Summary
O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.
Abstract
Citometria de fluxo (FC) é o método de escolha para medição semi quantitativa de marcadores de antígeno de superfície da célula. Recentemente, esta técnica tem sido usada para análise fenotípica das vesículas extracelulares (EV), incluindo exosomes (Exo) no sangue periférico e outros fluidos corporais. O pequeno tamanho da EV exige o uso de instrumentos dedicados, tendo um limite de deteção em torno de 50-100 nm. Alternativamente, o EV pode ser vinculado a microbeads látex que pode ser detectado pelo FC. Microbeads, conjugados com anticorpos que reconhecem EV-associado marcadores/Cluster de diferenciação CD63 CD9 e CD81 pode ser usado para captura de EV. EXO isolada de CM pode ser analisado com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Esta abordagem é adequada para análises de EV usando instrumentos convencionais de FC. Nossos resultados demonstram uma correlação linear entre os valores de intensidade de fluorescência dizer (IFM) e concentração de EV. Perturbar o EV através de sonication drasticamente diminuída IFM, indicando que o método não detecta os restos de membrana. Nós relatamos um exato e confiável método para a análise de antígenos de superfície EV, que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório.
Introduction
As células secretam vesículas extracelulares (EV) de tamanhos diferentes, incluindo aumentada (MV) e exosomes (Exo). Este último pode ser distinguido MV por ambos o tamanho e o compartimento subcelular de origem. MV (200 – 1.000 nm de tamanho) são liberados de células pai derramando da membrana plasmática. Por outro lado, Exo (30-150 nm) originam CDDP membranas e são liberados no espaço extracelular, quando os corpos multivesiculares (MVB) se fundem com a membrana celular1,2.
EV são cada vez mais utilizados como biomarcadores de diagnósticos, bem como, potencialmente, ferramentas terapêuticas em muitos campos, incluindo oncologia, Neurologia, Cardiologia e doenças músculo-esqueléticas3,4,5. A grande maioria dos estudos em andamento usando EV como agentes terapêuticos exploram o isolamento das vesículas da célula-condicionado médio (CM) de células cultivadas in vitro. Células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem efeitos benéficos em diversos contextos, e MSC-derivado EV demonstraram benefícios em modelos de isquemia/reperfusão do miocárdio lesão6 e cérebro lesão7. MSC-derivado EV também apresentam atividades moduladora imunológica que podem ser exploradas para tratar a rejeição imune, como demonstrado em um modelo de terapia refractários doença enxerto - versus - host8. Células tronco de líquido amniótico (hAFS) ativamente enriquecer CM com MVs e Exo, heterogénea em tamanho (50 – 1.000 nm), que mediam vários efeitos biológicos, tais como a proliferação de células diferenciadas, angiogênese, inibição da fibrose, e Cardioprotection4. Recentemente mostramos que EV e particularmente Exo, secretado pelas células progenitoras cardíacas-derivado humano (Exo-CPC) reduzem o tamanho do infarto do miocárdio em ratos5,9.
EXO compartilhar um conjunto comum de proteínas em sua superfície, incluindo tetraspanins (CD9 CD63, CD81,) e o complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC-eu). Além desse conjunto comum de proteínas, Exo também contêm proteínas específicas para o subconjunto de EV, o tipo de células do produtor. EXO marcadores estão ganhando maior importância porque eles desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, regulando, assim, muitos processos biológicos5,10. Por causa de seu tamanho pequeno, de encontrar uma maneira fácil de analisar EV usando clássica fluxo cytometry (FC) permanece uma tarefa desafiadora.
Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para análise de EV usando FC, que pode ser aplicado em pré-enriquecidas amostras obtidas através de ultracentrifugação ou diretamente em CM (Figura 1). O método usa pérolas revestidas com anticorpo específico que se liga canônicos epitopos superfície Exo-associados (CD63, CD9, CD81) sem lavagens adicionais. Análises FC podem ser realizadas usando um citômetro convencional sem necessidade de ajustes antes da medição. Métodos para a caracterização dos antígenos em partículas pequenas individuais usando citômetros têm sido descritos por outros grupos no que diz respeito a várias aplicações11,12,13. Aqui, usamos funcionalizados grânulos magnéticos para a captura de partículas pequenas e Exo, seguido por fenotipagem de partículas capturadas pelo FC. Embora esse método pode ser usado para caracterizar a composição antigênica de pequenas vesículas lançado por qualquer tipo de células in vitro, aqui nós fornecemos condições de cultura de células específicas que se aplicam para a cultura de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) e a maioria ambiente adequado para a produção de EV por essas células.
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Protocol
1. coleta e processamento de mídia condicionado
- Casaco 55 cm2 placas de Petri com gelatina de pele suína 0,02% em PBS.
- Placa CPC (8.000/cm2) em pratos revestidos com 7 mL de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) suplementado com 20% FBS (soro Fetal bovino) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
Nota: O termo "CPC" refere-se a células do explante humana derivada que têm sido descritos em outros lugares14. CM pode ser coletada de diferentes tipos de células cultivados em condições de cultura específica. Usar luvas e sob uma capa biológica. - Uma vez que as células alcançar sobre 80% confluência, remover o meio de cultura, lave duas vezes com a Dulbecco PBS (PBS) Ca e Mg-livre de células e substituí-lo com 10 mL de meio de Exo-produção livre de soro (modificado águia de Dulbecco médio [DMEM] alta glicose, 4,5 g/mL).
Nota: Prosseguir com uma progressiva diminuição da concentração de soro em meio de cultura, adaptar-se gradualmente as células a condição livre de soro (SF). Para as células que são sensíveis ao meio livre de soro prepare um suporte contendo FBS mas empobrecido de EV. Prepare suplementado com todos os nutrientes, além de 10 – 20% (v/v) FBS. Centrifugue o meio durante a noite a 100.000 × g, 4 ° C. Esteja ciente de que este procedimento não garante 100% de remoção de EV FBS-derivado. - Após 7 dias, recolha a CM em um tubos de centrífuga de polipropileno.
Nota: O tempo para o condicionamento médio depende do tipo de célula. Para as células que são sensíveis ao meio livre de soro, aumentar o volume inicial de meio e diminuir o tempo para coleta CM de 24-48 h. - Clear CM de detritos de células por centrifugação a 3.000 x g por 20 min 4 e 10 ° c. Recolha o sobrenadante em um tubo de filtro de centrifugação kDa 100.
- Concentre-se desmarcada CM, girando o tubo a 2.000 x g por 20 min 4 e 10 ° c.
Nota: Esta etapa irá reduzir o volume inicial do CM, permitindo a utilização de tubos de pequeno volume para etapas de centrifugação de alta velocidade e contribuirá para eliminar os agregados de pequenas proteínas. - Recolha o concentrado em um tubo de microcentrifugadora. Centrifugar a 10.000 x g por 15 min 4 e 10 ° c.
- Recolher o sobrenadante e prossiga para a seção 2 (enriquecimento EV). Se não houver um se passar directamente à secção 3 (quantificação de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)).
Nota: Pré-enriquecimento da fração EV melhora a leitura final da intensidade de fluorescência (ver resultados representativos e Figura 4). Apuradas CM (do ponto 1.8) pode ser armazenada a 4 ° C para não mais então 1-2 dias ou, alternativamente, −80 ° C durante vários meses. 5 CM deve ser previamente limpo para remover quaisquer restos celulares antes do armazenamento a-80 ° C para assegurar que os restos exossomo de tamanho não é formado no processo de congelamento e descongelamento.
2. extracelular vesículas enriquecimento por se (opcional)
- O sobrenadante do passo 1.8 num tubo policarbonato espessura parede se de lugar. Encha o tubo com solução salina tampão de fosfato (PBS) de 1x até atingir a capacidade máxima (3,2 mL).
- Carregar amostras em um rotor de ângulo fixo de titânio (8 x 3,2 mL, fator k-13). Carrega o rotor em uma mesa se. Se a 100.000 x g durante 3 h 4 e 10 ° c.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 100 µ l de 1X PBS.
3. nanopartículas rastreamento quantificação de análise (NTA)
- Dilua 1 µ l de amostra (a partir de qualquer etapa 2.3 ou 1.8) em 999 µ l de PBS 1x. Carrega a amostra em uma seringa de 1 mL, evitando a formação de bolhas. Carrega a seringa na porta de entrada da câmara do exame.
- Ligue o laser. Abra a câmera com o botão de captura . Ajuste o foco.
- Gravar pelo menos 3 diferentes quadros de 60 s cada.
- Analise as 3 aquisições diferentes usando a opção de Processamento em lote no software.
Nota: Se a tecnologia NAT não estiver disponível, execute uma quantificação da proteína pelo ensaio de Bradford (1 x 108 partículas correspondem a 1-2 µ g da proteína total após ultracentrifugação ou a 50 – 60 µ g proteína total se quantificação é realizada diretamente para CM como Ele inclui os contaminantes de proteínas diferentes de EV; consulte a tabela 1)5.
4. preparação da amostra
- Preparar um pool dos 3 tipos de grânulos de captura (CD9 grânulos, grânulos CD63 e CD81 grânulos em um 1: proporção 1:1; Ver Tabela de materiais) e vortex.
Nota: A piscina foi testada para ser estável por 1 mês. Pode ser utilizado um único tipo de captura do grânulo, isto irá permitir a detecção de sub-populações EV não discriminable com piscina de grânulos. Usando o único antígeno capturando grânulos, será possível ao comtemporâneo demonstrar a presença de proteínas tetraspaninas, como CD9, CD81 ou CD63, e o antígeno de interesse detectado pelo anticorpo fluorescente. Grânulos de látex alternativa aldeído-sulfato também estão disponíveis comercialmente. Estes grânulos apresentam superfície hidrofóbica para a adsorção de MV e EV. - Em um tubo de fundo redondo, adicione a quantidade de volume correspondente a 1 x 108 partículas mais 1 µ l da piscina do grânulo, correspondente a 1,2 x 105 grânulos no total (para cada teste).
- Prepare um tubo contendo 1 µ l de grânulos sem EV que servirá como controle negativo, por este meio se refere como "Beads".
- Ajuste o volume a 100 µ l com 1X PBS. Colocar o tubo em um thermo-misturador e agitar a 400 rpm durante a noite a 4 – 10 ° C.
- No dia seguinte, mova as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo (ou tubos FC).
- Adicione o anticorpo (10 µ g/mL de CD9_FITC, 10 µ g/mL de CD63_PE e 5 µ g/mL de CD81_PE).
- Incubar a 1h 4 e 10 ° c.
- Adicione 100 µ l de 1X PBS a cada poço.
- Proceda à aquisição.
5. aquisição
- Abra o software de aquisição e start-up do instrumento (citômetro > programa de inicialização de sistema). Abra uma nova experiência.
- Criar um modelo experimental, em seguida, selecione a placa e, em seguida, Adicionar a placa. Selecione a posição das amostras na placa e pressione Definir como amostra bem.
- Digite o nome de amostra (ou seja, o CPC #1_CD9FITC) nas Regras de nomenclatura. Abra a guia de canal e ligue o FITC e canais de PE.
- Carrega a placa no instrumento.
- Pressione Dot Plot e criar uma nova parcela de ponto (P1). Conjunto para a frente área de dispersão (FSC-A) versus dispersão-área lateral (SSC-A).
- Selecione inicializar para iniciar o laser e o fluidics. Pressione adquirir para iniciar a aquisição.
- Ajuste a escala para mostrar a população no meio do P1. Em P1 desenhar o portão "BEADS" em torno de toda a população (excluindo os detritos) (Figura 2A). Pressione parar.
- Pressione Dot Plot e criar uma nova parcela de ponto (P2). Conjunto para a frente Scatter-altura (FSC-H) versus FSC-A. Portão a nova trama do ponto na "BEADS". Em P2 desenhar um novo portão próximo a maior população e o nome "Camisolas" (Figura 2A).
Nota: Esta estratégia é projetada para evitar, tanto quanto possível a inclusão de agregados de grânulos em etapas tanto a aquisição e a análise. - Pressione Dot Plot e criar dois lotes do ponto diferente; um FITC contra SSC-A e um PE contra SSC-A. Portão a nova trama do ponto na "Camisolas".
- Selecione o número de eventos para gravar (por exemplo, 20.000). Selecione o registro e começar o experimento.
6. análise de dados
- Carrega os arquivos de aquisição para o software de análise.
Nota: As etapas a seguir tem que ser aplicado para cada amostra, incluindo contas apenas e cada amostra desconhecida. - Abrir um novo protocolo e criar lotes do ponto seguindo a mesma estratégia descrita na etapa 5.
- Defina todos os eixos de dispersão em escala linear e todos os eixos de fluorescência para escala de log.
- Mostre a média geométrica de fluorescência (X-Gmean-IFM) em canais FITC e PE.
- Calcular a relação X-Gdizer das amostras / X-Gdizer dos grânulos corados com anticorpo sem exossomo.
- Compare a mudança de dobra das IFM de diferentes preparações de EV.
7. extracelular vesículas número titulação
Nota: 7 a 10 de seções pode ser realizada para definir o número de partículas, a concentração de anticorpos e a especificidade, mas pode ser ignorada se o tipo de célula, da qual derivam-se EV, e anticorpos permanecem os mesmos.
- Dilua as partículas, obtidas de passo 2.3, em 1X PBS para obter uma série de suspensões que variam de 5 x 105 a 2,5 x 108 partículas.
- Para cada suspensão adicione em um tubo de fundo redondo 1 µ l de piscina de grânulo de captura.
- Siga o protocolo do passo 4.3.
8. titulação de anticorpos
Nota: Titulação de anticorpos geralmente é realizada pela adição de um único anticorpo para cada tubo.
- Manter o número de EV (partícula total ou conteúdo de proteína) constante em todas as amostras.
Nota: O número apropriado é determinado empiricamente como descrito acima na seção 7. - Siga o protocolo de etapas 4.1 a 4.5.
- Teste uma gama de concentrações de anticorpos acima e abaixo a quantidade recomendada pelo fornecedor. Por exemplo, para um anticorpo com uma concentração sugerido de 10 µ g/mL por teste, teste 1, 2, 5, 10, 20 e 50 µ g/mL. Inclua uma amostra com "somente contas", adicionando a maior concentração de anticorpos.
- Incubar durante 1 h a 4 – 10 ° C.
- Adicione 100 µ l de 1X PBS para cada amostra.
- Adquira as amostras.
9. tempo de incubação
- Verificar o tempo de incubação realizar aquisições em pontos de tempo diferente (por exemplo, 1h, 2h e 5h).
- Siga o protocolo a partir da seção 4.
- Incube as amostras 4 – 10 ° c por 1h.
- Adquira as amostras.
- Incube as amostras 4 – 10 ° c por 3 h.
- Adquira as amostras.
10. protocolo validação
-
Vinculação de EV
- Em um tubo de fundo redondo, adicione a quantidade de volume correspondente a 1 x 108 partículas ou a quantidade correspondente de proteínas totais.
- Ajuste o volume a 100 µ l com 1X PBS.
- Romper a membrana de EV por sonication (alternativamente um passo de choque do calor pode ser aplicado) de acordo com as instruções do fabricante. Definir a frequência e intensidade. O período de sonication pode ser estabelecido empiricamente definindo um experimento de tempo-curso (ou seja, 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc.).
- Adicione 1 µ l da piscina do grânulo.
- Siga o protocolo a partir de passo 4.4.
-
Especificidade do anticorpo
- Prepare um tubo para cada fluorocromo-Conjugado IgG e adicionar o complexo de grânulos-EV, conforme descrito na etapa 4.6.
Nota: O isotipo conjugados a fluorocromo deve corresponder com o IgG do anticorpo usado.
- Prepare um tubo para cada fluorocromo-Conjugado IgG e adicionar o complexo de grânulos-EV, conforme descrito na etapa 4.6.
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Representative Results
Número total de partículas para a coloração única
Desde um único talão pode vincular mais de uma partícula, testamos diferentes condições para definir a menor quantidade de total EV (único anticorpo por tubo) para alcançar a fase adiantada exponencial da curva de IFM. Uma concentração fixa de anticorpo foi usada enquanto o número total de partículas variou de 5 x 105 a 2,5 x 108. Como mostrado na Figura 3A, o número de partículas que nos permite assegurar que o anticorpo executa dentro de uma IFM aceitável, evitando o uso de um excesso de EV, é 1 x 108 partículas/coloração.
Titulação de anticorpos
Nós selecionamos a concentração adequada de anticorpos, resultando no sinal de mais alto, impedindo a ligação de anticorpos inespecíficos. Este teste foi otimizado para partículas de 1 x 108 , conforme determinado na configuração anterior. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE e anti-CD81_PE foram testados com concentrações variando de 1 a 50 µ g/mL (Figura 3B). Anticorpos anti-CD9_FITC e anti-CD63_PE deram uma boa resolução de sinal (7.5 e 130-fold mudança de IFM vs contas sozinho, respectivamente) quando usado na concentração de 10 µ g/mL, enquanto a concentração selecionada para o anticorpo anti-CD81_PE foi de 5 µ g/mL (465.3 dobra Mudança das IFM).
Validação de método
A fim de confirmar que o nosso método é adequado para analisar apenas "cup-shaped" vesículas extracelulares e não os restos de membrana, aplicamos etapas diferentes sonication, a 10% da amplitude, a solução contendo partículas. 100 µ l de solução de PBS contendo 1 x 108 partículas de 1x passou por etapas diferentes sonication de 30 segundos a 5 minutos e a preparação resultante contendo EV quebrado e bem forma foram analisados como descrito (protocolo experimental de ponto 3.3). como resultado, nós achamos que 30 segundos de sonication diminuir IFM que foi jogada completamente depois de 1 minuto. Este Commit, sem fluorescência é detectável por qualquer um dos marcadores de EV (Figura 3D).
Caracterização de citometria de fluxo de HEK293 e CPC derivada de exosomes
Estes resultados foram gerados seguindo o protocolo apresentado acima com o método de isolamento se. Os exosomes isoladas são quantificados pela tecnologia NTA e carregados durante a noite com 1 µ l de grânulos mistos (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). O complexos grânulos + Exo foram corado com a quantidade adequada de anticorpos anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE e anti-CD81_PE (Figura 3EF e tabela 2).
Além disso, usando EV-CPC comparamos análise FC com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. A Figura 4 mostra que ambos os métodos são adequados para marcadores de superfície perfil Exo. Pré-enriquecimento da fração de vesículas extracelulares melhora consideravelmente a intensidade de fluorescência, especialmente para CD63_PE e CD81_PE coloração (Figura 4 e tabela 3).
Figura 1: protocolo e NTA plota. (A) representação esquemática do protocolo experimental. (B) representante NTA parcelas para etapa condicionado Media, pré- se e pós-se. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: aquisição e análise de dados. (A) fluxo cytometry análise inicia-se com a criação de um primeiro portão ao todo pérolas população "pérolas" (excluindo os detritos) e em seguida um segundo portão para distinguir eventos "camisolas". Camisolas interiores são bloqueadas em um terreno de configurar com FSC-H como eixo x e FSC-A como eixo y. (B-D) Lotes do ponto representativo mostrando shift direita da intensidade de fluorescência para as populações positivas dos complexos de miçangas-exosomes (verde, CD9 + CD63 vermelho +; CD81 marrom +). Isotipo controle (violeta) sobreposição negativos grânulos de cores cinzento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curvas de titulação para o número de partículas (setas mostram a quantidade selecionada de partículas, 1 x 108). (A) as concentrações de anticorpos (setas mostram a concentração selecionada para cada um usado anticorpo). (B), tanto o número de partículas e anticorpo concentração são enredo vs intensidade média de fluorescência (IFM). (C) curva mostrando 3 aquisição diferente da preparação com 1 – 2 h ou 5 h de incubação do anticorpo. (D) curva mostrando a diminuição de fluorescência após sonication nos pontos de tempo diferentes. (E-F) Dobre a mudança (média ± DP) de IFM para CD9, CD63 e CD81 vs controle negativo (grânulos + anticorpos, não EV) são mostradas para HEK293 EV (n = 3 repetições independentes) e para CPC EV (n = 3 linhas de célula primária de 3 diferentes pacientes) por favor clique aqui para ver uma versão maior do Esta figura.
Figura 4: IFM análise e comparação entre dois procedimentos: direto EV-ligação com grânulos (capturar grânulos de isolamento) e pré-enriquecimento com se (se isolamento). Dados são mostrados como dobrar a mudança (média ± DP) de IFM para CD9 (A) e (B) CD63 CD81 (C) vs. controlo negativo (grânulos + anticorpos, não EV). N = 3 linhas de célula primária de 3 diferentes pacientes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| CPC | CONC NTA (parte / µ l) | CONC (µ g / µ l) |
| CPC #1 pre-se | 5.02E + 06 | 2.01 |
| CPC #1 post-se | 6.10E + 07 | 1,04 |
| CPC #2 pre-se | 5.74E + 06 | 2.30 |
| CPC #2 pós-se | 7.43E + 07 | 0.79 |
| CPC 3 # pre-se | 2.02E + 06 | 1,90 |
| CPC 3 # pós-se | 2.91E + 07 | 0.42 |
Tabela 1: Comparação entre a concentração de NTA e concentração de proteína para 3 diferentes paciente derivada CPC antes e depois de se.
| DOBRE A MUDANÇA DE IFM ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3.72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1,87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8,94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23,18 |
Tabela 2: Valor de mudança de dobra (média ± DP) de IFM para HEK293 EV (n = 3 repetições independentes) e CPC EV (n = 3 linhas de célula primária de 3 diferentes pacientes).
| DOBRE A MUDANÇA DE IFM ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| Capturar o isolamento de grânulos | 2.96 ± 1,45 | 65.65 ± 18.87 | 21.85 ± 6,12 |
| Se isolamento | 7,47 ± 2,71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13,38 |
Tabela 3: Valor de mudança de dobra de IFM (média ± DP) para CPC EV (n = 3 linhas de célula primária de 3 diferentes pacientes) isolado por grânulos de captura ou se.
Tabela 4: Especificação de produto único.
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Discussion
Técnica convencional de FC continua a ser o mais simples método analítico para caracterizar marcadores expressados na superfície do EV. A este respeito, selecionar o protocolo mais apropriado é fundamental para obter informações úteis sobre frações de partículas individuais de interesse, evitando limitações devido a sensibilidade do instrumento. Nós descrevemos um método usando partículas magnéticas juntamente com anticorpos que reconhecem a Exo e pequeno EV antígenos de superfície que são apropriados para a aplicação de FC a jusante. Nós validado o método usando dois diferentes tipos de células: CPC humano primário que estão emergindo como uma fonte de grande célula para Exo-com base em abordagens terapêuticas para a doença cardíaca; e células HEK293, uma linha de celular imortalizado amplamente utilizada na pesquisa da biologia celular, devido à plasticidade e crescimento celular confiável.
O método pode ser aplicado a EV se enriquecido e, para uma análise mais rápida, também diretamente na in-vitro derivado de células CM com nenhum pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Matérias-primas é fundamental quando se comparam amostras. Adicionando a captura de grânulos diretamente para a CM irá acelerar o procedimento, mas ao mesmo tempo diminuir a intensidade de fluorescência, como indicado na Figura 4A. Também é fundamental usar uma quantidade adequada de PBS para misturar grânulos e EV durante a etapa de "captura" 4.4. Ao usar um tempo de incubação constante, um aumento do volume irá diminuir a intensidade de fluorescência devido ao acoplamento ineficiente de EV.
Uma limitação do protocolo é que uma pérola única captura pode vincular múltiplo EV/Exo partículas sobre sua superfície. Isto limitará a possibilidade de identificar subconjuntos de EV expressando peculiar combinação de antígenos usando uma coloração múltipla. O método baseado em grânulo, portanto, produz dados semi-quantitativa. Usar contas carregando uma única captura Ab (CD9, CD63 ou CD81) permitirá ao máximo a caracterização de partículas que expressam dois resumos: o presente na esfera e reconhecido pelo anticorpo a captura e o detectaram pelo anticorpo que é Adicionado posteriormente.
O atual padrão de ouro para análises de Exo usando FC é um protocolo desenvolvido por van der Vlist et al. em 201215. Permite uma análise de alta resolução de EV usando uma configuração otimizada de high-end FC comercialmente disponível (por exemplo, influxo de BD). Este protocolo é extremamente detalhada e útil, mas ainda precisa de uma configuração de hardware complexos com calibragem específica de FC antes do uso. Três anos mais tarde, Pospichalova et al.16 propôs um protocolo simplificado para análise FC de Exo usando um citômetro dedicado especificamente desenvolvido para análise de pequenas partículas (por exemplo, apogeu A50 Micro)17. No que diz respeito este protocolo e outros que usaram o limite especial configuração11, propomos aqui um protocolo básico para realizar pequena fenotipagem de EV, usando contas de ligação magnética que é adequado para instrumentos convencionais de FC e não requer qualquer configuração especial. Protocolos diferentes descreveram métodos baseados em grânulo para caracterizar pequeno EV encontrada em fluidos corporais por FC12. Aqui, nós mostramos o immunocapture das subpopulações discretas das vesículas positivo para CD9, CD63 e CD81 que são comumente usados como marcadores de Exo18. Aldeído-sulfato látex19,20 e poliestireno12contas permanecem alternativas válidas para vinculação de EV presente em CM e fluido do plasma sanguíneo; no entanto, grupos aldeído expostos na superfície da partícula de polímero permitem acoplamento de proteínas inespecíficas e outros materiais para as partículas de látex, aumentando assim o risco de contaminação por organismos lipoproteína ou apoptose durante o isolamento e a deteção processo de21,22.
Grânulos, usados no protocolo vincular EV só inteira, bem forma. Propusemo-na romper a estrutura EV por sonication para saciar o sinal (seção 4, "protocolo de validação"). De fato, um minuto de resultados sonication da intensidade de fluorescência diminuiu, mostrando assim que um sinal positivo não pode ser afetado por restos de membrana adsorvido em grânulos.
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Disclosures
Nada a declarar.
Acknowledgments
L.B. foi apoiado por bolsas de investigação de Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurique (Suíça). G.V. foi apoiado por bolsas de investigação da Swiss National Science Foundation, Fundação Cecilia-Augusta, Lugano e o SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suíça)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
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