Summary
眼の血管ベッドのプロテオーム解析は人間の多くの眼の病態の詳細な理解のため極めて重要です。本研究は、蛋白質の抽出と質量分析法を用いたプロテオミクス解析のモデル船としてブタの短後毛様体動脈を用いた微小血管からのサンプルの準備のため、迅速、効率的で堅牢なメソッドを示します。
Abstract
分離の眼血管高度な科学技術のアプローチを使用して眼の病態生理学的状態を解読する生体外での使用ある特定の病気の私達の理解を大きく拡げた。質量分析法 (MS)-基づくプロテオミクスの分子機構、蛋白質シグナリング経路健康および病気の血管のベッドでの変化を解明するための強力なツールとして浮上しています。ただし、MS 分析前にサンプル準備の手順が再現性のある結果と複雑なプロテオームの詳細な解明を取得する重要です。これは眼微小循環、分析に利用可能なサンプル量が多いし、したがって、最適な蛋白質の抽出のための挑戦を提起の準備のため特に重要です。この記事は、ブタの短後毛様体動脈を採用の模範的な球の眼の血管床からのサンプル準備のための効率的で高速かつ堅牢なプロトコルを提供するよう努力します。現在法清次の均質化、サンプルのペレットからのタンパク質抽出手順当ててサンプル次元ゲルの電気泳動およびペプチッドの浄化の前に、遠心ろ過デバイスのクリーニング液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化線形イオン トラップ Orbitrap MS におけるラベル無料定量化のための手順。このメソッドは、眼血管のプロテオミクス解析のために特別に開発されているが説得力のある証拠、それも容易に使用できる他組織ベースのサンプルも用意いたしました。
Introduction
許可は、統合されたデータ収集力を卓越した、プロテオミクスの分野の進歩が大幅同様反射のように特定の病態の分子機構の理解に革命をもたらしました、特定の生理学的状態のセル人口や組織1,2,3,4。プロテオミクスは感度ととして最終的な診断と予後のための潜在的な疾患マーカーの同定を促進する別の眼サンプルの公平な分析により眼科研究の重要なプラットフォームであることも証明しています。証明されてエレガントな多くの研究が近年、私たちのいくつかを含む1,5,6,7,8,9,10。ただし、プロテオーム解析では特に信頼性の高い比較分析の健全な個人からの制御材料の必要性を考慮して、倫理的な理由のための人間のサンプルを得ることが困難、多くの場合。その一方で、最適かつ信頼性の高い質量分析のためのサンプルの十分な量を取得するは困難ですも。これ目のマイクロ血管など質量限定生物学的材料の特に重要です。眼血流の調節に重要な役割を果たしているようなの 1 つの主要な球血船は短後毛様体動脈 (sPCA)。緑内障と通院の前部虚血性視神経症 (NAION)11などいくつか視力を脅かす疾患の発症につながることができる深刻な臨床影響可能性があります任意摂動またはこの血管床の異常,12です。 しかし、上記の欠点のためこの動脈のベッドのプロテオーム変化の解明研究の欠如があります。そのため、近年、家豚 (イノシシイエバエ Linnaeus, 1758) として浮上している良い動物モデル眼科研究では人間とブタ13、間高い形態学的および系統学的類似点のおかげで 14,15。ブタの眼のサンプルが簡単に利用できる最も重要なことは、人間のティッシュのより正確な表現と。
これらの微小血管からの効率的な蛋白質の抽出と解析用の仕出し料理の方法論の不足と同様、目の血管の重要な役割を考慮した我々 は以前特徴付けられる社内を使用して豚の sPCA のプロテオーム解析高蛋白質16数の特定につながったプロトコル。この調査に基づき、さらに最適化して深い説明モデル組織としてブタの sPCA を用いた試料の微量からプロテオーム解析を可能にするこの記事で我々 の方法論。本研究の主な目的は、質量限定眼血管の MS 互換の方法論を確立、とはいえ実質的な実験的証拠を説明したワークフローも広くに適用できるさまざまな組織ベースのサンプルを提供しております。
このワークフローの高品質 MS 互換少量包括的プロテオーム解析のための材料の採取の準備のために尽力されると想定されます。
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Protocol
ビジョン研究会と制度のガイドライン、眼科と視覚に関する研究の動物の使用は、眼科会議 (ARVO) 文を厳守で動物試料を用いた実験のすべての手順を行った。本研究は行われ、眼科医療センター Mainz の大学で承認されました。
注:視神経と眼組織のブタ目は新鮮なローカルの屠畜場から得られた事後すぐに。除核の目が冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の研究所に運ばれ、すぐに使用します。採用されているワークフローの図式的な概観は、図 1に示します。
1. ソリューション
- 促進 (K H) を準備する、バッファー、1 つ 50 mL の乾燥した清潔な円錐形遠心管に次の化学物質 (塩化ナトリウムの 27.68 g、NaHCO3の 8.4 g、KCl の 1.4 g、MgSO4、1.18 g と KH2PO40.64 g) の重量を量ると、CaCl2と別のチューブにブドウ糖の 8.0 g 1.47 g。
注:これらの化学物質の混合粉末クールで乾燥した場所に格納してください。CaCl2とブドウ糖粉末の混合物が凝集の吸水を防ぐために最高ので新鮮。 - 準備するには、抽出バッファー 2 a ペレット サンプル、試薬 A 膜貫通型タンパク質抽出からの抽出バッファー 2 と 100 μ L のミックス 100 μ L あたり 200 μ L キットを (テーブルの材料で B6 を参照)。
注:分注作業部分に-20 ° C でストア抽出バッファー 2、試薬 A とプロテアーゼ阻害剤のカクテルを構成する膜貫通型タンパク質抽出キットのコンポーネントの長期使用。凍結・融解の繰り返しは避けてください。ペレット抽出手順の開始前に部屋の温度 (RT) 試薬を解凍します。 - 炭酸水素アンモニウム (ABC、100 mM) ソリューションを準備するには、0.39 g ABC の 50 mL の脱イオン水に溶解します。
- 10 mM を準備するには、1、4 ジチオトレイトール (DTT) ソリューションは、20 ml 100 mM ABC の DTT の 30 mg を溶解します。
- 55 mM ヨードアセトアミド (IAA) ソリューションを準備するには、20 ml 100 mM ABC の IAA の 200 mg を溶解します。
注:独立行政法人は、暗闇の中で保たれなければなりません。アルミ箔を使用して、光に敏感なソリューションとチューブをラップします。 - 10 mM ABC および 10% を含むトリプシン バッファーを準備 (巻/巻) アセトニ トリル (ACN)。13 ng/μ L のトリプシン作業ソリューションを準備するその内容を分解するトリプシンの 20 μ g 1 つのバイアルに 1.5 mL のトリプシン バッファーを追加します。
注:グレード変更トリプシンをシーケンスが指定されて凍結乾燥し、使用までの-20 ° C で保存する必要があります。 - 1:2 (v/v) 5% ギ酸をミックス ACN とペプチド抽出バッファーを準備するには、ことが。
注:1.3 1.7 新鮮な使用直前の手順ですべてのソリューションを準備し、任意の未使用のボリュームを破棄します。 - 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) を準備するには、TFA の 10 μ L を 10 mL の脱イオン水に混ぜてください。
2. 短後毛様体動脈の分離
注:ブタの目は基本的に前部 (図 2A) および後方セクション (図 2B) に分かれています。
- 冷たい K H バッファーを含む解剖室での眼球の場所。慎重に切り取った周囲の筋肉や組織マヨはさみのペアを持つ。
- メスで切開して目は前部と後部の半分に分かれてまでマヨはさみのペアで赤道面に沿って世界をカットします。標準パターンのピンセットのペアを使用して目の後部半分からできるだけ多く硝子体として削除します。
注:目グローブが 2 つの半分に分割は、解剖皿に移動目がなくても簡単に sPCA の分離を促進します。ただし、この手順は必須ではありません。血管は、目グローブを開かずに分離できます。 - 側を下に、網膜と視神経実験者の方を向いて慎重にピンを目の後部の半分に郭清ピンを使用します。
- 優しく学生 Vannas 春のはさみのペアを持つ基になる球後血管を公開する視神経周囲結合組織を切り取る。
- SPCA は、強膜を浸透し、視神経乳頭 (図 2C) を囲む円周 (5-8 本の枝) の間の船の短い枝として見なすことができます。Paraoptic とタイプ 5 の精密ピンセットと Vannas capsulotomy はさみ (図 2D) のペアで周囲の結合組織とともに遠位 sPCA に分離します。
注:K H バッファーの隔離プロシージャ全体で冷たいままを確認します。周囲温度に応じて、20-30 分毎にバッファーを変更することを強くお勧めします。
3. サンプル準備
- 優しく余分な細いタイプ 5 の精密ピンセットと顕微鏡下で Vannas capsulotomy はさみを使用して動脈セグメントから結合組織を削除、汚染物質を除去し、残渣を血のように冷たい PBS で分離の動脈をすすいでください。
注:サンプルがすぐに次のステップに服従しない場合スナップ-凍結それら液体窒素、-80 ° C の店でそれ以上の使用まで。 - 1 つの生物の複製を取得する 2 つ目からプール動脈は、1.5 mL 遠心チューブにそれらを転送し、分析用天秤を使用してサンプルの重量を量る。
- 各管に続いて組織タンパク質抽出試薬 0.5 mm、1.0 mm のジルコニア ビーズの混合物を追加 (T-あたり;テーブルの材料で B7 を参照してください)。
注:T のボリューム-あたり、50 mg のサンプルに試薬 1 mL の割合で各チューブ内のサンプルの重量によって異なります。均質化 1 の体積比は、チューブをロードするときに親指の一般的なルール: 1:2 のサンプルを =: ビーズ: T-(図 3A) あたり。非効率的な均質化を防ぐために抽出バッファーとビーズの少なすぎる量の大きすぎるボリュームを使用しないでください。 - ミキサー ホモジナイザーにサンプル チューブを読み込む (D6材料表を参照してください)。2 分と速度のレベル 6 にタイマーを設定し、均質化を開始します。実行した後は、完全な均質化とサンプルまで繰り返しサイクルのサンプルが完全にチェックは、(図 3B) を均質化。
注:24 サンプル チューブの合計は、1 つの実行で均質化することができます。タンパク質の変性を最小限に抑える均質化手順の中にサンプルを冷たい保つために重要です。本研究で使用される弾丸ミキサー ホモジナイザーがサンプルを冷たい保つ冷却機能です。内部の冷却機能はありません、ホモジナイザーで利用可能の場合、それぞれの実行の間に氷の上のサンプルを保つことができます。 - 新鮮な遠心管にピペット ホモジネートの慎重に。不溶性タンパク質及び可溶性蛋白質を含んでいる別の上澄みをペレットへの 4 ° C で 20 分間 10,000 x gでサンプルを遠心します。慎重にペレット層 (図 3C) に触れることがなく新鮮な遠心管に上澄みをピペットします。
注:上澄みとペレットの両方は、それ以上の使用まで-80 ° C に格納できます。
4. ペレット消化
- 抽出バッファー 2 a の 200 μ L、5 μ L のプロテアーゼ抑制剤のカクテルを各ペレット サンプルに追加します。数回ピペットとペレットを中断します。
注:よくペレットに追加する前に抽出試薬を混ぜます。抽出プロシージャ全体常温抽出バッファー 2A 氷とプロテアーゼ阻害剤を保ちます。 -
超音波ホモジナイザーを使用して、ペレットを完全に均質化します。
- 60 と 1 サイクルの振幅を設定します。少量 (10-500 μ L) による試料の均質化に適したチタン (Ø 0.5 mm、長さ 80 mm) のプローブを使用します。
- ペレットと抽出バッファー混合物中のプローブの超音波にサンプルを公開するスタート ボタンを押します。
- ペレットの塊は完全に均質になるまでサンプルを超音波照射します。各超音波処理の間、数秒間一時停止します。
- 完全な均質化を視覚的に確認します。塊がないことを確認するピペットと数回の磨砕液を混ぜます。
注:ペレット抽出プロシージャは均質化 (図 4) の中に生成される熱によるタンパク質変性を防ぐために氷の上実施する必要があります。
5. サンプル洗浄し、バッファーの交換
- 遠心ろ過デバイスを使用し 3 kDa カットオフ (テーブルの材料で D3 を参照) この手順で変更を製造元の指示に従って該当します。最初に、(フィルター パックで提供される) 微量遠心チューブにフィルター ユニットを挿入します。
- 1 つのフィルター装置にサンプルを磨砕液 200 μ L をピペットし、同じフィルターに 200 μ L の脱イオン水を追加します。安全にそれをキャップ (図 5A)。
- 遠心分離機と 14,000 x g 4 ° C で 15 分間のスピンにフィルター ユニットを配置します。
- 遠心分離機からデバイスを削除し、濾液を含む遠心チューブからサンプルの濃縮物を含むフィルター ユニットを区切ります。濾液 (図 5B) を破棄します。
- フィルター ユニットに 400 μ L の脱イオン水を加えることによって濃縮を再構成します。5.3 および 5.4 の 3 回の手順を繰り返します。慎重にピペットのクリーン チューブに '洗浄' のサンプル集中します。
注:通常、200 μ L 原油サンプル 50 ~ 70 になります集中濾過後の μ L。 - 残りのサンプル ホモジネートの 5.1 5.5 の手順を繰り返します。
6. タンパク質の測定
- ビシンコニン酸 (BCA) の蛋白質の試金を使用して、プレート リーダー sPCA サンプルの上澄みとペレットの画分のタンパク質濃度を決定する (表の材料で B5 を参照) をキットします。
- 製造元の指示に従って、2 mg/mL BSA を構成する 1 つ 1 mL アンプルからアルブミン標準 (BSA) 希釈 (最終的な BSA 濃度範囲 25 に 2,000 μ g/mL の間) を準備します。
- 各 BSA の標準的な希釈の 10 μ L をピペット、サンプルは、96 ウェル平底マイクロ プレートの各ウェルに (上清とペレットの両方) を複製します。
- BCA BCA 試薬 B の 1 部分に BCA 試薬 A の 50 の部品を追加することで試薬を作業の準備します。
注:作業試薬を調製する前に各測定に必要な量を計算し、新鮮なサンプルおよび標準的な希薄を試金するの数に基づいて十分な量を準備します。 - 慎重に各ウェルに試薬を作業 BCA の 200 μ L をピペットします。マイクロ プレートをカバーし、30 分の 37 ° C で孵化させなさい。RT にプレートを冷却した後 562 で吸光度を測定プレート リーダーの nm (テーブルの材料に D13 を参照)。
- 各 BSA の標準濃度 (μ g/mL) に対して生成される標準の曲線に基づいて、サンプルのタンパク質の濃度を決定します。
7. 一次元電気泳動 (1DE)
- (1 つのサンプル) の表 1に示すように、サンプルを 1DE に備えます。ピペットでよくサンプル混合物を混ぜます。70 ° C 15 分としたクールでサンプルを熱します。
- 950 mL の脱イオン水 50 mL の MES SDS 実行バッファーを追加することによって、実行バッファー × 1 を準備します。よく混ぜます。
-
プレキャスト 4-12% (B4 材料表参照) Bis トリス タンパク質ゲルを準備します。
- ゲル カセットを外し、カセットを脱イオン水をすすぎにプラスチックの袋を開いてカットします。
- 井戸を損傷しないように注意を取って 1 つの流体運動のゲル カセットから櫛を削除します。
- ピペットを使用して連続したバッファー x 1 と 2-3 回読み込み井戸を軽くすすいでください。反転し、確保が井戸の中の空気泡無し、バッファーを削除するゲル カセットを軽く振る。
- ゲル カセットの下部に白いテープを削除します。
- ゲル (最大 2 つのカセット) を挿入するゲルのタンクを実行し、完全に組み立てた、ゲル緊張ウェッジをロックします。
- 塗りつぶしを実行してバッファーの 200 mL の上 (カソード) バッファーの部屋の井戸が完全に覆われるまで。任意の漏れをチェックします。
- 抗酸化物質を 500 μ l 添加 (テーブルの材料で A14 を参照) を実行してバッファーへ。
注:抗酸化が還元剤で還元のサンプルで使用する必要があります妥当性試薬 (参照表 1) 電気泳動中に還元条件を維持するために、機密性の高いアミノ酸トリプトファンなどの酸化を防ぐために、メチオニン。 - 慎重にピペットを使用して、車線ごとにサンプルの 50 μ g をロードします。分子の質量マーカーとしてあらかじめ染色蛋白質の標準を読み込んで (A18材料表を参照してください)。
- 600 mL のバッファーの実行でより低い (アノード) バッファー区域を満たしなさい。
- 175 V の定電圧で 〜 60 分のためのゲルを実行します。実行の最後に、ゲルのナイフを使用してカセット プレートからゲルを慎重に取り外します。
-
慎重にボックスを染色ゲルにゲルを転送します。
- 新鮮なゲル染色される、製造元の指示に従って表 2に記載する必要があるの合計数に基づいて定着液を準備します。
- ロッキングのプラットフォームで RT で 10 分の定着液で、gel(s) を振る。
-
固定液を捨て、コロイド ブルー染色キットでゲルを染色します。
- 染色する必要があるゲルの総数に基づく染色ソリューション新鮮な準備表 3で説明するよう製造元の指示に従って。
- まず、適切なボリュームを測定し、直接ボックスを染色ゲルでアスタリスク (*) とマークされたコンポーネントをミックスします。ロッキング プラットフォーム上で RT 10 分なしテナー B 染色液で、gel(s) を振る。
- 染色ボックス入りに直接着色剤 B を追加します * 染色液。テナー B を使用する前によく振ることを確認します。
注意:7.10.1 と 7.11.1 ヒューム フードの下で準備の手順を実行します。
- 最高の全体的な結果のために夜通し染色液で、gel(s) を振る。
注:ステンド グラス バンドは、テナー * 染色添加 3 時間の最小を必要とし、強度は、染色液で長時間放置の場合は変化しない後 10 分以内表示になります。 - 慎重に染色液をデカントし、200 mL の脱イオン水に置き換えます。背景を消去する水の少なくとも 7-8 h の gel(s) を振る。
注:脱イオン水より過剰な染色を削除する染め色のプロシージャの間に数回を変更しなければなりません。Gel(s) 3 日間 [蛋白質バンドの強度を損なうことがなく水にも左することができます。Gel(s) は、すぐに次のステップに服従しない場合、は、長期保存のための 4 ° C で 20% 硫酸アンモニウム溶液に格納できます。
8. ゲルのトリプシンの消化力
注:このプロトコルはシェフチェンコら17、わずかな修正とメソッドに基づいています。この手順は、層流で行われるべきフードし、専用ピペット、ヒント、チューブ、およびガラス製品のセットを使用して、この目的のため。手袋を着用し、適切なラボのケラチンと他の汚染を防ぐためにすべての回でアパレルします。すべてのソリューションや使用の直前にこの手順で使用する試薬を準備します。
- きれいな、新しいミクロトーム刃をゲルからタンパク質のバンドを切除します。小さな断片 (約 1 mm × 1 mm 2 mm x 2 mm) にバンドを切断します。慎重に 1.5 mL 遠心チューブにゲル部分を転送します。
注:小さすぎる部分はピペット チップを詰まらせる可能性がありますより大きい部分はペプチド回復を減らします。ミクロトームの刃は、非常に鋭いを使用する場合は注意が必要。 -
染め色
- 100 mM ABC ソリューション/ACN (1:1、v/v) を含む脱染め色液 500 μ L を追加し、時折揺れまたはボルテックスと 30 分のための RT でサンプルをインキュベートします。
- 慎重に脱染め色液をピペット。残留染色のチューブを視覚的に確認します。ゲル部分がまだ青いステンド グラスは、8.2.1 手順を繰り返します。
-
減少およびアルキル化
- 作りたての DTT ソリューションの ~ 400 μ L を追加し、, 56 の ° C で 30 分は、ソリューションが完全にゲル部分をカバーすることを確認します。慎重にピペットの削減ソリューションを破棄します。
- 作りたての IAA 溶液の ~ 400 μ L を追加し、30 分削除バッファー ピペットをアルキル化と破棄の RT で暗闇の中で孵化させなさい。
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消化
- ゲル部分を縮小、不透明になるまで 10 〜 15 分の RT できちんとした ACN の 500 μ L を追加します。ACN をピペットし、フードの下で 5-10 分のゲル部分を風乾します。
- ゲル部分を完全にカバーする各管にピペットのトリプシン溶液を 50 μ l 添加します。30 分のための 4 ° C でチューブを孵化させなさい。
- 30 分後にすべてのトリプシン溶液はゲル部分によって吸収されている場合各チューブを確認します。必要に応じてゲル部分を完全にカバーするトリプシン バッファー (50-100 μ L、チューブ内のボリュームに応じて) の十分な量を追加します。37 ° C で一晩サンプルをインキュベートします。
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ペプチドの抽出
- 慎重にピペットの管とチューブをきれいに転送から抽出したペプチド ソリューション。遠心真空蒸着装置の上澄みを乾燥させます。
注:残りのゲル部分は捨てないでください。 - 抽出バッファーを 100 μ l 添加 (1.7 のステップを参照) チューブし、揺れで 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
- それぞれのバンドによると抽出されたペプチッドを含んでいる同じチューブに上清をピペットし、真空遠心分離で乾燥をします。
注:すぐに使用しない場合は、さらに使用するまで数ヶ月まで-20 ° C で乾燥ペプチド エキスを格納できます。
- 慎重にピペットの管とチューブをきれいに転送から抽出したペプチド ソリューション。遠心真空蒸着装置の上澄みを乾燥させます。
9. ペプチド精製
注:このペプチドのサンプルの脱塩・精製の手順は、C18ピペット チップの使用で実施 (C15材料表を参照してください)。各サンプルの新しいヒントを使用します。
- 表 4に示すように、2 mL の遠心管に、ペプチド精製手順円錐形遠心分離機管そして因数の次のソリューションの新鮮なを準備します。ペプチド精製用管の概要は以下のとおりです: (試料) をチューブ チューブ B (ぬれソリューション) チューブ C (平衡の解決)、管 D (洗浄液)、チューブ E (溶出液)、管 F (、空 2 mL または 5 mL 遠心チューブ、によって異なります掃除しなければ、廃棄物処理のためのサンプルの数)、および管 G (容量きれいで、空チューブ 0.2 mL)。
- 0.1% の 10 μ L でステップ 8.6.3 から乾燥ペプチド エキスを再構成 TFA。このチューブはチューブ A を指定します。
- 超音波照射 5 分氷で超音波風呂でチューブ A
- スピン ・ ダウン 1 分、1,000 x gでベンチトップ遠心分離のサンプル ソリューションです。
- P10 マイクロ ピペットを 10 μ L の音量を最大に設定し、C18ピペット チップをしっかりと取り付けます。
- ぬれソリューション (B 管) にピペット チップの梱包材に慎重に吸引します。ゆっくりとチューブ F. を繰り返しますに廃棄物この手順、少なくとも 7 〜 8 回を調剤します。
注:ぴたりと停止するピペット プランジャーを押すとゆっくりと解放またはプロシージャ全体でプランジャーを調剤します。C18 カラムに最大のペプチド結合をようにピペッティング時にヒントに気泡を導入しないように予防措置を取る。 - 吸引 10 によってペプチド結合のためのヒントを平衡管内 C. μ 平衡ソリューション液を捨て、3 〜 4 回この手順を繰り返します。
- 次に、吸引し、列の先端にペプチドを結合するために数回 (対応するゲルのバンドの厚さ) によって管 A のサンプル ソリューションを済ます。
注意:吸引と結合手順 (ステップ 9.8) 中に調剤手順 A. チューブ内で行われています。無駄に試料を分配しないでください。 - 管 D の洗浄液を吸引し、無駄 (F 管) 4 ~ 5 倍にそれを破棄して C18ピペット チップを洗います。
- 最後に、ペプチド結合をピペッティング溶出ソリューション (管 E) および g. のチューブに溶離液で溶出します。
- サンプルの回復を高めるためのサンプルごとの 2 に 3 サイクル全体の手順を繰り返します。
- 1 つのサンプル精製後先端を破棄し、新しいヒントを使用して、次のサンプルの。
- 真空濃縮、精製ペプチド溶出を乾燥させます。
注:LC ESI-焼入れ Orbitrap MS システムで浄化されたサンプルがクロマトグラフィー-タンデム質量分析の準備が整いました。さらに使用するまで-20 ° C で乾燥したサンプルを格納します。
10. 液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化/タンデム質量分析
注:ラベル無料定量的プロテオミクス解析は、液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化線形イオン トラップ Orbitrap (LC-ESI-焼入れ-Orbitrap) MS システムで実行されます。LC はレオス アレグロ第四紀ポンプ (HTS PAL オートサンプラーに結合、システム構成 150 mm × 0.5 mm C18列に接続されている 30 mm × 0.5 mm C18前列オンライン脱装備から成る。使用逆相水性溶剤 A 0.1% (v/v) ギ酸および 0.1% (v/v) ギ酸 LC MS グレード アセトニ トリルから成る有機溶剤 B LC MS グレード水から成る。私たちの以前の研究の6,16で詳細に説明されているようにゲルのバンドあたり 60 分の実行時間がグラデーションを使用します。
- 0.1% の 10 μ L の精製ペプチド試料を溶解 TFA。5 分間氷の上のサンプルを超音波照射します。
- V 底 96年ウェル プレートに 10 μ L のサンプルをピペットし、クリア、自己粘着性のカバー フィルムでシールします。
- オートサンプラーにプレートを転送します。
- 60 分: 0 の各実行時間の次のグラデーションを使用して-35 分 (15-40% 溶剤 B)、35-40 分 (40-60% 溶剤 B)、40-45 分 (60 ~ 90% 溶剤 B)、45-50 分 (90% 溶剤 B)、50-53 分 (90-10% 溶剤 B)、53-60 分 (10% 溶剤 B)。
- 使用楽器の次の質量分析条件: 肯定的なイオン エレクトロ スプレー イオン化モード、スプレー電圧 (2.15 kV)、キャピラリー温度 (220 ° C)、データ依存型アクイジション ・ モード、自動獲得 Orbitrap MS 間の切り替えと焼入れ MS/MS、orbitrap 解像度 (30,000)、m/z 範囲 (1,600 に 300)、ターゲットの自動利得制御 (AGC、1.0 x 106イオン)、内部校正 (リアルタイムで m/z 445.120025 イオンで polydimethlycyclosiloxane [PCM])、MS モードで有効に大量のオプションをロックトップ 5 最も強烈な前駆物質イオン、さらに正規化された衝突誘起解離 (CID) によって断片化衝突エネルギー (nce-コード、アクティベーション時間 30 ms 3 の繰り返し回数を 35%)、および動的除外期間を選択することによって得られたタンデム データ(600 秒) です。
注:結果として得られる断片イオンは、焼入れに記録されます。 - 各サンプルの少なくとも 3 つの生物学的複製を実行します。
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Representative Results
限られたサンプル可用性は、眼科研究の主な欠点の 1 つです。同様に、抽出収量の法最適なタンパク質サンプルの少量から眼の血管は議論の余地が多いよう。日には、特に球血管からの蛋白質の抽出のための仕出し料理の方法の不足があります。したがって、メソッドの最適化の最初のステップとして、一般的効果、いくつかの信頼性を比較する - 原則の証拠として比較的新しい試薬、T にタンパク質抽出洗剤を採用-あたり、心臓組織を用いた予備的研究を行ったマウス (のために簡単かつ十分なサンプル可用性の最適化手順のため)。総蛋白濃度とその次の試薬を使用して識別される総蛋白を比較することによってタンパク質の収量を比較した: T-0.02 %n-ドデシル-β-D-maltoside (DDM) 1 %3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio あたり]-1-プロパンのスルフォン酸塩 (チャップス)1% amidosulfobetaine 14 (ASB-14) と ACN 及び TFA の混合物 (20 %acn/1 %tfa)。これらの界面活性剤の各抽出試料中のタンパク質の総量は T で抽出した組織から高い収率で図 6Aに示すように-DDM (22.88 μ g/mg 組織)、チャップス続いて (56.4 μ g/mg 組織) あたり (16.01 μ g/mg組織)、ASB 14 (11.56 μ g/mg 組織) と ACN/TFA (4.38 μ g/mg 組織) から低収量。一貫して、識別される総蛋白も T あたり抽出サンプル (1649 蛋白質) で最高でした > DDM (1310 蛋白質) > チャップス (1319 蛋白質) > ASB 14 (1121 蛋白質) > ACN/TFA (924 蛋白質)、示す図 6B。これらの結果に基づいて、我々 は T と sPCA サンプルからの蛋白質の抽出を進めて-あたり。
次に、1DE 事前分別前のサンプル準備のプロトコルの最適化は、良く分離タンパク質バンドとサンプルと複製の間再現性の高い結果を取得する非常に重要なステップです。これらの手順の重要性が反映および 1DE の結果で強調表示されます。最適化された試料を受けるし、掃除の手順を図 7は前後に sPCA の 1DE タンパク質プロファイルの比較を示します。全体的に、高度なレーン 3 蛋白質バンドのスミアと貧しい人々 の分離を認めた。このプロファイルは、サンプルが抽出試薬、また脂質や細胞破片などの汚染物質を含めることができることを示しています。しかし、sPCA のサンプルが上清に分かれていたペレットし、最適化を受けるプロトコルは、模範的な 1DE プロファイル、レーン 1 と 2 (図 7) で表される。
Gist は、有望な結果、これらに基づく眼微小循環から急速な堅牢で効率的な可溶性タンパク質抽出のための最適化の手法は採用して組織タンパク抽出試薬 (T-あたり) 抽出バッファー 2 a を使用して抽出する (TM PEK)膜蛋白質はサンプル ペレットで見つけた。その後、乳剤をサンプル (T-分数あたり) バッファー交換、サンプル 1DE 前 3 kDa 遠心フィルター ユニットの洗浄を受けます。最適な濃度は、ウェルあたり 50 μ g です。その一方で、それはこのプロトコルのみ小さな組織、血管などのために適当ではないか、他組織ベースのサンプルの可能ですが、ここで強調表示されますします。これはマウスの脳と清 (図 8A, B) と (図 8C, Dペレット分数の両方から抽出することができます蛋白質の多数があることを示す中心のティッシュの 1DE プロファイルによって証明されて).
図 1: ワークフローの概要。ブタの sPCA のラベル無料定量的プロテオーム解析のプロトコルの概略図。一般的には、この手順は、微小サンプルの準備の手順を有し、MS ベース プロテオミクス 2 つの主要なセクションに分かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ブタの目の代表的な写真です。(A) 横を見る目世界ショーの目、強膜、周囲の筋肉や視神経の前部にある角膜。(B) 後方は視神経目のショーの表示します。(C)、眼球の奥に sPCA の枝は、paraoptic と遠位の枝で構成されます。(D) 脂肪や結合組織を周囲と孤立した sPCA。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: サンプルの均質化します。代表は、均質化した後表示されるサンプル (A) と (B) を撮影します。(C)、均質化試料はさらに水溶性タンパク質と不溶解性の膜貫通型蛋白質を含んでいるペレットを含む上清に分かれていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:タンパク質抽出プロシージャをペレットします。タンパク質の変性を防ぐために氷の上ペレット サンプルを抽出します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: サンプル洗浄します。3 kDa カットオフ遠心フィルター MS 分析の前にサンプルをきれいにするとバッファー交換が行われます。代表は、ろ過後表示される磨砕液 (A) と (B) を撮影します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 蛋白質抽出効果と T との間の堅牢性の比較-あたりと 4 つの一般的なタンパク質抽出洗剤。(A) タンパク質の量と (B) T を使用して識別される蛋白質の総数を描いた横棒グラフ-0.02% 1% 1% チャップス、ddm™ ASB 14 と 20 %acn/1 %tfa。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: ブタ sPCA タンパク質プロファイル最適化前に、と後の代表的な 1DE ゲル。車線 3 は、掃除の手順を事前にさらされなかったサンプルの 1DE プロファイルを示しています。レーン 1 と 2、それぞれ、最適化された試料をサンプルにかけることと、洗顔後上澄み sPCA のペレット、模範的なタンパク質プロファイルを示しています。ゲルは、コロイド ブルー染色キットで染まっていた。M = マーカー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 組織ベースの模範的なサンプルの代表的なコロイド ブルー染色 1DE ゲル。それぞれ、上清 (A, B) とマウスの脳や心臓の組織のペレット (C, D) のタンパク質プロファイルは、ウェルあたり 50 μ g のサンプリングされます。上澄みとペレットのタンパク質抽出 T を採用-あたりと膜貫通型タンパク質抽出キット、それぞれ。M = マーカー。R1 R3 3 つ複製を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| コンポーネント | (Μ l) |
| サンプル (上清またはペレット) | x |
| LDS サンプル バッファー (4 x) | 2.5 |
| 還元剤 (10 倍) | 1 |
| 脱イオン水 | (試料量) に応じて最大 6.5 |
| サンプルごとの合計量 | 10 |
| 注: x は、蛋白質濃度 (50 サンプルあたり μ g 総蛋白) に基づいて計算されます。 | |
表 1:1 二次元のゲルの電気泳動 (1DE).1DE を実行するサンプル調製に必要なコンポーネントの詳細については。
| ソリューション | 1 ゲル (mL) | 2 ゲル (mL) | 4 ゲル (mL) |
| 脱イオン水 | 40 | 80 | 160 |
| メタノール | 50 | 100 | 200 |
| 酢酸 | 10 | 20 | 40 |
表 2: ゲル固定。固定ソリューション、1DE の準備に必要なコンポーネントの詳細については。
| ソリューション | 1 ゲル (mL) | 2 ゲル (mL) | 4 ゲル (mL) |
| * 脱イオン水 | 55 | 110 | 220 |
| * メタノール | 20 | 40 | 80 |
| * テナー A | 20 | 40 | 80 |
| 着色剤 B | 5 | 10 | 20 |
テーブル 3: ゲル染色。コロイド青の染色液の準備のためのコンポーネントの詳細については。
| (の) ソリューション | 組成 | ACN * * | H2O * * | TFA | 合計ボリューム * |
| ぬれ性 | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing と平衡 | 0.1% TFA | 10 mL | 10 Μ L | 〜 10 mL | |
| ペプチドの溶出 | 0.1 %60: 40 で TFA ACN を =: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 Μ L | 〜 10 mL |
| 注: * 合計ボリューム クリーニング ヒント Zip を受けるサンプルの合計数により調整してください。 | |||||
| * * HPLC グレードまたは LC MS グレードを使用します。 | |||||
| # は、それぞれ洗濯と平衡の 2 つの個別のエッペン チューブを準備します。 | |||||
表 4: ペプチド精製。コンポーネントと C18ピペット チップを用いたペプチド精製法のそれぞれの作品の詳細です。
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Discussion
包括的プロテオームの多様な眼のサンプルのプロファイリングは、分子メカニズムと健康と病気に関与するシグナル伝達経路を解明する重要かつ不可欠な最初のステップです。Mandal らによって詳細な説明のレビューで強調されるように、前のサンプルの準備の手順が欠かせない質の高いデータを取得するために、これらの解析から得られた結果の再現性を確保するため、サンプルの処理手順目の別の部分は、二次元ゲル電気泳動および質量分析戦略1を採用しています。これらの調査行は、私たちの現在の研究はモデル眼微小循環としてブタの sPCA を使用して急速な堅牢で非常に効率的な MS 互換試料の最適化手順プロトコルを提供します。この調査は、次の高品質 MS データを生成する数量限定の動脈血サンプルからタンパク質の十分な量を抽出するための具体的方法論の不足を開始されました。本手法はまた優秀なプロテオーム マッピング18を可能にするマイクロ スケール技術の使用に関する知識の既存のボディに貢献する試みです。
定量的プロテオーム解析に最適なパフォーマンスを考慮する必要がありますこの実験的プロトコルのいくつかの重要な側面があります。まず、完全な均質化の最適な蛋白質の抽出を確保するために、金額に関係なく、サンプルを受けることが重要です。本手法では、異なるサイズのビーズと弾丸ミキサー ホモジナイザーの混合物の使用は完全な組織換散のため尽力しました。種類と使用ビーズのサイズは、サンプルの種類と量によって異なります。現在利用の ZrO2やステンレス鋼などの高密度ビーズ中厳しい組織に適しているし、血管は、特にうまくいきました。
第二に、ペレットから上清を分離して、消化力および指定されたキットを使用して抽出を後者を施すことが不可欠です。この手順は、穏やかな洗剤19,20,21を使用して均質化することは困難で、それ以外の膜貫通蛋白質などの高分子量のタンパク質を抽出する極めて重要です。沈殿したペレットは最高スプラッシュまで激しい撹拌中に導入またはメソッドの揺れで生じたサンプル損失を避けるために超音波を使用して分解します。
第三に、方法論に特に記載がない限り、すべての試料調製方法は低温 (4 ° C) で実施されて注目されます。これは、抽出の手順中に最小限のタンパク質変性を確保するためです。第四に、繰り返し凍結融解のサンプルは、蛋白質の分解とサンプルの質の劣化を防ぐために避けるべき。
最後に、汚れと洗剤の除去は、ゲルで分別、酵素消化と MS 分析18,22中下流の干渉を防ぐために蛋白質の抽出を行い、必要です。これらの汚染物質は、多くの場合電気泳動の分離の解像度と競合し、1DE プロファイル (図 7) に示すように、同様に、結果の可視化に影響を与えます。この問題を回避するために、使いやすさと最小限の蛋白質の損失の遠心カットオフ フィルター デバイスの使用は支持されます。
現在実験手順は、ラベル無料定量的 MS 解析で最適な重要なサンプル準備のステップに詳細な見通しを提示、2 つの制限があります。最初に、その後の分析のための組織の十分な量を提供するために 2 つのブタ目から sPCA のサンプルを集めた。ローカルの屠畜場から得られる目はランダム、したがって、それは知られていない血管は同じ動物の目から隔離される場合、プーリング サンプル個体間変動5,6が軽減されます。しかし、現在の方法は、利用できるサンプルの量に応じて個々 のサンプル準備のためも対応できます。第二に、提示された方法論開発設計されています 1DE ゲルに基づく分別のため。良い再現性、分析のよりよい深さに品質管理の容易さに至るいくつかの要因により 1DE 選択しましたがトップダウンと他の分別方法の統合のための現在のメソッドの互換性の調査が必要、、特に現在代表される眼血管1,5,23など複雑なサンプルのため。
結論としては、上述の制限にもかかわらず説明ワークフローはシンプルで確実な血管の小さな量の解析用仕出し料理厳格なサンプル準備方法を表します。また、他の細胞・組織・ ベースのサンプルの質量分析を用いたプロテオーム解析のこのメソッドを容易に統合できるここで強調することが重要です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
博士 Manicam は、内部大学研究資金 (Stufe 1) ヨハネス ・ グーテンベルク大学マインツ、ドイツ研究振興協会 (MA 8006/1-1) からの助成金の大学医療センターからによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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