Summary
Protokollet beskrivs en reproducerbar metod utformad för användning med cell cellkulturer för att upptäcka ytan epitoper på små extracellulära blåsor (EV). Det använder specifika EV immunoprecipitation använder pärlor tillsammans med antikroppar som känner igen ytantigen CD9, CD63 och CD81. Metoden är optimerad för nedströms Flödesanalys flödescytometri.
Abstract
Flödescytometri (FC) är metoden för val av semi kvantitativ mätning av cellytan antigen markörer. Denna teknik har nyligen använts för fenotypisk analyser av extracellulära blåsor (EV) inklusive exosomes (Exo) i perifert blod och andra kroppsvätskor. Den lilla storleken på EV mandat användningen av särskilda instrument med en påvisbara gränsen runt 50-100 nm. Alternativt kan EV vara bunden till latex mikrokulor som kan upptäckas av FC. Mikrokulor, konjugerat med antikroppar som känner igen EV-associerade markörer/kluster av differentiering CD63, CD9 och CD81 kan användas för EV fånga. EXO isolerade från CM kan analyseras med eller utan före berikning av ultracentrifugering. Denna metod är lämplig för EV analyser med hjälp av konventionella FC instrument. Våra resultat visar en linjär korrelation mellan menar fluorescens intensitet (MFI) värden och EV koncentration. Störa EV genom ultraljudsbehandling dramatiskt minskade MFI, som visar att metoden inte upptäcker membran skräp. Vi rapporterar en korrekt och tillförlitlig metod för analys av EV ytantigener, som lätt kan genomföras i ett laboratorium.
Introduction
Celler utsöndrar extracellulära blåsor (EV) av olika storlekar, inklusive microvesicles (MV) och exosomes (Exo). Den senare kan skiljas från MV både storlek och subcellulär facket av ursprung. MV (200-1000 nm i storlek) frigörs från överordnade celler genom utgjuta från plasmamembranet. Omvänt, Exo (30 – 150 nm) härstammar från endosomal membran och släpps ut i det extracellulära utrymmet när de multivesicular organen (MVB) säkring med cellmembranet1,2.
EV blir alltmer används som diagnostiska markörer samt som, potentiellt, terapeutiska verktyg inom många områden bland annat onkologi, neurologi, kardiologi och muskuloskeletala sjukdomar3,4,5. En stor majoritet av pågående studier med EV som terapeutiska medel utnyttja isolering av blåsor från cell-villkorade medium (CM) av in vitro-odlade celler. Mesenkymala stamceller (MSC) utöva gynnsamma effekter i flera sammanhang och MSC-derived EV har visat fördelar i modeller av myokardischemi/reperfusion skada6 och hjärnan skada7. MSC-derived EV uppvisar också immun immunmodulerande aktiviteter som kan utnyttjas för att behandla immun avvisande, vilket framgår i en modell av terapi eldfasta graft - versus - host sjukdom8. Fostervatten vätska stamceller (hAFS) aktivt berika CM med MVs och Exo, heterogent fördelat i storlek (50-1000 nm), som medlar flera biologiska effekter, såsom spridning av differentierade celler, angiogenes, hämning av fibros, och hjärtfunktionen4. Vi har nyligen visat att EV, och särskilt Exo, utsöndras av mänskliga hjärt-derived stamceller (Exo-CPC) minska hjärtinfarkt storlek i råttor5,9.
EXO dela en gemensam uppsättning proteiner på ytan, inklusive tetraspanins (CD63, CD81, CD9) och stora histocompatibility komplex klass I (MHC-jag). Förutom denna gemensamma uppsättning av proteiner, Exo även innehåller proteiner som är specifika för den EV delmängden av producenten celltyp. EXO markörer vinner avgörande betydelse eftersom de spelar en avgörande roll i mellan cellulär kommunikation, därmed reglera många biologiska processer5,10. På grund av sin storlek, att hitta ett enkelt sätt att analysera EV använder klassiskt flöde flödescytometri (FC) återstår en utmanande uppgift.
Här presenterar vi ett förenklat protokoll för EV analys med FC, som kan tillämpas på pre berikad produktproverna genom ultracentrifugering eller direkt till CM (figur 1). Metoden använder pärlor belagd med en specifik antikropp som binder kanoniska Exo-associerade ytan epitoper (CD63, CD9, CD81) utan ytterligare tvättar. FC analyser kan utföras med en konventionell cytometer utan behov av justeringar innan mätningar. Metoder för karakterisering av antigener på enskilda små partiklar med flöde cytometers har beskrivits av andra grupper med avseende på olika program11,12,13. Här, använde vi functionalized magnetiska pärlor för fångst av små partiklar och Exo, följt av fenotypning av infångade partiklar av FC. Även om denna metod kan användas för att karaktärisera antigena sammansättningen av små blåsor som släpptes av vilken celltyp som in vitro-, gav här vi viss cell kultur villkor som gäller för kulturen av mänskliga hjärt stamceller (CPC) och mest lämplig miljö för produktion av EV av dessa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. insamling och bearbetning av konditionerat Media
- Coat 55 cm2 petriskålar med 0,02% svin hud gelatin i PBS.
- Skylt CPC (8.000/cm2) i förväg belagda rätter med 7 mL av Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM) kompletteras med 20% FBS (fetalt bovint Serum) och 1% Penicillin/Streptomycin (P/S).
Obs: Begreppet ”CPC” avser mänskliga explant härrör celler som har varit beskrivs på annan plats14. CM kan hämtas från olika celltyper som odlade i specifika odlingsbetingelser. Använd handskar och jobbar enligt en biologisk huva. - När celler nå cirka 80% confluence, ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna två gånger med Dulbecco's PBS (PBS) Ca - och Mg-fri och ersätta det med 10 mL serumfritt Exo-produktion medium (Dulbeccos modifierade örnens Medium [DMEM] hög glukos, 4,5 g/mL).
Obs: Fortsätt med en progressiv minskning av serumkoncentration i odlingsmedium, att gradvis anpassa celler till serumfritt skick (SF). För celler som är känsliga för serumfritt medium förbereda ett medium som innehåller FBS men utarmat av EV. Förbereda medium kompletteras med alla näringsämnen, plus 10 – 20% (v/v) FBS. Centrifugera mediet över natten vid 100.000 × g, 4 ° C. Tänk på att detta förfarande inte garanterar 100% borttagning av FBS-derived EV. - Efter 7 dagar, samla CM i en polypropylen centrifugrör.
Obs: Tiden för medelstora konditionering beror på vilken cell. För celler som är känsliga för serumfritt medium, öka den ursprungliga volymen av medium och minska tiden för CM samling till 24-48 h. - Rensa CM från cellfragment genom att Centrifugera vid 3 000 x g i 20 min i 4 – 10 ° C. Samla in supernatanten i ett 100 kDa filter centrifugrör.
- Koncentrat avmarkerad CM genom att snurra röret vid 2000 x g i 20 min i 4 – 10 ° C.
Obs: Detta steg kommer att minska den ursprungliga volymen av CM tillåter användning av små volymer rören för hög hastighet centrifug steg och bidrar till att eliminera litet protein aggregat. - Samla koncentratet i en mikrocentrifug rör. Centrifugera vid 10 000 x g i 15 min i 4 – 10 ° C.
- Samla in supernatanten och gå vidare till avsnitt 2 (EV anrikning). Om en ultracentrifugen inte finns gå direkt till avsnitt 3 (nanopartiklar spårning analys (NTA) kvantifiering).
Obs: Före berikning av EV bråkdel förbättrar sista avläsning i fluorescensintensiteten (se representativa resultat och figur 4). Rensas CM (från punkt 1.8) kan lagras vid 4 ° C för längre sedan 1-2 dagar eller alternativt vid −80 ° C under flera månader. 5 CM bör vara före rensas bort någon cellulära skräp före lagring vid-80 ° C för att säkerställa att exosome och medelstora skräp inte bildas i processen frysning-tining.
2. extracellulär blåsor anrikning av ultracentrifugen (tillval)
- Placera supernatanten från steg 1,8 på polykarbonat tjock vägg ultracentrifugen tub. Fyll röret med 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) tills den når den maximala kapaciteten (3,2 mL).
- Ladda prover i en Titan fast vinkel rotor (8 x 3,2 mL, k-faktor 13). Ladda rotorn i en bordsskiva ultracentrifugen. Ultracentrifugen vid 100 000 x g i 3 h i 4 – 10 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 µL av 1 x PBS.
3. nanopartiklar spårning analys (NTA) kvantifiering
- Späd 1 µL prov (från antingen steg som 2.3 eller 1,8) i 999 µL 1 x PBS. Lägg provet i en 1 mL spruta, undvika bubbla bildandet. Fyll sprutan i inloppsport undersökning avdelning.
- Slå på lasern. Öppna kameran med knappen Capture . Justera fokus.
- Spela in minst 3 olika ramar i 60 s varje.
- Analysera de 3 olika förvärv med alternativet Batch Process i programvaran.
Obs: Om NTA tekniken inte är tillgänglig, utföra en protein kvantifiering av Bradford analysen (1 x 108 partiklar motsvarar 1 – 2 µg totalt protein efter ultracentrifugering eller 50 – 60 µg totalt protein om kvantifiering utförs direkt för CM som Det innehåller proteiner föroreningar skiljer sig från EV; Se tabell 1)5.
4. provberedning
- Förbereda en pool av 3 typer av fånga pärlor (CD9 pärlor, CD63 pärlor och CD81 pärlor på en 1:1:1 ratio, se Tabell av material) och vortex.
Obs: Poolen har testats för att vara stabil under 1 månad. En enda typ av fånga pärla kan användas, detta gör det möjligt att upptäcka EV delpopulationer inte discriminable med pool av pärlor. Genom att använda enda antigen fånga pärlor, blir det möjligt till modern Visa förekomsten av tetraspanin proteiner, såsom CD9, CD81 eller CD63, och antigen av intresse upptäcks av fluorescerande antikropp. Alternativa aldehyd-sulfat latex pärlor är också kommersiellt tillgängliga. Dessa pärlor presenterar hydrofoba yta för adsorption av MV och EV. - I en rund botten tube, lägga till mängden volym motsvarande vid 1 x 108 partiklar plus 1 µL pärla poolen, motsvarande 1,2 x 105 pärlor i totalt (för varje test).
- Förbereda en tub som innehåller 1 µL pärlor utan EV som ska fungera som negativ kontroll, härmed kallas ”pärlor”.
- Justera volymen till 100 µL med 1 x PBS. Placera röret i en thermo-mixer och skaka på 400 rpm övernattning på 4 – 10 ° C.
- Nästa dag, flytta proven till en rund bottenplattan med 96 brunnar (eller FC rören).
- Lägg till antikroppen (10 µg/mL CD9_FITC, 10 µg/mL CD63_PE och 5 µg/mL CD81_PE).
- Inkubera i 1 h i 4 – 10 ° C.
- Tillsätt 100 µL av 1 x PBS till varje brunn.
- Gå vidare till förvärvet.
5. förvärv
- Öppna programvaran förvärvet och starta upp instrumentet (Cytometer > System Startup Program). Öppna ett nytt experiment.
- Skapa en experimentell mall och sedan markera och sedan Lägga till plåt . Välj position av proverna på plattan och tryck sedan på Ange som provet väl.
- Ange exempel namnet (dvs. CPC #1_CD9FITC) i Reglerna för namngivning. Öppna fliken kanal och växla på FITC och PE-kanaler.
- Ladda plattan i instrumentet.
- Tryck på Dot tomt och skapa en ny dot tomt (P1). Ställ fram Scatter område (FSC-A) kontra Side Scatter-området (SSC-A).
- Markera initiera att starta lasern och flödesteknik. Tryck på Acquire att starta förvärvet.
- Justera skalan för att visa befolkningen mitt i P1. Rita ”pärlor” grinden runt hela befolkningen (exklusive skräp) i P1 (figur 2A). Tryck på Stop.
- Tryck på Dot tomt och skapa en ny dot tomt (P2). Ställ fram Scatter-höjd (FSC-H) kontra FSC-A. Utfärda utegångsförbud för nya dot tomten på ”pärlor”. I P2 rita en ny grind runt den största befolkningen och namnge det ”LINNEN” (figur 2A).
Obs: Denna strategi är utformad för att undvika så mycket som möjligt införande av pärlor aggregat i både förvärv och analys steg. - Tryck på Dot Rita och skapa två olika dot tomter; en FITC kontra SSC-A och en PE kontra SSC-A. Utfärda utegångsförbud för nya dot tomten på ”UNDERTRÖJOR”.
- Välj antalet händelser att spela in (t.ex. 20 000). Välj post och starta experimentet.
6. dataanalys
- Ladda förvärv filer i programvaran analys.
Obs: Följande steg måste tillämpas på varje urval inklusive pärlor endast och varje okänt prov. - Öppna ett nytt protokoll och skapa dot tomter efter samma strategi beskrivs i steg 5.
- Ställ in alla scatter axlar till linjär skala och alla fluorescens axlarna logga skala.
- Visa det fluorescens geometriska medelvärdet (X-Gmean-MFI) i FITC och PE-kanaler.
- Beräkna förhållandet X-Gmenar prover / X-Gmenar av pärlor färgas med antikropp utan exosome.
- Jämför luckan ändra MFI av olika EV förberedelser.
7. extracellulär vesikler nummer titrering
Obs: Avsnitt 7-10 kan utföras för att ställa in antalet partiklar, antikroppar koncentration och specificitet, men kan hoppas över om den celltyp, som EV härleds och antikroppar förblir desamma.
- Späd partiklar, erhålls från steg 2,3, i 1 x PBS att erhålla en rad suspensioner alltifrån 5 x 105 till 2,5 x 108 partiklar.
- För varje suspension lägga till i en rund botten rör 1 µL fånga pärla pool.
- Följa protokollet från steg 4,3.
8. antikroppstitrering
Obs: Titrering av antikroppar är vanligtvis utförs genom att lägga till en enskild antikropp för varje rör.
- Håll antalet EV (total partikel eller proteinhalt) konstant i alla prover.
Obs: Lämpligt antal bestäms empiriskt som beskrivs ovan i avsnitt 7. - Följa protokollet från steg 4.1 till 4,5.
- Testa ett intervall av antikropp koncentrationerna ovan och nedan den summa som rekommenderas av leverantören. En antikropp med en föreslagen koncentration på 10 µg/mL per test, testa exempelvis 1, 2, 5, 10, 20 och 50 µg/mL. Omfatta ett prov med ”endast pärlor”, tillägger den högsta koncentrationen av antikroppar.
- Inkubera i 1 h i 4 – 10 ° C.
- Tillsätt 100 µL av 1 x PBS för varje prov.
- Förvärva proverna.
9. inkubationstid
- Verifiera inkubationstiden utför förvärv vid olika tidpunkter (t.ex. 1 h, 2 h och 5 h).
- Följa protokollet start från avsnitt 4.
- Inkubera prover vid 4 – 10 ° C för 1 h.
- Förvärva prover.
- Inkubera prover vid 4 – 10 ° C för 3 h.
- Förvärva prover.
10. protokoll validering
-
EV bindande
- I en rund botten tube, lägga till mängden volym motsvarar 1 x 108 partiklar eller motsvarande mängd totalprotein.
- Justera volymen till 100 µL med 1 x PBS.
- Störa EV membranet av ultraljudsbehandling (alternativt ett värme chock steg kan tillämpas) enligt tillverkarens anvisningar. Ange frekvens och intensitet. Ultraljudsbehandling perioden kan vara empiriskt etablerade inställning ett tidsförlopp experiment (dvs 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc.).
- Tillsätt 1 µL av pärla poolen.
- Följa protokollet start från steg 4,4.
-
Antikropp specificitet
- Förbered en tub för varje fluorokrom-konjugerad IgG och tillsätt komplex av pärlor-EV som beskrivs i steg 4,6.
Obs: Den fluorokrom-konjugerad isotypen måste matcha med IgG används antikroppens.
- Förbered en tub för varje fluorokrom-konjugerad IgG och tillsätt komplex av pärlor-EV som beskrivs i steg 4,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt antal partiklar för enda färgning
Eftersom en enda pärla kan binda mer än en partikel, testade vi olika villkor för att ställa den minsta mängden totala EV (enda antikropp per rör) för att nå den tidiga exponentiella fasen av MFI kurva. En fast koncentration av antikroppar användes medan det totala antalet partiklar som varierade från 5 x 105 till 2,5 x 108. Som visas i figur 3A, antalet partiklar som tillåter oss att se till att antikroppen utför inom en acceptabel MFI, är undvika användning av ett överskott av EV, 1 x 108 partiklar/färgning.
Titrering av antikroppar
Vi valde den rätt koncentrationen av antikroppar som resulterar i högsta signalen förhindrar ospecifik antikropp bindningen. Detta test har optimerats för 1 x 108 partiklar, som fastställts i den tidigare inställningen. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE och anti-CD81_PE testades med koncentrationer mellan 1 och 50 µg/mL (figur 3B). Anti-CD9_FITC och anti-CD63_PE antikroppar gav en bra upplösning på signal (7,5 och 130-fold förändring av MFI vs. pärlor ensam, respektive) när den används med en koncentration på 10 µg/mL medan den valda koncentrationen för anti-CD81_PE antikroppen var 5 µg/mL (465.3 vik Ändring MFI).
Metod validering
För att bekräfta att vår metod är lämplig att analysera endast ”skålformade” extracellulära blåsor och inte membran skräp, tillämpat vi olika ultraljudsbehandling steg, på 10% av amplitud, att lösningen innehållande partiklar. 100 µL av 1 x PBS lösning innehållande 1 x 108 partiklar genomgick olika ultraljudsbehandling steg från 30 sekunder till 5 minuter och den resulterande preparat innehållande både trasiga och välformade EV analyserades som beskrivs (experimentellt protokoll från punkt 3.3). som ett resultat, Vi hittade att 30 sekunder av ultraljudsbehandling minskar MFI som dumpades helt efter 1 minut. Vid denna tidpunkt är ingen fluorescens upptäckas för någon av de EV markörerna (figur 3D).
Flöde flödescytometri karakterisering av HEK293 - och CPC-härledda exosomes
Dessa resultat har genererats efter det protokoll som presenterats ovan med metoden ultracentrifugen isolering. De isolerade exosomes är kvantifieras av NTA teknik och laddas över natten med 1 µL av blandade pärlor (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). Den komplexa pärlor + Exo var fläckad med rätt mängd antikroppar anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE och anti-CD81_PE (figur 3EF och tabell 2).
Dessutom genom att använda EV-CPC jämförde vi FC analys med eller utan före berikning av ultracentrifugering. Figur 4 visar att båda metoderna är lämpliga att profil Exo yta markörer. Före berikning av extracellulära blåsor bråkdel förbättrar avsevärt fluorescensintensiteten speciellt för CD63_PE och CD81_PE färgning (figur 4 och tabell 3).
Figur 1: protokoll och NTA tomter. (A) Schematisk bild av det experimentella protokollet. (B) representant NTA tomter för luftkonditionerade Media, före ultracentrifugen och efter ultracentrifugen steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: förvärv och dataanalys. (A) flöde flödescytometri analys börjar med att skapa en första grind till hela pärlor befolkningen ”pärlor” (exklusive skräp) och sedan en andra utfärda utegångsförbud för att skilja ”linnen” händelser. Undertröjor är gated på en tomt som inrättas med FSC-H som x-axeln och FSC-A som y-axeln. (B-D) Representativa dot tomter visar höger-Skift av fluorescensintensiteten för de positiva populationerna av pärlor-exosomes komplex (grön, CD9 + röda CD63 +; brun CD81 +). Isotypen kontroll (violett) överlappar negativa grå färgade pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Titrering kurvor för antalet partiklar (pilarna visar valda mängden partiklar, 1 x 108). (A) antikropp koncentrationer (pilarna visar den valda koncentrationen för varje använt antikropp). (B), både antalet partiklar och antikropp koncentration är tomt vs. genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI). (C) kurvan visar 3 olika förvärv av preparatet med 1 – 2 h eller 5 h antikropp inkubation. (D) kurvan visar minskningen av fluorescens efter ultraljudsbehandling vid olika tidpunkter. (E-F) Faldig förändring (medelvärde ± SD) av MFI för CD9, CD63 och CD81 vs negativ kontroll (pärlor + antikroppar, ingen EV) visas för HEK293 EV (n = 3 oberoende replikat) och för CPC EV (n = 3 primära cellinjer från 3 olika patienter) vänligen klicka här för att visa en större version av Denna siffra.
Figur 4: MFI analys och jämförelse mellan två förfaranden: direkt EV-bindande med pärlor (fånga pärlor isolering) och före berikning med ultracentrifugen (ultracentrifugen isolering). Data på kartan-faldig förändring (medelvärde ± SD) av MFI för (A) CD9, (B) CD63 och (C) CD81 vs. negativ kontroll (pärlor + antikroppar, ingen EV). N = 3 primära cellinjer från 3 olika patienter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| CPC | CONC NTA (del/µL) | CONC (µg/µL) |
| CPC #1 före ultracentrifugen | 5.02E + 06 | 2,01 |
| CPC nr 1 efter ultracentrifugen | 6.10E + 07 | 1,04 |
| CPC #2 före ultracentrifugen | 5.74E + 06 | 2,30 |
| CPC #2 efter ultracentrifugen | 7.43E + 07 | 0,79 |
| CPC #3 före ultracentrifugen | 2.02E + 06 | 1,90 |
| CPC nr 3 efter ultracentrifugen | 2.91E + 07 | 0,42 |
Tabell 1: Jämförelse mellan NTA koncentration och proteinkoncentration för 3 olika patienten härstammar CPC före och efter ultracentrifugen.
| -FALDIG FÖRÄNDRING AV MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535,2 ± 410,3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3,72 | 236.05 ± 43,40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1.87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23,18 |
Tabell 2: Värdet av fold change (medelvärde ± SD) av MFI för HEK293 EV (n = 3 oberoende replikat) och CPC EV (n = 3 primära cellinjer från 3 olika patienter).
| -FALDIG FÖRÄNDRING AV MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| Fånga pärlor isolering | 2,96 ± 1,45 | 65.65 ± 18,87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultracentrifugen isolering | 7,47 ± 2,71 | 236.00 ± 25,06 | 65,05 ± 13,38 |
Tabell 3: Värdet av faldig förändring av MFI (medelvärde ± SD) för CPC EV (n = 3 primära cellinjer från 3 olika patienter) isoleras genom fånga pärlor eller ultracentrifugen.
Tabell 4: Enda produktspecifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionella FC teknik är fortfarande den mest okomplicerade analytiska metoden att karakterisera markörer som uttrycks på ytan av EV. I detta sammanhang är välja lämpligaste protokollet avgörande för att få användbar information på enskild partikel fraktioner av intresse genom att undvika begränsningar på grund av instrumentet känslighet. Vi beskrivs en metod med magnetiska partiklar tillsammans med antikroppar som känner igen Exo och små EV ytantigenerna som lämpar sig för efterföljande FC ansökan. Vi validerat metoden med hjälp av två olika celltyper: primära mänskliga CPC som växer fram som en större cell källa för Exo-baserade behandlingsmetoder för hjärtsjukdom; och HEK293 celler, en förevigade cellinje som ofta används i cellbiologiska forskningen på grund av tillförlitliga celltillväxt och plasticitet.
Metoden kan tillämpas på ultracentrifugen-berikad EV och för snabbare analys, även direkt på in vitro-cell-derived CM med ingen före berikning av ultracentrifugering. Utgångsmaterialet är kritisk när man jämför prover. Lägga till fånga pärlor direkt till CM snabbar upp proceduren, men samtidigt minska fluorescensintensiteten, som visas i figur 4A. Det är också viktigt att använda en lämplig mängd PBS för att blanda pärlor och EV under steget ”fånga” 4.4. När du använder en konstant inkubationstiden, minskar en ökad volym fluorescensintensiteten på grund av otillräcklig EV koppling.
En begränsning i protokollet är att en enda capture pärla kan binda flera EV/Exo partiklar på dess yta. Detta kommer att begränsa möjligheten att identifiera grupper av EV uttrycker säregen kombination av antigener använder en flera färgning. Bead-baserade metoden ger därför delvis kvantitativa data. Med hjälp av pärlor som transporterar en enda fånga Ab (CD9, CD63 eller CD81) kan högst karakterisering av partiklar som uttrycker två epitoper: en närvarande på kornet och erkänts av erövrare antikroppen och den upptäcks av antikroppen som är senare läggs.
Den nuvarande guldmyntfoten för Exo analyser med hjälp av FC är ett protokoll som utvecklats av van der Vlist et al. 201215. Det möjliggör en högupplöst analys av EV med en optimerad konfiguration av de kommersiellt tillgängliga high-end FC (t.ex., BD tillströmning). Detta protokoll är extremt detaljerad och användbar men fortfarande kräver en komplex maskinvara-inställning med specifika FC kalibrering före användning. Tre år senare, Pospichalova et al.16 föreslås ett förenklat protokoll för FC analys av Exo använder en dedikerad cytometer som utvecklats speciellt för analys av små partiklar (e.g., Apogee A50 Micro)17. Med avseende på detta protokoll och andra som har använt särskilda tröskel inställning11, föreslår här vi ett grundläggande protokoll för att utföra små EV fenotypning med magnetiska bindande pärlor som lämpar sig för konventionella FC instrument och inte kräver någon speciell miljö. Olika protokoll har beskrivit pärla-baserade metoder för att karakterisera små EV finns i kroppsvätskor genom FC12. Här visar vi immunocapture av diskreta delpopulationer av blåsor positiva för CD9, CD63 och CD81 som vanligen används som Exo markörer18. Aldehyd-sulfat latex19,20 och polystyren12pärlor förblir giltiga alternativ för bindning av EV närvarande i CM och blodplasma vätska; dock aktivera aldehyd grupper som är utsatta på ytan av polymer partikeln koppling av ospecifika proteiner och andra material latex partiklar, vilket ökar risken för kontaminering av lipoprotein eller apoptotiska kroppar under isolering och identifiering bearbeta21,22.
Pärlor används i protokollet binder endast hela, välformade EV. Vi föreslog att störa EV struktur av ultraljudsbehandling att släcka signalen (avsnitt 4, ”protokoll validering”). Faktiskt en minut av ultraljudsbehandling resulterar i minskad fluorescensintensiteten, vilket visar att en positiv signal inte kan påverkas av membran skräp adsorberat på pärlor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att deklarera.
Acknowledgments
Larsson fick stöd av forskningsanslag av Helmut Horten Stiftung och Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. stöddes av forskningsanslag av schweiziska National Science Foundation, Stiftelsen Cecilia-Augusta, Lugano och SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
