Summary
توصيف البروتين من أسرة microvascular العين أمر حيوي لفهم متعمق للعديد من أمراض العين في البشر. وتوضح هذه الدراسة طريقة فعالة وسريعة وقوية لاستخراج البروتين وإعداد عينة من الأوعية الدموية الصغيرة التي توظف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير كسفن النموذجي لتحليلات الجماهيري-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات.
Abstract
استخدام معزولة من الأوعية الدموية العين في المختبر فك الدولة الفيزيولوجية المرضية للعين باستخدام النهج التكنولوجية المتقدمة اتسع اتساعاً كبيرا فهمنا لبعض الأمراض. الطيف الكتلي (مللي ثانية)-برز البروتيوميات أساس كأداة قوية لكشف التغيرات في الآليات الجزيئية والبروتين مما يشير إلى مسارات في الأسرة بالأوعية الدموية في الصحة والمرض. نموذج إعداد الخطوات قبل تحاليل مرض التصلب العصبي المتعدد غير حاسمة للحصول على النتائج استنساخه وتوضيح متعمقة للبروتين المعقدة. هذا مهم خاصة لإعداد ميكروفيسيلس العين، حيث كمية العينة المتاحة لتحليلات محدودة في كثير من الأحيان وهكذا، يشكل تحديا لاستخراج البروتين المثلى. هذه المقالة تسعى لتوفير بروتوكولا فعالة وسريعة وقوية لإعداد عينة من مثالية خلف المقلة العين الأوعية الدموية سرير توظيف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير. ويركز هذا الأسلوب على إجراءات استخراج البروتين من المادة طافية وبيليه من العينة بعد تجانس، عينة التنظيف باستخدام أجهزة الطرد المركزي عامل التصفية قبل تنقية التفريد والببتيد هلام أحادي البعد الخطوات للقياس الكمي خالية من التسمية في نظام MS تاين خطية فخ أيون-أوربيتراب اليكتروسبراي لوني سائل. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد وضعت خصيصا لتحليلات البروتيوميات ميكروفيسيلس العين، كما قدمنا أدلة مقنعة على أن فإنه يمكن أيضا سهولة استخدام العينات الأخرى المستندة إلى الأنسجة.
Introduction
النهوض في الميدان البروتيوميات، أي تصاريح متكاملة وغير مسبوقة من السلطة جمع البيانات، وإلى حد كبير ثورة فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض ظروف المرض، وكذلك كما هو الحال في ما يعكس الدولة الفسيولوجية لخلية معينة السكان أو الأنسجة1،2،،من34. البروتيوميات أثبت أيضا أن تكون منبرا هاما في أبحاث العيون نظراً لحساسية وغير متحيزة تحليل العينات العين المختلفة التي تيسر تحديد علامات المرض المحتملة للتشخيص، والتشخيص في نهاية المطاف يدل على أناقة بالعديد من الدراسات في السنوات الأخيرة، بما في ذلك بعض من خاصتي1،5،6،،من78،،من910. ومع ذلك، غالباً ما يصعب الحصول على العينات البشرية لتحليل البروتين نظراً لأسباب أخلاقية، خاصة بالنظر إلى الحاجة إلى مواد مراقبة من الأشخاص الأصحاء للتحليلات المقارنة يمكن الاعتماد عليها. من ناحية أخرى، كما أنها تمثل تحديا للحصول على كمية كافية من عينات لتحليلات جماعية والمطيافيه الأمثل وموثوق بها. هذا أمر بالغ الأهمية لا سيما للمواد البيولوجية المحدودة الجماهيري مثل الأوعية الدموية الدقيقة للعين. واحد هذه الرئيسية خلف المقلة الأوعية الدموية التي تضطلع بدور محوري في تنظيم تدفق الدم العين هو شريان الهدبية الخلفية قصيرة (sPCA). قد يؤدي أي اضطراب أو الحالات الشاذة في هذا السرير الأوعية الدموية في الانعكاسات السريرية الشديدة، التي يمكن أن تؤدي إلى الآلية المرضية للعديد من الأمراض التي تهدد البصر مثل الزرق ونونارتيريتيك الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية (NAION)11 , 12-ومع ذلك، هناك نقص الدراسات توضيح التغييرات البروتين في هذا السرير الشرياني بسبب العيوب المذكورة أعلاه. ولذلك، في السنوات الأخيرة، الخنازير البيت (مستأنسةالبري Sus لينيوس، 1758) برز كنموذج حيوان جيدة في أبحاث العيون نظراً لأوجه التشابه مورفولوجك والنشوء والتطور عالية بين البشر والخنازير13، ،من 1415. عينات العين الخنزير متاحة بسهولة، والأهم من ذلك، يتم تمثيل أكثر دقة للأنسجة البشرية.
ونظرا للدور الهام لهذه الأوعية الدموية في العين، فضلا عن ندرة منهجية تهتم لاستخراج البروتين الفعال والتحليلات من هذه ميكروفيسيلس، نحن تميزت سابقا البروتين sPCA الخنزيري الداخل باستخدام بروتوكول التي أسفرت عن تحديد هوية عدد كبير من البروتينات16. وبناء على هذه الدراسة، لدينا كذلك الأمثل ووصف متعمق منهجيتنا في هذا المقال، الذي يسمح تحليل البروتين من المبالغ الدقيقة للعينات باستخدام sPCA الخنزير كنموذج الأنسجة. أن كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة وضع منهجية متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد للأوعية الدموية العين وسائل محدودة، قدمنا أدلة تجريبية كبيرة أن وصف سير العمل يمكن أيضا تطبيقها على نطاق واسع لعينات مختلفة تستند إلى الأنسجة.
ومن المتوقع أن يقوم سير العمل هذا سوف تكون مفيدة لإعداد عالي الجودة المتوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد عينات من كميات صغيرة من المواد لإجراء تحاليل شاملة من البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع إجراءات تجريبية باستخدام العينات الحيوانية في الالتزام الصارم برابطة البحوث في الرؤية وبيان "طب العيون" (آرفو) "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية والمبادئ التوجيهية للمؤسسات. أجريت هذه الدراسة والموافقة على قسم لطب العيون، "جامعة ماينز المركز الطبي".
ملاحظة: وتم الحصول على عيون الخنزير جنبا إلى جنب مع العصب البصري والأنسجة اكستراوكولار طازجة من المسالخ المحلية فورا بعد الوفاة. عيون انوكليتيد ونقل إلى المختبر في الفوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS) واستخدامها على الفور. نظرة عامة التخطيطي لسير العمل المستخدمة كما هو مبين في الشكل 1.
1-الحلول
- إعداد كريبس-هينسيليت (كح) المخزن المؤقت، ووزن المواد الكيميائية التالية (27.68 غرام من كلوريد الصوديوم وز 8.4 ناكو3، 1.4 غرام من بوكل، ز 1.18 مجسو4و 0.64 ز خ2ص4) في أنبوب الطرد المركزي المخروطية نظيفة وجافة 50 مل واحد و ، ز 1.47 كاكل2 و g 8.0 الجلوكوز في أنبوب آخر.
ملاحظة: يجب تخزين مسحوق خليط من هذه المواد الكيميائية في مكان بارد وجاف. أفضل مستعدة كاكل2 والجلوكوز المخلوط مسحوق طازجة لمنع امتصاص الرطوبة والتثاقل. - لإعداد مجموعة 200 ميليلتر لاستخراج 2A المخزن المؤقت كل عينة بيليه، مزيج 100 ميليلتر من استخراج المخزن المؤقت 2 و 100 ميليلتر من كاشف أ من استخراج البروتين ترانسميمبراني (انظر B6 في الجدول للمواد).
ملاحظة: الكوة لمكونات الطقم استخراج البروتين transmembrane تتألف من المخزن المؤقت لاستخراج 2، كاشف أ ومثبط البروتياز كوكتيل في أجزاء العمل ومخزن في-20 درجة مئوية لفترات طويلة الاستخدام. تجنب تكرار التجميد وذوبان الجليد. ذوبان الجليد الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل بدء هذا الإجراء استخراج بيليه. - لإعداد حل بيكربونات الأمونيوم (أي بي سي، 100 ملم)، حل ز 0.39 من ABC في 50 مل مياه.
- لإعداد 10 ملم 1، 4-ديثيوثريتول (DTT) الحل، حل 30 ملغ DTT في 20 مل من 100 مم أي بي سي.
- إعداد 55 مم إيودواسيتاميدي (IAA) الحل، حل 200 مغ الأكاديمية في 20 مل من 100 مم أي بي سي.
ملاحظة: الأكاديمية الدولية يجب أن تبقى في الظلام. استخدام رقائق ألومنيوم التفاف الأنابيب مع حلول حساسة للضوء. - إعداد المخزن المؤقت التربسين التي تحتوي على ABC 10 ملم و 10% (المجلد/المجلد) الاسيتو الانيتريل (ACN). إضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت التربسين في قنينة واحدة من 20 ميكروغرام من التربسين حل محتواه لإعداد حل عامل التربسين 13 نانوغرام/ميليلتر.
ملاحظة: تسلسل الرتب تعديل التربسين تم توفيره المجففة بالتبريد ويجب أن تكون مخزنة في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. - إعداد المخزن المؤقت لاستخراج الببتيد، مزيج من 1:2 (v/v) من حمض الفورميك 5% مع تزاول.
ملاحظة: إعداد كافة الحلول في خطوات 1.3-1.7 الطازجة فقط قبل الاستخدام وتجاهل أي وحدة التخزين غير المستخدمة. - لتحضير حامض trifluoroacetic 0.1% (تفا)، مزيج 10 ميليلتر من تفا مع 10 مل مياه.
2-عزل شرايين الهدبية الخلفية قصيرة
ملاحظة: العين الخنزير ينقسم أساسا إلى الأمامي (الشكل 2أ) والأبواب الخلفية (الشكل 2ب).
- مكان العالم العين في غرفة تشريح الذي يحتوي على المخزن المؤقت ك ح المثلج. بعناية قطع بعيداً الأنسجة والعضلات المحيطة بها مع زوج من مقص حاد في مايو كلينيك.
- شق مع مشرط وقطع الكرة الأرضية على طول الطائرة الاستوائية مع زوج من مقص حاد في مايو كلينيك حتى يتم فصل العين في النصفين الأمامي والخلفي. إزالة الجسم الزجاجي كثير ممكن من النصف الخلفي للعين باستخدام زوج من الملقط نمط موحد.
ملاحظة: ويسهل فصل العين الكرة الأرضية إلى نصفين عزلة sPCA بسهولة دون أن عين تتحرك في طبق التشريح. بيد أن هذه الخطوة ليست إلزامية. يمكن أيضا أن السفن منعزلة دون فتح العالم العين. - استخدام دبابيس التشريح بعناية من طرف أسفل الجزء الخلفي من العين مع الجانب شبكية العين إلى أسفل والعصب البصري مواجهة نحو المجرب.
- قطع بلطف بعيداً الأنسجة الضامة المحيطة بالعصب البصري لفضح المفرج خلف المقلة الأساسية مع زوج من مقص الربيع "فانس الطالب".
- ويمكن اعتبار sPCA فروع قصيرة من السفن (بين 5-8 فروع) التي تخترق الصلبة العينية وتحيط circumferentially رأس العصب البصري (الشكل 2-ج). عزل باراوبتيك و sPCA القاصي جنبا إلى جنب مع الأنسجة الضامة المحيطة مع زوج من ملاقط الدقة 5 نوع ومقص كابسولوتومي فاناس (الشكل 2د).
ملاحظة: ضمان بقاء المخزن المؤقت ك ح المثلج طوال إجراءات العزل. ينصح بتغيير المخزن المؤقت كل 20-30 دقيقة، اعتماداً على درجة الحرارة المحيطة.
3-نموذج إعداد
- بلطف إزالة الأنسجة الضامة من شرائح الشرياني باستخدام الملقط الدقة نوع إضافية ذات الرؤوس غرامة 5 ومقص كابسولوتومي فانس تحت ستيريوميكروسكوبي وشطف الشرايين معزولة في برنامج تلفزيوني المثلج إزالة الملوثات والمخلفات في الدم.
ملاحظة: إذا لا تخضع العينات إلى الخطوات التالية فورا، الأداة الإضافية-تجميد لهم في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. - تجمع الشرايين من عيون اثنين الحصول على واحد من تكرار البيولوجية وتحويلها إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب ووزن العينات باستخدام رصيد التحليلي.
- لكل أنبوبة، إضافة خليط حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 و 1.0 مم، تليها كاشف استخراج البروتين الأنسجة (T-الواحدة؛ انظر B7 في الجدول للمواد).
ملاحظة: حجم تي-الواحدة وهي تعتمد على وزن العينات في كل أنبوب، مع نسبة 1 مل من كاشف 50 ملغ من العينة. قاعدة عامة من الإبهام لاتباعها عند تحميل أنابيب للتجانس نسبة حجم 1:1:2 = عينة: الخرز: تي-كل (الشكل 3أ). لا تستخدم كبير جداً بحجم المخزن المؤقت الاستخراج ومبلغ ضئيل جداً من الخرز لمنع تجانس غير فعالة. - تحميل أنابيب عينة في الخالطون خلاط (انظر دال/6 في الجدول للمواد). تعيين جهاز ضبط الوقت إلى مستوى 2 دقيقة وسرعة 6، والبدء في تحقيق التجانس. بعد تشغيل، تجانس العينات للتجانس الكامل وتكرار دورة حتى العينات بشكل كامل الاختيار (الشكل 3ب).
ملاحظة: يمكن تجانس ما مجموعة 24 عينة أنابيب في تشغيل واحد. من المهم أن تبقى العينات الباردة أثناء إجراء التجانس للتقليل من تمسخ البروتين. الخالطون خلاط الرصاصة المستخدمة في هذه الدراسة على ميزة تبريد متأصلة التي تحافظ العينات الباردة. في الحالات التي يكون فيها لا ميزة التبريد الداخلية المتوفرة في الخالطون، يمكن الاحتفاظ بعينات على الجليد بين كل تشغيل. - بدقة "الماصة؛" هوموجيناتي في أنابيب ميكروسينتريفوجي الطازجة. الطرد المركزي عينات 10,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه البروتينات غير قابلة للذوبان والمادة طافية منفصلة تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان. بدقة "الماصة؛" من المادة طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة دون لمس الطبقة بيليه (الشكل 3ج).
ملاحظة: ويمكن تخزين المادة طافية وبيليه في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
4-بيليه الهضم
- إضافة 200 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت 2 ألف و 5 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل لكل عينة بيليه. تعليق بيليه عدة مرات مع ماصة.
ملاحظة: مزيج من الكواشف استخراج جيدا قبل إضافة إلى بيليه. تبقى 2A المخزن المؤقت الاستخراج على الجليد ومثبط البروتياز في الرايت طوال فترة الإجراءات استخراج. -
استخدام الخالطون الموجات فوق الصوتية لمجانسة بيليه تماما.
- تعيين السعة إلى 60 ودورة إلى 1. استخدام مجس مصنوعة من التيتانيوم (Ø 0.5 مم، طويل 80 مم)، الذي مناسبة لتجانس العينات بكميات صغيرة (10-500 ميليلتر).
- تزج المسبار في خليط المخزن المؤقت بيليه، واستخراج واضغط على زر ابدأ لتعريض العينة للموجات فوق الصوتية.
- Sonicate العينة حتى يتم تجانس كتل بيليه تماما. إيقاف مؤقت لبضع ثوان بين كل سونيكاتيون.
- إكمال التحقق من تجانس بصريا. مزيج من هوموجيناتي عدة مرات مع ماصة لضمان عدم وجود لا كتل.
ملاحظة: ينبغي أن تنفذ إجراءات استخراج بيليه على الجليد لمنع تمسخ البروتين بسبب الحرارة المتولدة أثناء التجانس (الشكل 4).
5-أخذ عينة من التنظيف والمخزن المؤقت Exchange
- استخدام أجهزة الطرد المركزي تصفية مع كاتشين 3 قطع (انظر D3 في الجدول للمواد) لهذا الإجراء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات حسب الاقتضاء. أولاً، إدراج وحدة التصفية في أنبوب ميكروسينتريفوجي (المتوفرة في حزمة التصفية).
- "الماصة؛" 200 ميكروليتر من عينة هوموجيناتي إلى جهاز عامل تصفية واحد وإضافة 200 ميليلتر من المياه إلى عامل التصفية نفسه. بشكل أمن في آب (الشكل 5ألف).
- ضع وحدة التصفية إلى أجهزة الطرد المركزي وتدور على 14,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة الجهاز من أجهزة الطرد المركزي وفصل وحدة التصفية التي تحتوي على تركيز العينة من أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على فيلتراتي. تجاهل فيلتراتي (الشكل 5ب).
- إعادة تشكيل الركاز بإضافة 400 ميليلتر من المياه إلى وحدة التصفية. كرر الخطوات من 5.3 و 5.4 ثلاث مرات. بدقة "الماصة؛" تركيز العينة 'تنظيف' إلى microtube نظيفة.
ملاحظة: عادة، سوف تسفر عن عينة النفط خام 200 ميليلتر ~ 50-70 ميليلتر تركيز بعد الترشيح. - كرر الخطوات 5، 1-5، 5 هوموجيناتيس العينة المتبقية.
6-البروتين القياس
- استخدام مقايسة البروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك كيت (انظر B5 في الجدول للمواد) لتحديد تركيزات البروتين من كسور نماذج sPCA المادة طافية وبيليه على قارئ لوحة.
- إعداد تخفيف الزلال (BSA) القياسية (جيش صرب البوسنة النهائي تركيزات تتراوح بين 25 إلى 2,000 ميكروغرام/ملليلتر) من امبول 1 مل واحد يتألف من 2 مغ/مل جيش صرب البوسنة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- "الماصة؛" 10 ميليلتر لتمييع القياسية كل جيش صرب البوسنة وعينه يتطابق (المادة طافية وبيليه) إلى كل من الميكروسكوبية 96-جيدا مسطحة القاع جيدا.
- إعداد اتفاق التعاون الأساسي يعمل كاشف عن طريق إضافة أجزاء 50 من "اتفاق التعاون الأساسي الكاشف" A إلى الجزء 1 من "اتفاق التعاون الأساسي كاشف باء"
ملاحظة: حساب الحجم الإجمالي للكاشف العامل المطلوب لكل قياس قبل الإعداد وإعداد حجم كاف على أساس عدد العينات وتخفيف الموحدة يكون جزيئي طازجة. - بدقة "الماصة؛" 200 ميليلتر من اتفاق التعاون الأساسي يعمل الكاشف في كل بئر. تغطية ميكروسكوبية واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تبريد اللوحة إلى RT، قياس امتصاص في 562 نانومتر على قارئ لوحة (انظر D13 في الجدول للمواد).
- استناداً إلى منحنى القياسية التي تم إنشاؤها لكل تركيز جيش صرب البوسنة الموحدة (ميكروغرام/مل)، تحديد تركيزات بروتين العينات.
7-أحادي البعد هلام استشراد (1DE)
- إعداد العينات ل 1DE كما هو مبين في الجدول 1 (لنموذج واحد). مزيج الخليط العينة جيدا مع ماصة. الحرارة العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وباردة إلى الرايت
- إعداد 1 × تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة 50 مل من "مس الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت" إلى منزوع 950 مل من الماء. مزيج جيد.
-
إعداد الخرسانة الجاهزة 4-12% مكررا-تريس البروتين الجل (انظر B4 في الجدول للمواد).
- قص فتح الحقيبة البلاستيكية إزالة كاسيت جل وشطف الكاسيت مع المياه.
- إزالة المشط من كاسيت جل في حركة السوائل واحدة، مع الحرص على عدم الأضرار الآبار.
- شطف الآبار تحميل 2-3 مرات مع 1 × تشغيل المخزن المؤقت باستخدام ماصة لطف. عكس وهزه بلطف في الكاسيت جل لإزالة المخزن المؤقت، والتأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء في الآبار.
- قم بإزالة الشريط الأبيض في الجزء السفلي من أشرطة الكاسيت هلام.
- إدراج المواد الهلامية (أشرطة الكاسيت اثنين كحد أقصى) في جل تشغيل الدبابات ومجرد تجميع تماما، قفل هلام الاسفين التوتر.
- تعبئة المخزن المؤقت العلوي (الكاثود) الدائرة مع 200 مل من "المخزن المؤقت قيد التشغيل" حتى يتم تغطية الآبار تماما. التحقق من وجود أي تسرب.
- إضافة 500 ميليلتر من مضادات الأكسدة (انظر A14 في الجدول للمواد) إلى "المخزن المؤقت قيد التشغيل".
ملاحظة: مضادات الأكسدة هي كاشف ملاءمة التي يجب أن تستخدم مع عينات خفضت مع الفلزي (انظر الجدول 1) للحفاظ على شروط الحد أثناء التفريد ومنع إعادة-أكسدة الأحماض الأمينية الحساسة مثل التربتوفان و الميثيونين. - تحميل 50 ميكروغرام للعينة الواحدة وحارة باستخدام ماصة عناية. ثم تحميل القياسية البروتين ملطخة مسبقاً كعلامة كتلة جزيئية (انظر A18 في الجدول للمواد).
- ملء المخزن المؤقت (اﻷنود) مجلس النواب مع 600 مل من "تشغيل المخزن المؤقت".
- تشغيل المواد الهلامية ل ~ 60 دقيقة في جهد مستمر من 175 الخامس. في نهاية الشوط، بعناية إزالة الجل من لوحة كاسيت باستخدام سكين هلام.
-
نقل المواد الهلامية بعناية في جل تلطيخ مربع.
- إعداد الحل تحديد جديدة استناداً إلى العدد الإجمالي للمواد الهلامية التي تحتاج إلى أن تكون الملون، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح في الجدول 2.
- هزة في gel(s) في الحل تحديد لمدة 10 دقائق في الرايت على منصة هزاز.
-
تجاهل تحديد الحل ووصمة عار الجل مع "الأزرق الغروية" تلطيخ كيت.
- إعداد المصبوغة الطازجة الحلول استناداً إلى العدد الإجمالي للمواد الهلامية التي تحتاج إلى أن تكون الملون، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح في الجدول 3.
- أولاً، قياس حجم مناسب وخلط المكونات علامة نجمية (*) في جل تلطيخ مربع مباشرة. هزة في gel(s) في الحل المصبوغة دون "الملطخ ب" لمدة 10 دقائق في الرايت على منصة هزاز.
- إضافة "ب الملطخ" مباشرة في مربع المصبوغة التي تتضمن * تلطيخ الحل. تأكد من أن يهز الملطخ ب جيدا قبل استخدامها.
تنبيه: القيام بخطوات إعداد 7.10.1 و 7.11.1 تحت غطاء دخان.
- هزة في gel(s) في الحل المصبوغة بين عشية وضحاها للحصول على أفضل النتائج الإجمالية.
ملاحظة: سوف تصبح العصابات ملطخة مرئية داخل 10 دقيقة بعد إضافة "الملطخ ب تلطيخ" يتطلب حدا أدنى ح 3 ولا تختلف الشدة إذا ما تركت لساعات أطول في الحل المصبوغة. - صب الحل المصبوغة واستبدال مع 200 مل مياه بعناية. هزة gel(s) لمالا يقل عن 7-8 ح في الماء لمسح الخلفية.
ملاحظة: يجب تغيير المياه عدة مرات أثناء إجراء ديستينينج لأفضل إزالة وصمة عار المفرط. كما يمكن ترك في gel(s) في المياه لمدة 3 أيام دون المساس بكثافة الفرقة البروتين. إذا كان gel(s) لا تخضع إلى الخطوات التالية فورا، يمكن تخزينه في محلول كبريتات الأمونيوم 20% عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
8-في جل تريبتيك الهضم
ملاحظة: هذا البروتوكول وفقا للأسلوب شيفتشينكو et al.17، مع تعديلات طفيفة. ينبغي أن يتم هذا الإجراء في تدفق الصفحي هود واستخدام مجموعة مخصصة من الماصات، ونصائح، وأنابيب، والأواني الزجاجية خصيصا لهذا الغرض. ارتداء قفازات وملابس مناسبة مختبر في جميع الأوقات لمنع الكيراتين والتلوث الأخرى. إعداد جميع الحلول والكواشف المستخدمة في هذا الإجراء قبل وقت قصير من استخدام.
- المكوس نطاقات البروتين من الجل مع شفرات مبضع نظيفة وجديدة. قطع الفرقة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 مم × 1 مم إلى 2 مم × 2 مم). نقل القطع جل بعناية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب.
ملاحظة: قطعة صغيرة جداً يمكن أن تسد نصائح ماصة والقطع الكبيرة سوف يقلل الانتعاش الببتيد. توخي الحذر عند استخدام شفرات مبضع، وحادة جداً. -
ديستينينج
- إضافة 500 ميكروليتر من محلول ديستينينج يحتوي على 100 مم أي بي سي حل/تزاول (1:1، v/v)، واحتضان عينات RT لمدة 30 دقيقة مع الهز عرضية أو فورتيكسينج.
- ماصة بعناية حل ديستينينج. تحقق من وجود بصريا أي أنابيب مع وصمة عار المتبقية. كرر الخطوة 8.2.1 إذا قطع جل ما زالت ملطخة الأزرق.
-
الحد والالكله
- إضافة ~ 400 ميليلتر من الطازجة DTT الحل واحتضان في 56 درجة مئوية للتأكد من أن الحل الذي يغطي تماما قطع جل 30 دقيقة. "الماصة؛" حل الحد وتجاهل بعناية.
- إضافة ~ 400 ميليلتر الطازجة إلى حل الأكاديمية واحتضان في الظلام على RT للحد الأدنى 30 إزالة الكيلاتينج المخزن المؤقت مع ماصة وتجاهل.
-
الهضم
- إضافة 500 ميليلتر من تزاول أنيق في RT لمدة 10-15 دقيقة حتى القطع جل تتقلص وتصبح معتمة. "الماصة؛" بها تزاول وأيردري هلام القطع لمدة 5-10 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من حل التربسين في كل أنبوب تغطي كامل القطع هلام. احتضان هذه الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة، تحقق كل أنبوبة إذا كان قد تم استيعاب جميع التربسين الحل بالقطع هلام. إضافة حجم المخزن المؤقت التربسين (50-100 ميليلتر، تبعاً للحجم في الأنبوب) كافية تغطي كامل القطع هلام، إذا لزم الأمر. احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
-
استخراج الببتيد
- بدقة "الماصة؛" الحل الببتيد المستخرجة من أنابيب ونقل لتنظيف microtubes. تجف المادة طافية في مبخر فراغ الطرد مركزي.
ملاحظة: عدم تجاهل جل القطع المتبقية. - إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج (راجع الخطوة 1، 7) لكل أنبوب واحتضان مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- "الماصة؛" المادة طافية في microtubes نفسه الذي يحتوي على الببتيدات المستخرجة وفقا للشرائط الخاصة بكل منها والجافة إلى أسفل في فراغ للطرد مركزي.
ملاحظة: إذا لم تستخدم مباشرة، يمكن تخزين مقتطفات الببتيد المجففة في-20 درجة مئوية تصل إلى عدة أشهر حتى استخدامها مرة أخرى.
- بدقة "الماصة؛" الحل الببتيد المستخرجة من أنابيب ونقل لتنظيف microtubes. تجف المادة طافية في مبخر فراغ الطرد مركزي.
9-الببتيد تنقية
ملاحظة: هذا الببتيد عينة الملحي وتنقية الإجراءات تتم باستخدام تلميحات ماصة18 ج (انظر C15 في الجدول للمواد). استخدام تلميح جديد لكل عينة.
- إعداد الطازجة الحلول التالية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية وقاسمه في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل للإجراء تنقية الببتيد، كما هو مبين في الجدول 4. موجز للأنابيب لتنقية الببتيد كما يلي: أنبوب (حل نموذج)، الأنبوب ب (المحلول المرطب)، أنبوب ج (الحل الموازنة)، مد أنبوب (محلول الغسيل)، أنبوب ه (محلول شطف)، و أنبوب (فارغة 2 مل أو 5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب، اعتماداً على عدد العينات تنظيفها، للتخلص من النفايات)، و "أنبوب ز" (microtube نظيفة وفارغة، قدرة 0.2 مل).
- إعادة تشكيل ببتيد المجففة مقتطفات من الخطوة 8.6.3 مع 10 ميليلتر من 0.1% تفا. يتم تعيين هذا الأنبوب أنبوب ألف
- Sonicate الأنابيب A في حمام الموجات فوق الصوتية مع الجليد لمدة 5 دقائق.
- تدور أسفل الحل عينة في benchtop أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- مجموعة من ميكروبيبيتي P10 لتحديد الحد الأقصى لحجم 10 ميليلتر وإرفاق تلميح ماصة18 ج بشكل أمن.
- تزج طرف الماصة في المحلول المرطب (الأنبوب ب) ونضح بعناية في مواد التعبئة. ببطء الاستغناء عن النفايات في "أنبوب ف. كرر" هذه الخطوة 7-8 مرات على الأقل.
ملاحظة: خفض المكبس ماصة لحد ميت والإفراج ببطء أو الاستغناء عن الغطاس طوال فترة الإجراءات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لعدم إدخال فقاعات الهواء إلى النصائح أثناء بيبيتينج لضمان ربط الحد الأقصى الببتيد إلى عمود C18. - حجته في التلميح لربط الببتيد يسفط 10 ميليلتر الموازنة الحل في أنبوب جيم تجاهل الحل وكرر هذا الإجراء من 3 إلى 4 مرات.
- المقبل، ونضح والاستغناء عن الحل العينة في أنبوب A عدة مرات (حسب سمك الفرقة جل المقابلة) لربط الببتيدات نصيحة العمود.
تنبيه: وتنفذ بالطموح والاستغناء عن الخطوات أثناء إجراء ملزم (الخطوة 9.8) داخل أنبوب ألف عدم الاستغناء عن الحل عينة للنفايات. - يغسل طرف ماصة18 ج يسفط الحل الغسيل في "مد الأنبوب" والتخلص من النفايات (و أنبوب) 4 إلى 5 مرات.
- وأخيراً، الوت الببتيدات منضم بيبيتينج الحل شطف (أنبوب ه) والاستغناء عن الوانت في أنبوب غ.
- كرر الخطوات كاملة 2 إلى 3 دورات لكل عينة لزيادة استعادة عينة.
- تجاهل هذه المعلومة بعد تنقية عينة واحدة واستخدام تلميح جديد للعينة التالي.
- جاف الواتيس الببتيد المنقاة في مركز فراغ.
ملاحظة: العينات النقية جاهزة الآن لتحليلات LC-MS/MS في نظام MS LC-ESI-لتق-أوربيتراب. تخزين العينات المجففة في-20 درجة مئوية إلى استخدامها مرة أخرى.
10. السائل اللوني-اليكتروسبراي "تحليلات" التأين-MS/MS
ملاحظة: يتم إجراء التحليل البروتيوميات خالية من تسمية الكمية على نظام MS تاين خطية فخ أيون-أوربيتراب (LC-ESI-لتق-أوربيتراب) اليكتروسبراي لوني سائل. قانون العمل تتكون من مضخة اليجرو روس رباعي مجهزة ديجاسير على شبكة إنترنت (بالإضافة إلى أوتوسامبلير بال HTS، ويشمل النظام 30 مم × 0.5 مم ج18 قبل عمود متصل بعمود18 150 مم × 0.5 مم ج. استخدام عكس المرحلة ألف المذيبات المائية تتكون من LC-MS الصف المياه مع حمض الفورميك 0.1% (v/v) وب المذيبات العضوية تتألف من LC-MS الصف الاسيتو الانيتريل مع حمض الفورميك 0.1% (v/v). استخدام التدرج مع وقت تشغيل من 60 دقيقة لكل الفرقة هلام، كما هو موضح بالتفصيل في موقعنا6،الدراسات السابقة16.
- حل العينات النقية الببتيد في 10 ميليلتر من 0.1% تفا. Sonicate العينات على الجليد لمدة 5 دقائق.
- "الماصة؛" 10 ميليلتر عينات في لوحة 96 الخامس-أسفل بئر وختم مع فيلم تغطية واضحة وذاتية اللصق.
- نقل اللوحة إلى أوتوسامبلير.
- استخدام التدرج التالي لكل وقت تشغيل 60 دقيقة: 0-35 دقيقة (15-40 ٪ مذيب ب) 35-40 دقيقة (المذيب ب من 40-60 في المائة)، 40-45 دقيقة (60-90 ٪ مذيب ب)، 45-50 دقيقة (المذيبات 90% ب)، 50-53 دقيقة (90-10 ٪ مذيب ب) و 53-60 دقيقة (10 ٪ مذيب ب).
- استخدام الشروط التالية كتلة والمطيافيه الصك: أيون إيجابية اليكتروسبراي التأين الوضع، الجهد رذاذ (2.15 كيلو فولت)، الشعرية درجة الحرارة (220 درجة مئوية)، اقتناء البيانات تعتمد على الوضع، واقتناء التلقائي التبديل بين أوربيتراب--مرض التصلب العصبي المتعدد و لتق MS/MS، القرار أوربيتراب (30,000)، ومجموعة m/z (300 إلى 1,600)، تلقائي الهدف السيطرة (AGC، 1.0 × 106 أيونات)، تقويم داخلية (بوليديميثليسيكلوسيلوكساني [PCM] في الأيونات m/z 445.120025 في الوقت الحقيقي)، وتأمين أسلحة الخيار تمكين في وضع مرض التصلب العصبي المتعدد، جنبا إلى جنب البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تحديد الخمسة الأوائل الأكثر كثافة الأيونات السلائف وكذلك تجزئة بالتفكك الناجمة عن تصادم (CID)، طبعت الاصطدام الطاقة (الامتحانات التنافسية الوطنية، 35% مع وقت التنشيط من 30 مللي ثانية مع عدد مرات التكرار من 3)، ومدة الإقصاء الحيوي (600 s).
ملاحظة: الأيونات المجزأة الناتجة مسجلة في لتق. - يعيد التشغيل البيولوجية ثلاثة على الأقل لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توافر عينة محدودة واحدة من العقبات الرئيسية في أبحاث العيون. وفي المقابل، تعطي أساليب الاستخراج للبروتين المثلى من كميات صغيرة من عينات مثل الأوعية الدموية العين غالباً ما تكون قابلة للنقاش. وحتى الآن، هناك ندرة في أساليب خاصة لاستخراج البروتين من الأوعية الدموية خلف المقلة. ولذلك، كخطوة أولى في الأسلوب الأمثل وإثبات مبدأ لمقارنة فعالية ومتانة من عدة عادة تستخدم المنظفات استخراج البروتين إلى كاشف جديد نسبيا، تي-الواحد، قمنا بتنفيذ دراسة تجريبية باستخدام أنسجة القلب من الفئران (بسبب توافر نماذج سهلة وكافية لخطوات التحسين). قارنا العائد البروتين بمقارنة تركيزات البروتين الكلي ومجموع البروتينات المحددة باستخدام الكواشف التالية: T-الواحد، 0.02% n-دوديسيل-β-د-مالتوسيدي (DDM)، 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-ديميثيلامونيو]-1-فلورو أوكتان المشبع البروبان (الفصول)، 1% أميدوسولفوبيتايني-14 (المجلس-14) وهي مزيج من ACN وتفا (20% تزاول/1% تفا). المبلغ الإجمالي للبروتينات في العينات المستخرجة مع كل من هذه المنظفات كما هو مبين في الشكل 6A، مع عائد أعلى من الأنسجة المستخرجة مع تي-الواحدة (56.4 ميكروغرام/mg الأنسجة)، تليها DDM (ميكروغرام/mg 22.88 الأنسجة)، الفصول (16.01 ميكروغرام/ملغ الأنسجة)، المجلس-14 (11.56 ميكروغرام/mg الأنسجة) وعائد أدنى من تزاول/تفا (4.38 ميكروغرام/mg الأنسجة). دائماً، أن مجموع البروتينات المحددة كانت أيضا هي أعلى نسبة في العينة T في المستخرج (1649 البروتينات) > DDM (البروتينات 1310) > الفصول (1319 البروتينات) > المجلس-14 (البروتينات 1121) > تزاول/تفا (924 البروتينات)، كما هو موضح الشكل 6ب. وبناء على هذه النتائج، أننا تقدمنا باستخراج البروتين من عينات sPCA مع تي-الواحدة.
المقبل، الأمثل لنموذج إعداد البروتوكولات قبل وجود ما قبل في 1DE خطوة حاسمة جداً للحصول على نطاقات البروتين المنفصلين جيدا والنتائج استنساخه بدرجة عالية بين العينات و replicates. يعكس أهمية هذه الخطوات وسلط الضوء على نتائج 1DE. يبين الشكل 7 مقارنة ملامح sPCA البروتين 1DE قبل وبعد التعرض لإعداد نموذج أمثل وتنظيف الخطوات. عموما، وعلى درجة عالية من الانفصال تلطيخ والفقيرة لنطاقات البروتين لوحظ في حارة 3. هذا التشكيل الجانبي يوضح أن العينات قد يحتوي على الكاشف الاستخراج والملوثات مثل الدهون والحطام الخلوية أيضا. بيد sPCA العينات التي تم فصل في المادة طافية وبيليه و، تعرض لأمثل البروتوكول أسفرت عن الملامح المثالية 1DE، ممثلا في حارة 1 و 2 (الشكل 7).
في فريق دعم المعلومات الجغرافية، استناداً إلى هذه النتائج، واعدة تستخدم الأسلوب الأمثل لاستخراج البروتين للذوبان السريع، وقوية وفعالة من ميكروفيسيلس العين كاشف استخراج البروتين الأنسجة (T-الواحدة) واستخدام "المخزن المؤقت لاستخراج" 2A (TM-بيك) لاستخراج غشاء نسيجي البروتينات الموجودة في العينة بيليه. عينة في وقت لاحق، هوموجيناتيس (ت-كل جزء) يتعرضون للصرف المخزن المؤقت وعينه التنظيف مع وحدات الطرد المركزي تصفية كاتشين 3 قبل 1DE. أن تركيز العينة الأمثل هو 50 ميكروغرام كل بئر. من ناحية أخرى، فلا تكون أبرز هنا أن هذا البروتوكول لا ينطبق على أنسجة صغيرة مثل الأوعية الدموية فقط، ولكن من الممكن أيضا للعينات الأخرى المستندة إلى الأنسجة. ويتضح ذلك من ملامح 1DE مورين المخ وأنسجة القلب، مما يدل على أن هناك أعدادا كبيرة من البروتينات التي يمكن أن تستخلص من المادة طافية (الشكل 8أ، ب) والكسور بيليه(الشكل 8ج، د ).
الشكل 1 : نظرة عامة على سير العمل. تمثيل تخطيطي للبروتوكولات المستخدمة لتحليل البروتين خالية من تسمية الكمية من sPCA الخنزيري. بشكل عام، وهذا الإجراء ينقسم إلى قسمين رئيسيين تتألف من خطوات إعداد عينة ميكروفيسيل والنهج المستندة إلى MS البروتيوميات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صور الممثل لعيون الخنزير- الجانبية (أ) عرض من العين ويظهر العالم القرنية، التي تقع في الجزء الأمامي من العين والصلبة العينية، المحيطة العضلات والعصب البصري. الخلفي (ب) عرض من عروض العين العصب البصري. (ج) فروع sPCA ينظر في الجزء الخلفي من أنحاء العالم العين تتألف من باراوبتيك والفروع البعيدة. (د) sPCA معزولة مع المحيطة بالدهون والأنسجة الضامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تجانس العينة. الممثل صوراً تظهر العينة (A) قبل و (ب) بعد التجانس. كذلك تم فصل العينات (ج) المتجانس في المادة طافية المحتوية على البروتينات القابلة للذوبان وبيليه المحتوية على البروتينات غير قابلة للذوبان، والمستندة إلى ترانسميمبراني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : بيليه إجراءات استخراج البروتين. من أجل منع تمسخ البروتين، يتم استخراج عينات بيليه على الجليد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تنظيف العينة. يجري تبادل المخزن المؤقت مع كاتشين 3 مرشحات الطرد المركزي قطع لتنظيف العينات قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. صور الممثل عرض هوموجيناتي (A) قبل و (ب) بعد الترشيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : مقارنة بين كفاءة استخراج البروتين ومتانة بين تي-الواحدة وأربعة المنظفات استخراج البروتين المشتركة. التخطيطات الشريطية التي تصور كميات البروتين (أ) و (ب) العدد الإجمالي للبروتينات وحدد استخدام T-الواحد، 0.02% DDM، الفصول 1 ٪، 1 ٪ المجلس-14 و 20% تزاول/1% تفا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : 1DE الممثل جل من الملامح sPCA بروتين الخنزير قبل وبعد التحسين- 3 لين يصور الشخصية 1DE من العينة التي لم تتعرض لأي قبل تنظيف الخطوات. لين 1 و 2 تظهر ملامح البروتين المثالي sPCA طافية وبيليه، على التوالي، بعد إخضاع هذه العينات لإعداد النموذج الأمثل، وتنظيف الخطوات. كان جل ملطخة بالأزرق الغروية تلطيخ كيت. M = علامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : جل الممثل 1DE الغروية ملطخة باللون الأزرق لعينات نموذجية تستند إلى الأنسجة. التشكيلات الجانبية للبروتين من المادة طافية (أ وب) وبيليه (ج، د) من أنسجة القلب والمخ مورين عينات، على التوالي، في 50 ميكروغرام كل بئر. تم استخراج البروتينات المادة طافية وبيليه فئة T-الواحدة و transmembrane استخراج البروتين كيت، على التوالي. M = علامة. R1--R3 تمثل replicates الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المكون | وحدة التخزين (ميليلتر) |
| عينة (المادة طافية أو بيليه) | x |
| عينة LDS المخزن المؤقت (4 x) | 2.5 |
| الفلزي (10 x) | 1 |
| المياه. | يصل إلى 6.5 (تبعاً لحجم العينة) |
| بلغ إجمالي حجم كل عينة | 10 |
| ملاحظة: x يحسب أساس على تركيز البروتين (50 ميكروغرام مجموع البروتين للعينة). | |
الجدول 1:1 الأبعاد هلام استشراد (1DE)- تفاصيل المكونات المطلوبة لإعداد نموذج لأداء 1DE.
| الحل | لجل 1 (mL) | للجل 2 (mL) | للهلام 4 (mL) |
| المياه. | 40 | 80 | 160 |
| ميثانول | 50 | 100 | 200 |
| حمض الخليك | 10 | 20 | 40 |
الجدول 2: تثبيت جل. تفاصيل المكونات المطلوبة لإعداد تحديد الحل 1DE.
| الحل | لجل 1 (mL) | للجل 2 (mL) | للهلام 4 (mL) |
| * المياه. | 55 | 110 | 220 |
| * الميثانول | 20 | 40 | 80 |
| * الملطخ A | 20 | 40 | 80 |
| الملطخ ب | 5 | 10 | 20 |
الجدول 3: تلطيخ جل. تفاصيل المكونات لإعداد "الأزرق الغروية" تلطيخ الحل.
| الحل (على) | تكوين | تزاول * * | H2O * * | تفا | مجموع حجم * |
| ترطيب | تزاول 100% | 2 مل | 2 مل | ||
| #Washing والموازنة | 0.1 تفا % | 10 مل | 10 ميليلتر | ~ 10 مل | |
| شطف الببتيد | 0.1% تفا في التشكيل = تزاول: H2O | مل 6 | 4 مل | 10 ميليلتر | ~ 10 مل |
| ملاحظة: * الحجم الإجمالي ينبغي أن تعدل وفقا للعدد الإجمالي للعينات التعرض "الرمز البريدي نصيحة" التنظيف. | |||||
| * * استخدام [هبلك]-الصف أو LC-مرض التصلب العصبي المتعدد-الصف. | |||||
| # إعداد اثنين من أنابيب ايبندورف منفصلة للغسيل والموازنة، على التوالي. | |||||
الجدول 4: تنقية الببتيد. تفاصيل المكونات وعلى التراكيب كل منهما للإجراء تنقية الببتيد باستخدام النصائح ماصة18 ج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنميط البروتين شاملة لمجموعة متنوعة من عينات العين خطوة أولى هامة ولا غنى عنها لتوضيح الآليات الجزيئية ومسارات مما يشير إلى تورط في الصحة والمرض. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة، وضمان إمكانية تكرار نتائج للنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التحليلات، خطوات إعداد العينة السابقة بالغة الأهمية، كما هو مبين في استعراض قبل Mandal et al. أن مناقشة متعمقة إجراءات تجهيز العينة لأجزاء مختلفة من العين توظيف جل ثنائي الأبعاد التفريد ووسائل قياس الطيف الكتلي الاستراتيجية1. في خط هذه التحقيقات، يوفر دراستنا الحالية على بروتوكول خطوة بخطوة أمثل لإعداد عينة سريعة وقوية وذات كفاءة عالية المتوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام sPCA الخنزير كنموذج ميكروفيسيلس العين. وبدأ هذا التحقيق بعد قلة منهجية محددة لاستخراج كميات كافية من البروتينات من عينات الشرياني كمية محدودة لتوليد بيانات MS عالية الجودة. أسلوبنا هو أيضا مسعى للمساهمة في مجموعة المعارف المتعلقة باستخدام تقنيات الصغرى التي تمكن من رسم الخرائط البروتين ممتاز18القائمة.
وهناك العديد من الجوانب الهامة في هذا البروتوكول التجريبي، بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار لتحقيق الأداء الأمثل لتحليل كمية البروتين. أولاً، من المهم أن العينات، بغض النظر عن المبالغ، يتعرضون للتجانس الكامل لضمان استخلاص البروتين المثلى. في منهجيتنا، استخدام خليط من حبات مختلفة الحجم والخالطون خلاط الرصاصة كان فعالاً لتحلل الأنسجة كاملة. نوع وحجم الخرز المستخدمة تعتمد على نوع العينة وكميتها. هي مناسبة للأنسجة المتوسطة-صعبة الخرز مع كثافة أعلى، مثل زرو2 المستخدمة حاليا، والفولاذ المقاوم للصدأ، وعملت بشكل جيد خاصة للأوعية الدموية.
ثانيا، من الضروري فصل المادة طافية من بيليه، وإخضاع هذا الأخير الهضم والاستخراج باستخدام مجموعة محددة. تعد هذه الخطوة المحورية لاستخراج البروتينات المرتفعة الوزن الجزيئي مثل البروتينات transmembrane، التي يصعب من مجانسة استخدام المنظفات معتدل19،،من2021على خلاف ذلك. أفضل حل سرع بيليه باستخدام سونيكيشن لتجنب الخسارة عينة من البداية إلى أعلى عرض خلال الانفعالات قوية أو تهتز أساليب.
ثالثا، جدير بالذكر أن جميع إجراءات إعداد نموذج تتم في درجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية)، ما لم يرد خلاف ذلك في المنهجية. وهذا لضمان تمسخ البروتين الحد الأدنى أثناء إجراءات استخراج. وينبغي تجنب الرابعة، وتكرار التجميد-ذوبان الجليد من عينات لمنع تدهور البروتين وتدهور نوعية العينات.
وأخيراً، إزالة الملوثات والمنظفات ضروري بعد استخراج البروتين لمنع تدخل المصب في أثناء وجود في جل والهضم الأنزيمي، ومرض التصلب العصبي المتعدد تحليل18،22. وكثيراً ما تتداخل مع قرار فصل الغرواني الكهربي هذه الملوثات والتأثير تصور النتيجة، في المقابل، كما هو مبين في التشكيل الجانبي 1DE (الشكل 7). للالتفاف حول هذه المسألة، هو يفضل استخدام أجهزة الطرد المركزي تصفية استقطاع لسهولة الاستخدام وفقدان الحد الأدنى من البروتين.
على الرغم من أن الإجراءات التجريبية الحالية توفير نظرة متعمقة في خطوات إعداد نموذج هام لتحليلات MS خالية من تسمية الكمية المثلى، هناك قيود اثنين. أولاً، تم تجميع عينات sPCA من عينان الخنزير توفير كميات كافية من الأنسجة لتحليلها لاحقاً. أن العيون التي تم الحصول عليها من المسالخ المحلية هي عشوائية وذلك، ولا يعرف إذا كان يتم عزل الأوعية الدموية من عيون الحيوان نفسه، تجمع عينة يخفف الاختلافات الفردية بين5،6. ومع ذلك، يمكن أيضا تكييف المنهجية الحالية لإعداد نموذج الفردية اعتماداً على مقدار العينات المتوفرة. ثانيا، وضعت منهجية المقدمة خصيصا لتجزئة القائم على جل 1DE. على الرغم من أن توافق الأسلوب الحالي للتكامل مع أعلى إلى أسفل، ووجود طرق أخرى تستدعي التحقيق، اخترنا 1DE نظراً لعوامل عديدة تتراوح من إمكانية تكرار نتائج جيدة، تيسيرا لمراقبة الجودة لأفضل عمق التحليلات ، خاصة بالنسبة للعينات المعقدة مثل ال5،1،الأوعية الدموية العينية المتمثلة حاليا23.
وفي الختام، رغم أوجه القصور المشار إليها أعلاه، وصف سير العمل يمثل نهجاً بسيطة لكنها قوية لخطوات إعداد عينة صارمة تهتم على وجه التحديد لتحليل كمية صغيرة من الأوعية الدموية. من المهم أيضا أن أسلط الضوء هنا على أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون متكاملة يسهل تحليل البروتين البشري الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي للعينات الأخرى قائم على الخلايا والأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم الدكتور مانيكام "الداخلية جامعة أبحاث التمويل" (1 ستوف) من "المركز الطبي الجامعي" في "يوهانس جوتنبرج جامعة ماينز" ومنحة من الأوقيانوغرافية ألماني (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H.
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I.
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
