER MFI ± SD-FALTEN | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3,72 | 236.05 ± 43,40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1,87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8,94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23,18 |
Tabelle 2: Wert der Falte Änderung (Mittelwert ± SD) der MFI für HEK293 EV (n = 3 unabhängige Wiederholungen) und CPC EV (n = 3 Primärzelle Linien von 3 verschiedenen Patienten).
| ÄNDERUNG DER MFI ± SD-FALTEN | CD9 | CD63 | CD81 |
| Perlen-Isolation zu erfassen | 2.96 ± 1,45 | 65.65 ± 18.87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultrazentrifugen Isolation | 7,47 ± 2.71 | 236.00 ± 25.06. | 65.05 ± 13,38 |
Tabelle 3: Wert der Falte Änderung der MFI (Mittelwert ± SD) für CPC EV (n = 3 Primärzelle Linien von 3 verschiedenen Patienten) durch Erfassung Perlen oder Ultrazentrifugen isoliert.
Tabelle 4: Einzelnes Produkt-Spezifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionelle FC Technik bleibt die einfachste analytische Methode Marker auf die Oberfläche des EV ausgedrückt zu charakterisieren. In diesem Zusammenhang ist die Auswahl des am besten geeigneten Protokolls wichtig, nützliche Informationen über die einzelnen Teilchen Bruchteile von Interesse zu erhalten, durch die Vermeidung von Einschränkungen aufgrund der Empfindlichkeit des Instruments. Wir beschrieben eine Methode mit magnetischen Partikeln gepaart mit Antikörpern, die erkennen Exo und kleine EV Oberflächenantigenen, die für nachgeschaltete FC Anwendung geeignet sind. Wir validiert die Methode mit zwei verschiedenen Zelltypen: primäre menschlichen CPC, die entstehen als eine große Zelle Quelle für Exo-basierte Therapieansätze für Herz-Kreislauferkrankungen; und HEK293 Zellen, eine immortalisierte Zelllinie weit verbreitet in der Zelle Biologie Forschung aufgrund zuverlässiger Zellwachstum und Plastizität.
Die Methode kann auf Ultrazentrifugen angereicherte EV angewendet werden und für schnellere Analyse, auch direkt auf in-vitro-Zelle abgeleitete CM mit keine Voranreicherung durch Ultrazentrifugation. Das Ausgangsmaterial ist entscheidend beim Vergleich von Proben. Hinzufügen Erfassung Perlen direkt an die CM beschleunigt das Verfahren aber gleichzeitig verringern Fluoreszenzintensität, wie in Abbildung 4A. Es ist auch entscheidend für einen angemessenen Betrag von PBS verwenden, um Perlen und EV während der "Aufnahme" Schritt 4.4 mischen. Bei der Verwendung einer konstanten Inkubationszeit wird ein erhöhtes Volumen Fluoreszenzintensität aufgrund ineffizienter EV Kupplung abnehmen.
Eine Einschränkung des Protokolls ist, dass eine einzelne Aufnahme Perle mehrere EV/Exo-Partikel auf der Oberfläche binden kann. Dies schränkt die Möglichkeit der Identifizierung von Teilmengen von EV eigenartige Kombination von Antigenen mit mehreren Färbung zum Ausdruck zu bringen. Die Perle-basierte Methode ergibt daher semi-quantitativen Daten. Mit Perlen, die mit einer einzigen Aufnahme Ab (CD9, CD63 oder CD81) maximal die Charakterisierung von Partikeln, die zwei Epitope ausdrücken können: eines auf der Wulst vorhanden und anerkannt von der Erfassung Antikörper, das erkannt durch die Antikörper, die nachträglich hinzugefügt.
Der aktuelle Gold Standard für Exo-Analysen mittels FC ist ein Protokoll von van der Vlist Et Al. in 201215entwickelt. Es ermöglicht eine hochauflösende Analyse der EV eine optimierte Konfiguration der im Handel erhältlichen High-End-FC (z. B. BD Zustrom) verwenden. Dieses Protokoll ist extrem detaillierte und nützliche aber benötigt noch eine komplexe Hardware-Einstellung mit FC Kalibrierung vor Gebrauch. Drei Jahre später, Pospichalova Et Al.16 ein vereinfachtes Protokoll vorgesehenen FC Analyse der Exo mit einem dedizierten Cytometer speziell entwickelt für die Analyse von kleinen Partikeln (z. B. Apogee A50 Micro)17. In Bezug auf dieses Protokoll und andere, die besondere Schwelle Einstellung11verwendet haben, schlagen wir hier ein einfachen Protokolls um kleine EV Phänotypisierung mit magnetischen Bindung Perlen auszuführen, die für konventionelle FC Instrumente geeignet und bedarf keiner spezielle Einstellung. Verschiedene Protokolle haben Wulst-basierte Methoden zur Charakterisierung von kleinen EV in Körperflüssigkeiten gefunden von FC12beschrieben. Hier zeigen wir die Immunocapture von diskreten Sub-Populationen von Vesikeln positiv für CD9, CD63 und CD81, die gemeinhin als Exo-Marker18verwendet werden. Aldehyd-Sulfat Latex19,20 und Polystyrol12Perlen bleiben brauchbare Alternativen für die Bindung von EV in CM und Blutplasma Flüssigkeit; Allerdings ermöglichen Aldehyd-Gruppen auf der Oberfläche des Partikels Polymer ausgesetzt Kopplung von unspezifischen Proteine und andere Materialien, die Latex-Partikel, wodurch sich das Risiko einer Kontamination von Lipoprotein oder Apoptotic stellen während der Isolation und Erkennung 21,22zu verarbeiten.
Perlen im Protokoll verwendet binden nur ganze, gut geformte EV. Wir haben vorgeschlagen, EV Struktur durch Ultraschallbehandlung das Signal (Abschnitt 4, "Protokoll-Validierung") zu stillen zu stören. In der Tat eine Minute Beschallung führt zu verminderter Fluoreszenzintensität, was zeigt, dass ein positives Signal durch den Schutt der Membran adsorbiert an Perlen beeinflußt werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nichts zu verzollen.
Acknowledgments
L.b. wurde von Forschungsstipendien der Helmut Horten Stiftung und Velux Stiftung, Zürich (Schweiz) unterstützt. G.V wurde von Forschungsstipendien des Schweizerischen Nationalfonds, die Cecilia-Augusta-Stiftung, Lugano und der SHK-Stiftung Für Herz Und Kreislaufkrankheiten (Schweiz) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
