Summary
Протокол описывает используется воспроизводимый метод, предназначенный для использования с supernatants культуры клеток для обнаружения поверхностных epitopes на небольших внеклеточного везикулы (EV). Он использует конкретные иммунопреципитации EV, с использованием бисера в сочетании с антителами, которые признают поверхностный антиген CD9, CD63 и CD81. Этот метод оптимизирован для анализа цитометрии вниз по течению потока.
Abstract
Проточной цитометрии (FC) является методом выбора для полуколичественного определения клетк поверхности антиген маркеров. Недавно этот метод был использован для фенотипического анализа внеклеточного везикулы (EV) включая exosomes (Exo) в периферической крови и других жидкостях организма. Небольшой размер EV мандатов использование специальных инструментов порог обнаружения вокруг 50-100 Нм. Кроме того EV могут быть привязаны к латекса микрошарики, которая может быть обнаружена ФК. Микрошарики, конъюгированных с антителами, которые признают EV-связанные маркеры/Кластер дифференцировки CD63, CD9 и CD81 могут быть использованы для захвата EV. EXO изолированы от см могут быть проанализированы с или без предварительного обогащения ultracentrifugation. Этот подход подходит для анализа EV, с использованием обычных инструментов ФК. Наши результаты показывают линейной корреляции между значениями означают интенсивности флуоресценции (MFI) и концентрации EV. Нарушая EV через sonication резко сократилась МФО, указывающее, что метод не может обнаружить мембраны мусора. Мы приводим точный и надежный метод для анализа поверхностных антигенов EV, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории.
Introduction
Клетки секретируют внеклеточного везикулы (EV) разных размеров, включая микровезикулы (MV) и exosomes (Exo). Последний можно отличить от MV, размер и внутриклеточных отсек происхождения. MV (200 – 1000 Нм в размер), освобождаются от родительской клетки пролить от плазматической мембраны. И наоборот экзо (30 – 150 Нм) происходят из мембран от англ и выпускаются во внеклеточное пространство, когда multivesicular органов (MVB) предохранитель с клеточной мембраны1,2.
EV все чаще используется как диагностические биомаркеров а также, потенциально, терапевтические средства во многих областях, включая онкология, Неврология, кардиология и опорно-двигательного аппарата3,4,5. Подавляющее большинство текущих исследований с использованием EV как терапевтические эксплуатировать изоляции везикулы от клеток кондиционером среднего (см) в пробирке культивируемых клеток. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) оказывают благотворное влияние в нескольких контекстах, и MSC-производные EV показали преимущества в моделях миокарда ишемии/реперфузии травмы6 и мозга травмы7. MSC-производные EV также демонстрируют иммунной модулирующее мероприятий, которые могут быть использованы для лечения иммунной отказа, как показано в модель терапии огнеупорные трансплантат – versus – хост болезни8. Амниотической жидкости стволовых клеток (Хафс) активно обогатить см с MVs и Exo, гетерогенно распределены в размер (50-1000 Нм), который посредником несколько биологических эффектов, таких как распространение дифференцированных клеток, ангиогенез, ингибирование фиброз, и кардиопротекции4. Недавно мы показали, что EV и особенно Exo, выделяется клетками человеческого сердца производные Прародителя (Exo-КПК) уменьшить размер при инфаркте миокарда в крысах5,9.
EXO доля общий набор белков на их поверхности, в том числе tetraspanins (CD63, CD81, CD9) и комплекс гистосовместимости I класса (MHC-I). Помимо этого общий набор белков экзо также содержат белки, специфичных для EV подмножество типа клеток продюсер. EXO маркеры приобретают первостепенное значение, потому что они играют решающую роль в между сотовой связи, регулирования таким образом многие биологические процессы5,10. Из-за их малого размера найти простой способ для анализа EV, с использованием классического потока цитометрии (FC) остается сложной задачей.
Здесь мы представляем упрощенный протокол для анализа EV с помощью FC, который может быть применен в предварительно обогащенного образцы, полученные через ultracentrifugation или непосредственно в см (рис. 1). Данный метод использует бисер покрытием с специфическим антителом, которая связывает канонические Exo связанные поверхности epitopes (CD63, CD9, CD81) без дополнительных моет. Анализ ФК может производиться с использованием обычных цитометр без необходимости для корректировки до измерения. Были описаны методы для характеризации антигенов на отдельных мелких частиц, используя поток цитофлуориметрами другими группами в отношении различных приложений11,,12-13. Здесь мы использовали функционализированных магнитные бусы для захвата мелких частиц и Exo, следуют фенотипирование захваченных частиц, ФК. Хотя этот метод может быть использован для характеристики антигенный состав мелких пузырьков, выпущен в любой тип клеток в пробирке, здесь мы предоставили конкретную ячейку культуры условия, которые применяются к культуре человеческого сердца прогениторных клеток (КПК) и наиболее соответствующие условия для производства EV этими клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. сбор и обработка кондиционером средств массовой информации
- Герб 55 см2 Петри с желатином свинину кожу 0,02% в PBS.
- Пластина КПК (8000/см2) в предварительно покрытых блюда с 7 мл Iscove изменение Дульбекко среднего (IMDM), дополнены 20% FBS (плода бычьим сывороточным) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
Примечание: Термин «КПК» относится к клеток человека экспланта производные, которые были описаны в другом месте14. СМ могут быть собраны из различных типов клеток культивировали в условиях конкретной культуры. Надевайте перчатки и работать под биологическим Худ. - После того, как клетки достичь о 80% слияния, удалите питательной среды, вымыть клетки, дважды с Дульбекко в PBS (PBS) Ca и Mg свободной и заменить его с 10 мл сыворотки бесплатно Exo производство средних (Дульбекко изменение орла средних [DMEM] высокая глюкозы, 4,5 г/мл).
Примечание: Продолжите постепенное уменьшение концентрации сыворотки в культурной среде, постепенно адаптировать клеток в сыворотке бесплатно состояние (SF). Для клеток, которые чувствительны к сыворотки бесплатно средний подготовить средства содержащие FBS, но обедненного EV. Подготовка среднего дополнены всеми питательными веществами, плюс 10%-20% (v/v) FBS. Центрифуга для среднего ночь на 100 000 × g, 4 ° C. Имейте в виду, что эта процедура не гарантирует 100% удаление FBS-производные EV. - После 7 дней собирают в полипропиленовые пробирок см.
Примечание: Время для средних кондиционирования зависит от типа ячейки. Для клеток, которые чувствительны к сыворотки свободной среде увеличить начальный объем среднего и сократить время сбора см до 24-48 ч. - Очистить см от клеток мусора, центрифуги на 3000 x g 20 мин на 4-10 ° C. Соберите супернатант в трубу фильтр центрифуги 100 кДа.
- Концентрат очистили см, крутя трубки на 2000 x g 20 мин на 4-10 ° C.
Примечание: Этот шаг позволит сократить первоначальный объем см, позволяя использование труб малого объема для высокой скорости центрифуги шагов и будет способствовать ликвидации небольшой белок агрегатов. - Соберите концентрата в пробки microcentrifuge. Центрифуга на 10000 x g 15 мин на 4-10 ° C.
- Собирать супернатант и переходите к разделу 2 (EV обогащения). Если ультрацентрифуга не доступен сразу перейти к разделу 3 (анализ отслеживания наночастиц (НТА) квантификацией).
Примечание: Предварительное обогащение EV фракции улучшает окончательный считывания в интенсивности флуоресценции (см. Представитель результаты и рис. 4). Очищенное см (от точки 1.8) могут храниться при температуре 4 ° C для больше чем 1-2 дней или же в −80 ° C в течение нескольких месяцев. 5 см должен быть предварительно отобранных, чтобы удалить любой сотовой мусора до хранения при температуре-80 ° C, с тем чтобы обеспечить, что exosome размера мусора не образуется в процессе замораживания оттаивания.
2. внеклеточного везикулы обогащение ультрацентрифуга (опционально)
- Место супернатант из шага 1.8 в трубке ультрацентрифуга поликарбоната толщиной стены. Заполните трубу с 1 x фосфатный буфер (PBS), до тех пор, пока он достигает максимальной емкости (3,2 мл).
- Загрузить образцы в ротор-угол титана (8 x 3.2 мл, k фактор 13). Загрузите ротора в настольная ультрацентрифуга. Ультрацентрифуги на 100,000 x г за 3 ч в 4 – 10 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл ПБС.
3. наночастицы отслеживания количественной оценки анализ (НТА)
- Разбавьте 1 мкл пример (от любой шаг 2.3 или 1.8) в 999 мкл ПБС. Загрузите образец в 1 мл шприц, избегая формирования пузыря. Загрузите шприца в впускное отверстие камеры экспертизы.
- Включите лазер. Откройте камеру с кнопкой захвата . Отрегулируйте фокус.
- Записи по крайней мере 3 различных кадров 60 s каждый.
- Анализ 3 различных приобретений, с помощью параметра Пакетной обработки в программном обеспечении.
Примечание: Если технология ЗЗТ не доступен, выполнить количественную оценку белка, assay Брадфорд (1 x 108 частиц соответствуют 1-2 мкг общего белка после ultracentrifugation или 50-60 мкг общего белка если количественная оценка производится непосредственно для см Она включает в себя белки загрязнители отличается от EV; 5см. таблицу 1).
4. Пробоподготовка
- Подготовить пул 3 виды бисера захвата (CD9 бусины, бисер CD63 и CD81 бисер 1: соотношение 1:1; см. Таблицу материалы) и вихрь.
Примечание: Бассейн был протестирован быть стабильным за 1 месяц. Может использоваться только один тип захвата шарика, это позволит обнаружения EV подгрупп населения не discriminable с бассейном с бусин. Используя один антиген, захватив бусы, он будет возможность современного продемонстрировать наличие tetraspanin белков, таких как CD9, CD81 или CD63, и антиген интереса обнаружен флуоресцентные антитела. Также коммерчески доступны альтернативные альдегид сульфат латексные шарики. Эти шарики представляют гидрофобной поверхности для адсорбции MV и EV. - В нижней круглой трубе Добавьте количество тома, соответствующий 1 x 108 частицы плюс 1 мкл шарик бассейн, соответствующий 1.2 x 105 бусин в общей сложности (для каждого испытания).
- Подготовьте трубка, содержащая 1 мкл бисера без EV, который будет служить в качестве отрицательного контроля, настоящим называют «Бисер».
- Отрегулируйте громкость до 100 мкл с ПБС. Трубка в термо микшер и погрозит 400 об/мин на ночь при 4 – 10 ° C.
- Следующий день, переместите образцы раунд 96-луночных днище (или трубки FC).
- Добавьте антитела (10 мкг/мл CD9_FITC, 10 мкг/мл CD63_PE и 5 мкг/мл CD81_PE).
- Инкубировать 1 час при температуре 4-10 ° C.
- Добавьте 100 мкл ПБС в каждой скважине.
- Перейти к приобретению.
5. приобретение
- Откройте приобретение программного обеспечения и запуска инструмента (цитометр > системы запуска программы). Откройте новый эксперимент.
- Создание экспериментальной шаблона, а затем выбрать и затем Добавить крышку . Выберите положение образцов на плите, а затем нажмите Задать как образец хорошо.
- Введите имя образца (т.е. КПК #1_CD9FITC) в Правила именования. Откройте вкладку канал и переключаться на FITC и PE каналы.
- Загрузите пластины в инструмент.
- Нажмите Точку участка и создайте новый участок точка (P1). Установка вперед разброс области (FSC-A) против Scatter Сиде (SSC-A).
- Выберите инициализировать начать лазер и fluidics. Нажмите получить начать приобретение.
- Настройте масштаб для отображения численности населения в середине P1. В P1 привлечь «Бисер» ворота вокруг всего населения (за исключением мусора) (рис. 2A). Нажмите стоп.
- Нажмите Точку участка и создайте новый участок точка (P2). Установите вперед высоты точечная (FSC-H) по сравнению с FSC-A. Ворота нового участка точка на «Бисер». В P2 привлечь новые ворота вокруг больше населения и назовите его «МАЙКИ» (рис. 2A).
Примечание: Эта стратегия разработана для того, чтобы избежать как много как возможно включение бусины агрегатов в приобретение и анализ шагов. - Нажмите Точку участка и создать два различных точка участков; один из FITC по сравнению SSC-A и одного PE по сравнению SSC-A. Ворота нового участка точка на «ФУФАЙКИ.»
- Выберите количество событий для записи (например, 20 000). Выберите запись и начать эксперимент.
6. анализ данных
- Загрузите файлы приобретение в программное обеспечение для анализа.
Примечание: Следующие шаги должны быть применены для каждого образца, включая бусы только и каждый неизвестный образец. - Откройте новый протокол и создайте точка участки после той же стратегии, описанной в шаге 5.
- Набор всех осей флуоресценции для входа масштаба и всех осей точечной линейной шкалы.
- Показать флуоресценции геометрическое (X-Gmean-МРИ) в каналах FITC и PE.
- Вычислить коэффициент X-Gозначает образцов / X-Gозначает бусы из окрашенных с антителом без exosome.
- Сравнение изменения раз МФО различных препаратов EV.
7. внеклеточного везикул номер титрования
Примечание: Разделы 7-10 могут быть выполнены, чтобы настроить количество частиц, концентрация антител и специфичности, но может быть пропущен, если тип ячейки, из которой являются производными EV, и антитела остаются теми же.
- Разбавьте частицы, полученные на шаге 2.3, в PBS 1 x для получения серии от 5 x 105 до 2,5 x 108 частиц суспензии.
- Для каждого подвеска мкл в нижней круглой трубе 1 захвата шарик бассейн.
- Следуйте протокол от шаг 4.3.
8. антитела титрования
Примечание: Антитела титрования обычно выполняется путем добавления одного антитела для каждой трубы.
- Держите количество EV (всего частиц или содержание белка) постоянной во всех образцах.
Примечание: Соответствующий номер определяется эмпирически, как описано выше в разделе 7. - Следуйте протокол от шагов 4.1-4.5.
- Испытаний в диапазоне концентраций антитела выше и ниже суммы, рекомендованный поставщик. Например для антитела с предлагаемые концентрации 10 мкг/мл на тест, тест 1, 2, 5, 10, 20 и 50 мкг/мл. Включения образец бисером «только», самая высокая концентрация антител.
- Инкубировать 1 час при температуре 4-10 ° C.
- 100 мкл ПБС для каждого образца.
- Приобрести образцы.
9. инкубации время
- Проверьте время инкубации, выполняя приобретений в разное время точках (например, 1 час, 2 h и 5 ч).
- Следуйте протокола, начиная с раздела 4.
- Проинкубируйте образцы в 4 – 10 ° C на 1 ч.
- Приобрести образцы.
- Проинкубируйте образцы в 4 – 10 ° C 3 h.
- Приобрести образцы.
10. протокол проверки
-
EV привязки
- В нижней круглой трубе Добавьте количество тома, соответствующее 1 x 10-8 частиц или соответствующее количество общего белка.
- Отрегулируйте громкость до 100 мкл с ПБС.
- Нарушить EV мембраны, sonication (в качестве альтернативы могут применяться теплового шока шаг) согласно инструкциям производителя. Установить частоту и интенсивность. В sonication период может быть эмпирически установлено настройки эксперимента курс (то есть, 0 s, 30 s, 1 мин, 5 мин и т.д.).
- 1 мкл Бассеин шарика.
- Следуйте протокола, начиная с шага 4.4.
-
Специфичность антител
- Подготовка одной трубы для каждого конъюгированных флюрохром IgG и добавьте комплекс бусы EV, как описано в шаге 4.6.
Примечание: Isotype конъюгированных флюрохром должны совпадать с IgG антитела используются.
- Подготовка одной трубы для каждого конъюгированных флюрохром IgG и добавьте комплекс бусы EV, как описано в шаге 4.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общее количество частиц для одного окрашивания
Поскольку один шарик можно связать более чем одной частицы, мы испытывали различные условия для задания наименьшее количество всего EV (одного антитела в трубку) достичь на ранней стадии экспоненциальной кривой МФО. Фиксированной концентрации антител была использована во время общее количество частиц, варьировались от 5 x 105 до 2,5 x 108. Как показано на рисунке 3A, количество частиц, что позволяет нам гарантировать, что антитела выполняет в рамках приемлемого МФО, избегая использования избытка EV, является 1 x 10-8 частиц/окрашивания.
Антитела титрования
Мы выбрали надлежащей концентрации антител, что приводит к высоким сигнал предупреждения неспецифических антитела связывая. Этот тест был оптимизирован для частиц 1 x 10-8 , как определено в предыдущем параметре. Анти-CD9_FITC, анти CD63_PE и анти CD81_PE были протестированы в концентрациях от 1 до 50 мкг/мл (рис. 3B). Анти-CD9_FITC и анти CD63_PE антитела дал хорошее разрешение сигнала (7,5 и грамотным изменения МФО против бусины самостоятельно, соответственно) при использовании в концентрации 10 мкг/мл при выбранной концентрации антитела анти CD81_PE было 5 мкг/мл (465.3 складка Изменение MFI).
Метод проверки
Для того, чтобы подтвердить, что наш метод подходит для анализа только «cup-shaped» внеклеточной пузырьки и не мембраны мусора, мы применили различные sonication шаги, на 10% от амплитуды, для раствора, содержащего частицы. 100 мкл 1 x PBS раствора, содержащего 1 x 108 частицы прошли различные sonication шагах от 30 секунд до 5 минут и полученный препарат, содержащий сломанной и стройные EV были проанализированы как описано (экспериментальный протокол с точки 3.3). В результате, мы обнаружили, что 30 секунд sonication уменьшить МФО, которая полностью бросили через 1 минуту. На этом timepoint не флуоресценции обнаруживаемыми для любой из маркеров EV (рис. 3D).
Характеристика потока цитометрии производных HEK293 и КПК exosomes
Эти результаты были получены после протокола, представленные выше с помощью метода ультрацентрифуга изоляции. Изолированные exosomes количественно НТА технологии и загружены на ночь 1 мкл смешанных бусины (1 x анти-CD9:1 x анти-CD63:1 x анти CD81). Комплекс бусы + Exo окрашивали правильное количество антител анти CD9_FITC, анти CD63_PE и анти CD81_PE (Рисунок 3EF и Таблица 2).
Кроме того с помощью EV-КПК мы сравнили ФК анализ с или без предварительного обогащения в ultracentrifugation. На рисунке 4 показано, что оба метода подходят для профилей Exo поверхностных маркеров. Предварительное обогащение внеклеточного везикулы фракции значительно улучшает интенсивность флуоресценции специально для CD63_PE и CD81_PE окрашивание (рис. 4 и Таблица 3).
Рисунок 1: протокол и NTA участков. (A) схематическое представление экспериментальный протокол. (B) представитель NTA участков для СМИ, кондиционерами, предварительно ультрацентрифугирования и после ультрацентрифуга шаг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: получение и анализ данных. (A) потока cytometry анализ начинается с создания первых ворот в целом бусины населения «бисер» (за исключением мусора) и затем второй ворота различать события «майки». Фуфайки являются воротами на участке создан с FSC-H как оси x и FSC-A как ось y. (B-D) Представитель точка участки показаны сдвига вправо интенсивности флуоресценции для положительных населения бусы exosomes комплексов (зеленый, CD9 + красный CD63 +; коричневый CD81 +). Isotype управления (фиолетовый) перекрываются негативные серого цветные бусины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Кривых титрования для числа частиц (стрелки показывают выбранного количества частиц, 1 x 10-8). (A) концентрации антитела (стрелки показывают выбранного концентрации для каждого антитела). (B) как количество частиц и антитела концентрации являются заговор против средней флуоресценции интенсивности (МРИ). (C) кривая показаны 3 различных приобретение подготовки с 1 – 2 ч или 5 h Антитело инкубации. (D) кривая показаны снижение флуоресценции после sonication в разные моменты времени. (E-F) Сбросить изменения (среднее ± SD) МФО для CD9, CD63 и CD81 против отрицательного контроля (бусы + антител, не EV) отображаются для HEK293 EV (n = 3 независимых реплицирует) и для КПК EV (n = 3 главной ячейки линии из 3 разных пациентов) пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию Эта цифра.
Рисунок 4: МРИ анализ и сравнение между двумя процедурами: прямая EV-привязки с бисером (захват бусины изоляции) и предварительного обогащения с ультрацентрифуга (ультрацентрифуга изоляции). Данные отображаются как раз изменения (среднее ± SD) МФО CD9 (A), (B) CD63 и CD81 (C) против отрицательного контроля (бусы + антител, не EV). N = 3 главной ячейки линии из 3 разных пациентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| КПК | CONC NTA (часть/мкл) | CONC (мкг/мкл) |
| КПК #1 предварительно ультрацентрифуга | 5.02E + 06 | 2.01 |
| КПК #1 пост ультрацентрифуга | 6.10E + 07 | 1.04 |
| #2 КОП Предварительная ультрацентрифуга | 5.74E + 06 | 2.30 |
| #2 КОП после ультрацентрифуга | 7.43E + 07 | 0,79 |
| КПК #3 предварительно ультрацентрифуга | 2.02E + 06 | 1.90 |
| КПК #3 после ультрацентрифуга | 2.91E + 07 | 0.42 |
Таблица 1: Сравнение между НТА концентрации и концентрацию белка для 3 различных пациента производные КПК до и после ультрацентрифугирования.
| СБРОСИТЬ ИЗМЕНЕНИЯ МФО ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344,9 | 535.2 ± 410.3 |
| КПК #1 | 14.15 ± 3.72 | 236.05 ± 43,40 | 353.30 ± 452.43 |
| КПК #2 | 15.76 ± 1,87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| КПК #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23.18 |
Таблица 2: Значение изменения (среднее ± SD) фолд ФГИ для HEK293 EV (n = 3 независимых реплицирует) и КПК EV (n = 3 главной ячейки линии из 3 разных пациентов).
| СБРОСИТЬ ИЗМЕНЕНИЯ МФО ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| Захват бусины изоляции | 2.96 ± 1.45 | 65,65 ± тарифу 18,87 ограничением | 21.85 ± 6.12 |
| Ультрацентрифуги изоляции | 7.47 ± 2.71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13,38 |
Таблица 3: Значение сгиба изменения МФО (среднее ± SD) для КПК EV (n = 3 главной ячейки линии из 3 разных пациентов) изолированные захвата бусы или ультрацентрифугирования.
Таблица 4: Единый продукт спецификация.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционная методика ФК остается наиболее простой аналитический метод характеризовать маркеры, выраженные на поверхность EV. В этой связи выбор наиболее подходящего протокола важно получить полезную информацию об индивидуальных частиц фракций интереса, избегая ограничения из-за чувствительности инструмента. Мы описал метод, с помощью магнитных частиц в сочетании с антителами, которые признают Exo и малых EV поверхностных антигенов, которые подходят для вниз по течению ФК приложения. Мы проверить метод, с помощью двух различных типов клеток: первичного человека КПК, которые появляются как источник основных клеток для терапевтических подходов, основанных на Exo, болезни сердца; и HEK293 клетки, увековечен клеточная линия, широко используется в исследования биологии клетки из-за надежный клеточный рост и пластичности.
Метод может быть применен к ультрацентрифуга обогащенный EV и быстрее анализа, также непосредственно на в пробирке клеток, полученных см с без предварительного обогащения в ultracentrifugation. Исходный материал имеет решающее значение при сравнении выборок. Добавление захвата бусины непосредственно к см позволит ускорить процедуру, но в то же время уменьшение интенсивности флуоресценции, как показано на рисунке 4A. Важно также, чтобы использовать соответствующее количество PBS смешивать бусины и EV «захвата» шаге 4.4. При использовании время постоянный инкубации, увеличение объема будет уменьшаться интенсивность флуоресценции вследствие неэффективного EV муфты.
Ограничение протокола является, что захват один шарик можно привязать несколько EV/Exo частиц на его поверхности. Это будет ограничивать возможность определения подмножества EV, выражая своеобразное сочетание антигены, используя несколько пятнать. Метод, основанный на шарик поэтому урожайность полу количественных данных. Использование бисера, перевозящих один захвата Ab (CD9, CD63 или CD81) позволит максимально характеристику частиц, которые выражают две эпитопов: одна на шарик и признанные захвата антитела и обнаружены антитела, впоследствии добавлены.
Текущий золотой стандарт для Exo анализа с использованием ФК — это протокол, разработанный, Ван дер Влист et al. в 201215. Это позволяет для высокого анализа EV, используя оптимизированные конфигурации коммерчески доступных high-end ФК (например, BD приток). Этот протокол является чрезвычайно подробные и полезные, но все еще нуждается сложные аппаратные настройки с конкретными ФК калибровку перед использованием. Три года спустя, Pospichalova et al.16 предложил упрощенный протокол для анализа ФК Exo, используя выделенный цитометр, специально разработанный для анализа мелких частиц (например, апогей С50 микро)17. Что касается этот протокол и другие, которые использовали специальный порог параметр11здесь мы предлагаем основной протокол для выполнения небольших фенотипирование EV с использованием магнитных привязки бусы, подходит для обычных инструментов ФК и не требует никаких Специальная настройка. Различные протоколы описали методы, основанные на шарик, характеризовать малых EV, найти в жидкостях, ФК12. Здесь мы покажем immunocapture дискретных подгрупп населения везикулы позитивные CD9, CD63 и CD81, которые часто используются как Exo маркеры18. Латекс19,альдегид сульфат20 и полистирола12бусины остаются действенными альтернативами для привязки EV в см и плазмы крови жидкость; Однако альдегидными группами, выставленные на поверхности частиц полимера включить муфта неспецифических белков и другие материалы для латексные частицы, тем самым увеличивая риск загрязнения липопротеинов или apoptotic органами во время обнаружения и изоляции процесс21,22.
Бусы, используемые в протоколе привязки только целиком, стройные EV. Мы предложили нарушить структуру EV, sonication чтобы утолить сигнал (раздел 4, «протокол проверки»). Действительно в одну минуту sonication результатов в уменьшилось флуоресценции интенсивность, тем самым показывая, что позитивный сигнал не может быть затронуты мембраны мусора, адсорбированные на бусины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Объявлять нечего.
Acknowledgments
Л.б. была поддержана исследовательских грантов Helmut Horten Stiftung и Velux Stiftung, Цюрих (Швейцария). Г.в. был поддержан исследовательские гранты швейцарского национального научного фонда, Фонда Сесилия-Аугуста, Лугано и SHK Stiftung für Герц und Kreislaufkrankheiten (Швейцария)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
