Summary
Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.
Abstract
O uso isolado ocular vasos sanguíneos in vitro para decifrar o estado fisiopatológico do olho usando abordagens tecnológicas avançadas expandiu-se enormemente nossa compreensão de certas doenças. Espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics surgiu como uma ferramenta poderosa para desvendar as alterações nos mecanismos moleculares e proteínas de sinalização de percursos nas camas vasculares na saúde e na doença. No entanto, etapas de preparação de amostra antes MS análises são cruciais para obter resultados reprodutíveis e elucidação em profundidade o complexo proteome. Isto é particularmente importante para a preparação de microvessels ocular, onde a quantidade de amostra disponível para análise é muitas vezes limitada e assim, representa um desafio para a extração de proteína ideal. Este artigo visa fornecer um protocolo eficiente, rápido e robusto para a preparação da amostra de um leito vascular ocular retrobulbar exemplar empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares. O presente método concentra-se nos procedimentos de extração da proteína do sobrenadante e sedimento da amostra após a homogeneização, limpeza com dispositivos de filtro centrífugo antes unidimensional gel de eletroforese e peptídeo purificação da amostra passos para a quantificação de rótulo livre num sistema MS Orbitrap-ion trap linear-ionização electrospray-cromatografia líquida. Embora este método foi desenvolvido especificamente para proteomics análises de microvessels ocular, nós também fornecemos evidências convincentes de que pode também ser facilmente empregado para outras amostras de tecido com base em.
Introduction
O avanço no campo da proteômica, quais licenças integrado e insuperável poder de coleta de dados, extremamente tem revolucionado nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a certas condições de doença, bem como refletindo o estado fisiológico de uma célula específica população ou tecido1,2,3,4. Proteomics também provou para ser uma plataforma importante na pesquisa oftálmica devido a sensibilidade e a análise imparcial das diferentes amostras oculares que facilitou a identificação de potenciais marcadores de doença para eventual diagnóstico e prognóstico, como evidenciado elegantemente por muitos estudos nos últimos anos, incluindo alguns dos nossos1,5,6,7,8,9,10. No entanto, muitas vezes é difícil obter amostras humanas para análises de proteomic devido a razões éticas, especialmente considerando a necessidade de material de controle de indivíduos saudáveis para as análises comparativas confiáveis. Por outro lado, é também um desafio para obter a quantidade suficiente de amostras para análises de espectrometria de massa ideais e confiáveis. Isto é particularmente crucial para massa-limitada materiais biológicos como os microvasos do olho. Um tal vaso sanguíneo retrobulbar grandes que tem um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo ocular é a artéria ciliar posterior curta (sPCA). Qualquer perturbação ou anomalias nesta cama vascular podem resultar em graves repercussões clínicas, que podem levar à patogênese de várias doenças fatais vista como glaucoma e nonarteritic neuropatia óptica isquêmica anterior (NAION)11 , 12. no entanto, há uma falta de estudos para elucidar as mudanças proteome nesta cama arterial devido as desvantagens acima mencionadas. Portanto, nos últimos anos, os suínos de casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) emergiu como um bom modelo de animais na pesquisa oftálmica devido as altas semelhanças morfológicas e filogenéticas entre os seres humanos e suínos13, 14,15. Porcinos amostras oculares estão facilmente disponíveis e mais importante, são uma representação mais precisa de tecidos humanos.
Considerando o importante papel destes vasos sanguíneos nos olhos, bem como a escassez de metodologia servida para extração de proteínas eficiente e análises destes microvessels, nós anteriormente têm caracterizado a proteoma da sPCA suínos usando um in-house protocolo que resultou na identificação de um número elevado de proteínas16. Com base neste estudo, temos ainda mais otimizado e descrito em profundidade nossa metodologia neste artigo, o que permite a análise do proteoma de quantidades minuciosas de amostras usando o sPCA porcina como tecido de modelo. Embora o objetivo principal deste estudo foi estabelecer uma metodologia compatível com o MS para os vasos sanguíneos oculares de massa limitada, nós fornecemos substanciais evidências experimentais que o fluxo de trabalho descrito também pode ser amplamente aplicado a várias amostras de tecido-baseado.
Prevê-se que este fluxo de trabalho será fundamental para a preparação de amostras de alta qualidade compatível com o MS de pequenas quantidades de materiais para análises de proteome abrangente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais, utilizando amostras de animais foram realizados em aderência estrita para a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) declaração sobre a utilização dos animais em oftalmologia e visão pesquisa e pelas diretrizes institucionais. Este estudo foi realizado e aprovado no departamento de Oftalmologia, universidade médica centro de Mainz.
Nota: Porcinos olhos juntamente com o nervo óptico e extra-oculares tecidos foram obtidos frescas do matadouro local imediatamente post-mortem. Olhos sem núcleo foram transportados para o laboratório em soro fisiológico gelado tamponado de fosfato (PBS) e usados imediatamente. A visão esquemática do fluxo de trabalho empregado é como está representada na Figura 1.
1. soluções
- Para preparar a Krebs-Henseleit (K-H) de tampão, pesar os seguintes produtos químicos (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO3, 1,4 g de KCl, 1,18 g de MgSO4e 0,64 g de KH2PO4) em um tubo de centrifuga conico de 50ml limpo e seco e , 1,47 g de CaCl2 e 8,0 g de glicose em outro tubo.
Nota: A mistura de pó desses produtos químicos deve ser armazenada em local fresco e seco. A mistura de pó de CaCl2 e glicose é melhor preparada frescos para evitar a absorção de umidade e aglutinação. - Para preparar 200 µ l de 2A de tampão de extração por amostra do sedimento, mistura 100 µ l de extração buffer 2 e 100 µ l de Reagente A da extração da proteína do transmembrane kit (veja B6 na Tabela de materiais).
Nota: Alíquota uso prolongado os componentes do kit de extração de proteínas transmembrana composto por solução tampão 2, reagente A e coquetel de inibidor de protease em porções de trabalho e armazenamento a-20 º C para. Evite repetidos congelamentos e descongelamentos. Descongele os reagentes à temperatura ambiente (RT) antes do início do processo de extração da pelota. - Para preparar uma solução de bicarbonato de amónio (ABC, 100 mM), dissolva 0,39 g de ABC em 50 mL de água desionizada.
- Para preparar 10 mM 1, 4-ditiotreitol (DTT) solução, dissolver 30 mg de TDT em 20 mL de 100mm ABC.
- Para preparar a solução de Iodoacetamide (IAA) de 55 milímetros, dissolva 200 mg de IAA em 20 mL de 100mm ABC.
Nota: IAA deve ser mantido no escuro. Use uma folha de alumínio para embrulhar os tubos com soluções sensíveis à luz. - Preparar a solução tampão de tripsina com ABC de 10 mM e 10% (vol / vol) acetonitrila (ACN). Adicione 1,5 mL de tampão de tripsina em um frasco de 20 µ g de tripsina para dissolver seu conteúdo para preparar uma solução de trabalho de tripsina 13 ng / µ l.
Nota: Sequenciamento da classe modificada tripsina é fornecido liofilizada e deve ser armazenado em-20 ° C até o uso. - Para preparar a solução tampão de peptídeo, misture 1:2 (v/v) de ácido fórmico a 5% com o Grupo ACN.
Nota: Preparar todas as soluções em passos 1.3-1.7 fresco imediatamente antes da utilização e descarte qualquer volume não utilizado. - Para preparar a 0,1% o ácido trifluoroacético (TFA), misture 10 µ l de TFA com 10 mL de água desionizada.
2. isolamento de artérias ciliares posteriores curtas
Nota: O olho de suínos é dividido basicamente nas secções posteriores (Figura 2B) eanterior (Figura 2).
- Coloque o globo de olho em uma câmara de dissecação com solução tampão de K-H gelada. Cuidadosamente cortada muscular circundante e os tecidos com uma afiada tesoura de Mayo.
- Fazer uma incisão com um bisturi e corte o globo ao longo do plano equatorial com uma afiada tesoura de Mayo até o olho é separado nas metades anteriores e posteriores. Remova como corpo vítreo tanto quanto possível a partir da metade posterior do olho usando um par de pinças padrão.
Nota: Separação do globo de olho em duas metades facilita o isolamento de sPCA com facilidade sem ter um olho se movendo no prato de dissecação. No entanto, esta etapa não é obrigatória. Os vasos também podem ser isolados sem abrir o globo do olho. - Use pinos de dissecação para cuidadosamente o pino para baixo a metade posterior do olho com o lado da retina para baixo e o nervo óptico para cima, para o experimentador.
- Com cuidado corte os tecidos conectivos ao redor do nervo óptico para expor a vasculatura retrobulbar subjacente com um par de estudante Vannas para primavera.
- A sPCA pode ser visto como curtos Ramos dos vasos (entre 5-8 filiais) que penetram a esclera e circunferencialmente circundam a cabeça do nervo óptico (Figura 2C). Isole o paraoptic e distal sPCA juntamente com os tecidos conjuntivo circundantes com um par de pinças de precisão 5 tipo e Vannas para Capsulotomia (Figura 2D).
Nota: Garantir que o buffer de K-H permanece gelado durante todo o processo de isolamento. É altamente recomendável para alterar o buffer cada 20-30 minutos, dependendo da temperatura ambiente.
3. preparação da amostra
- Suavemente retire os segmentos arteriais usando pinças de precisão ponta extra fina tipo 5 e Vannas para Capsulotomia sob um estereomicroscópio tecidos conjuntivos e enxágue as artérias isoladas em PBS gelado para remover contaminantes e resíduos de sangue.
Nota: Se as amostras não são submetidas para as próximas etapas imediatamente, snap-congelamento-los em nitrogênio líquido e loja em-80 ° C até utilização posterior. - Piscina artérias dos dois olhos para obter um replicar biológica, transferi-los para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e pesar as amostras, usando uma balança analítica.
- A cada tubo, adicionar uma mistura de grânulos de óxido de zircônio 0,5 e 1,0 mm, seguido pelo reagente de extração de proteína de tecido (T-por; ver B7 na Tabela de materiais).
Nota: O volume de T-PER é depende do peso das amostras em cada tubo, com uma proporção de 1 mL de reagente de 50 mg de amostra. Regra geral do polegar para seguir ao carregar tubos para homogeneização é uma relação de volume de 1:1:2 = amostra: grânulos: T-PER(Figura 3). Não use muito grande um volume de buffer de extração e muito pouco uma quantidade de grânulos para evitar homogeneização ineficiente. - Carregar os tubos de amostra em um homogeneizador de liquidificador (ver D6 na Tabela de materiais). Ajuste o temporizador para nível 2 min e velocidade 6 e começar a homogeneização. Após a execução, seleção de amostras para completa homogeneização e repetir o ciclo até as amostras são completamente homogeneizado (Figura 3B).
Nota: Um total de 24 tubos de amostra pode ser homogeneizado em uma corrida. É importante manter as amostras frio durante o processo de homogeneização para minimizar a desnaturação da proteína. O homogenizador de liquidificador bala usado neste estudo tem uma característica inerente de refrigeração que mantém as amostras frio. Em casos onde nenhum recurso de refrigeração interno está disponível no homogeneizador, as amostras podem ser mantidas no gelo entre cada execução. - Pipete cuidadosamente homogeneizado para tubos de microcentrifuga fresco. Centrifugar as amostras a 10.000 x g por 20 min a 4 ° C para proteínas insolúveis e sobrenadante separado contendo proteínas solúveis de Pelotas. Cuidadosamente Pipete fora o sobrenadante para tubos microcentrifuga fresco sem tocar a camada de sedimento (Figura 3C).
Nota: Tanto o sobrenadante e sedimento podem ser armazenados em-80 ° C até utilização posterior.
4. pelota digestão
- Adicione 200 µ l de 2A de tampão de extração e 5 µ l de coquetel de inibidor de protease para cada amostra de sedimento. Suspenda o sedimento várias vezes com uma pipeta.
Nota: Misture os reagentes de extracção, bem antes de adicionar a pelota. Mantenha 2A de tampão de extração no gelo e o inibidor de protease RT durante todo o processo de extração. -
Use um homogeneizador ultra-sônico para homogeneizar completamente a pelota.
- Defina a amplitude de ciclo para 1 e 60. Use uma sonda de titânio (Ø 0,5 mm, 80 mm de comprimento), que é apropriado para homogeneização de amostras com volumes pequenos (10-500 µ l).
- Mergulhe a sonda a pelota e extração mistura do buffer e pressione a tecla start para expor a amostra de ondas ultra-sônicas.
- Proceda à sonicação a amostra até as touceiras de sedimento são completamente homogeneizadas. Uma pausa de alguns segundos entre cada sonication.
- Verifique visualmente completa homogeneização. Misture o homogenate várias vezes com uma pipeta para garantir que não há nenhum aglomerados.
Nota: O procedimento de extração de pelota deve efectuar-se no gelo para evitar a desnaturação da proteína devido ao calor gerado durante a homogeneização (Figura 4).
5. limpeza da amostra e troca de Buffer
- Use dispositivos de filtro centrífugo com corte 3 kDa (ver D3 na Tabela de materiais) para que este procedimento de acordo com as instruções do fabricante com modificações quando aplicável. Primeiro, insira a unidade de filtro em um tubo de microcentrifugadora (fornecido no pacote de filtro).
- Pipetar 200 µ l de amostra homogeneizado para dispositivo de um filtro e adicionar 200 µ l de água deionizada para o mesmo filtro. Cap-lo de forma segura (Figura 5A).
- Coloque a unidade de filtro em uma centrífuga e rotação para 14.000 x g por 15 min a 4 ° C.
- Retire o dispositivo do centrifugador e separar a unidade de filtro contendo a amostra concentrado do tubo microcentrifuga contendo o filtrado. Descarte o filtrado (Figura 5B).
- Reconstitua o concentrado pela adição de 400 µ l de água deionizada para a unidade de filtro. Repita os passos de 5.3 e 5.4 três vezes. Pipete cuidadosamente o concentrado de amostra 'limpo' para um microtubo limpo.
Nota: Normalmente, uma amostra de 200 µ l bruto renderá ~ 50-70 µ l de concentrado após filtração. - Repita as etapas 5.1-5.5 para as restantes homogenates de amostra.
6. a proteína medição
- Use o ensaio da proteína bicinchoninic ácido (BCA) kit (veja B5 na Tabela de materiais) para determinar as concentrações de proteína das frações sobrenadante e sedimento das amostras sPCA em um leitor de placa.
- Prepare as diluições (BSA) padrão de albumina (final BSA concentrações variam entre 25 a 2.000 µ g/mL) a partir de uma ampola de 1 mL, compreendendo 2 mg/mL BSA, de acordo com as instruções do fabricante.
- Pipete 10 µ l de cada diluição padrão BSA e amostra Replica (sobrenadante e sedimento) em cada poço de uma microplaca de 96 poços de fundo plano.
- Preparar o BCA trabalhando reagente adicionando 50 partes do BCA Reagente A para 1 parte de BCA reagente B.
Nota: Calcular o volume total de reagente de trabalho necessário para cada medição antes da preparação e fresco, prepare-se volume suficiente com base no número de amostras e diluições padrão para ser analisada. - Cuidadosamente, pipete 200 µ l de BCA trabalhando reagente para cada poço. Cobrir a microplaca e incubar a 37 ° C por 30 min. Após refrigerar a placa de RT, medir a absorvância a 562 nm em um leitor de placas (ver D13 na Tabela de materiais).
- Com base na curva padrão gerada para cada concentração de padrão BSA (µ g/mL), determine as concentrações de proteína das amostras.
7. eletroforese em Gel de unidimensional (1DE)
- Prepare as amostras para 1DE conforme mostrado na tabela 1 (para um exemplo). Misture a mistura da amostra com uma pipeta. Aquecer as amostras a 70 ° C durante 15 min e frio para RT
- Prepare o tampão de corrida 1x, adicionando 50 mL de tampão de executando de SDS de MES de 950 mL de água desionizada. Misture bem.
-
Prepare pré-moldado 4-12% géis de proteína de Bis-Tris (ver B4 na tabela de materiais).
- Abri a bolsa plástica para remover a fita de gel e enxaguar a gaveta com água desionizada.
- Remova o pente fora a fita de gel em um movimento fluido, tomando cuidado para não danificar os poços.
- Lave suavemente os poços de carregamento 2 - 3 vezes com tampão de corrida usando uma pipeta 1x. Inverter e agite suavemente a fita de gel para remover o tampão, garantindo que lá não há bolhas de ar nos poços.
- Remova a fita branca na parte inferior das fitas de gel.
- Inserir geles (máximos duas gavetas) no gel executando o tanque e depois de totalmente montada, tranque a gel de cunha de tensão.
- Preencher o buffer superior (cátodo) de câmara com 200 mL de tampão de correr até os poços são completamente cobertos. Verifique se há qualquer vazamento.
- Adicionar 500 µ l de antioxidante (ver A14 na Tabela de materiais) para o Buffer de execução.
Nota: O antioxidante é um reagente de decoro que deve ser usada com amostras reduzidas com agente redutor (veja tabela 1) para manter as condições de redução durante a electroforese e para evitar a re-oxidação de aminoácidos sensíveis tais como o triptofano e metionina. - Cuidadosamente carrega 50 µ g de amostra por raia usando uma pipeta. Em seguida, carregar o padrão de proteína pre-manchado como um marcador de massa molecular (ver A18 na Tabela de materiais).
- Encha a câmara inferior do amortecedor (ânodo) com 600 mL de tampão de execução.
- Execute o gel para ~ 60 min com uma tensão constante de 175 V. No final da corrida, remova cuidadosamente o gel da placa de gaveta, usando uma faca de gel.
-
Transferi com cuidado os geles para um gel caixa de coloração.
- Prepare a solução de fixação fresco com base no número total de géis que precisam ser marcadas, de acordo com as instruções do fabricante conforme descrito na tabela 2.
- Agite os geles na solução de fixação durante 10 minutos a RT em uma plataforma de balanço.
-
Descartar a solução de fixação e manchar o gel coloidal Blue kit de coloração.
- Preparar a coloração fresca de soluções com base no número total de géis que precisam ser manchado, de acordo com as instruções do fabricante conforme descrito na tabela 3.
- Em primeiro lugar, medir o volume adequado e misturar diretamente os componentes marcados com um asterisco (*) no gel caixa de coloração. Agite os geles na solução de coloração sem Stainer B durante 10 minutos a RT em uma plataforma de balanço.
- Adicionar corante B diretamente para a coloração caixa contendo o * solução de coloração. Certifique-se de agitar Stainer B bem antes de usar.
Atenção: Realize as etapas de preparação 7.10.1 e 7.11.1 sob uma coifa.
- Agite os geles na solução de coloração durante a noite para melhores resultados globais.
Nota: As bandas impregnadas tornará visíveis dentro de 10 min após a adição de corante B. coloração requer um mínimo de 3 h e a intensidade não varia se deixado por mais horas na solução de coloração. - Cuidadosamente, decantar a solução de coloração e substituir com 200 mL de água desionizada. Agite os geles pelo menos 7-8 h em água para limpar o fundo.
Nota: Água desionizada deve ser alterada várias vezes durante o procedimento de descoloração é melhor remover mancha excessiva. Os geles também podem ser deixada em água durante 3 dias sem comprometer a intensidade de banda de proteína. Se os geles não submetido imediatamente para as próximas etapas, pode ser armazenado em solução de sulfato de amônio 20% em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
8. em-gel digestão Tryptic
Nota: Este protocolo é de acordo com o método por Shevchenko et al.17, com pequenas modificações. Esse procedimento deve ser realizado em um fluxo laminar capota e usar conjunto dedicado de pipetas, dicas, tubos e vidraria especificamente para esta finalidade. Use luvas e vestuário adequado laboratório em todos os momentos para evitar a queratina e outras sujidades. Prepare todas as soluções e os reagentes utilizados neste procedimento pouco antes da utilização.
- Impostos especiais de consumo das bandas de proteínas do gel com lâminas do micrótomo limpo, novo. Corte a banda em pedaços pequenos (aproximadamente 1 x 1 mm a 2 mm x 2 mm). Transferi com cuidado os pedaços de gel para tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
Nota: Peças que são demasiado pequenas podem entupir pontas de pipetas e pedaços maiores reduzirá a recuperação do peptide. Tenha cuidado ao utilizar lâminas de micrótomo, que são extremamente afiadas. -
Descoloração
- Adicionar 500 μL de solução de descoloração 100mm ABC solução/ACN (1:1, v/v) e incubar as amostras na RT por 30 min com agitação ocasional ou num Vortex.
- Cuidadosamente a pipeta a descoloração da solução. Verifique visualmente qualquer tubos com mancha residual. Repita a etapa 8.2.1 se gel de peças ainda estão manchadas de azuis.
-
Redução e alquilação
- Adicionar ~ 400 µ l de solução recentemente preparada de TDT e incubar a 56 ° C por 30 min. Certifique-se de que a solução cobre completamente os pedaços de gel. Cuidadosamente, pipetar a solução redutora e descarte.
- Adicionar ~ 400 µ l de solução recentemente preparada de IAA e incubar no escuro em RT por 30 min. Retire os alquilantes buffer com uma pipeta e descarte.
-
Digestão
- Adicione 500 µ l de ACN puro no RT para 10-15 min até os pedaços de gel de encolhem e tornar-se opaca. Pipetar para fora do Grupo ACN e secar peças de gel por 5-10 min sob o capô.
- Pipete 50 µ l de solução de tripsina em cada tubo para cobrir completamente os pedaços de gel. Incube os tubos em 4 ° C por 30 min.
- Depois de 30 min, verificar cada tubo se toda solução de tripsina foi absorvida pelos pedaços de gel. Adicione um volume suficiente de buffer de tripsina (50-100 µ l, dependendo do volume do tubo) para cobrir completamente os pedaços de gel, se necessário. Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C.
-
Extração de peptídeo
- Pipete cuidadosamente a solução de peptídeo extraído da transferência para limpar microtubos e tubos. Seque o sobrenadante em um evaporador a vácuo centrífugo.
Nota: Não jogue fora as peças restantes do gel. - Adicionar 100 µ l de tampão de extração (consulte a etapa 1.7) a cada tubo e incubar durante 30 min a 37 ° C, com agitação.
- Pipetar o sobrenadante para os mesmos microtubos contendo os peptídeos extraídos de acordo com as respectivas bandas e secar para baixo em uma centrífuga a vácuo.
Nota: Se não usado imediatamente, extratos secos de peptídeo podem ser armazenados em-20 ° C até diversos meses até utilização posterior.
- Pipete cuidadosamente a solução de peptídeo extraído da transferência para limpar microtubos e tubos. Seque o sobrenadante em um evaporador a vácuo centrífugo.
9. peptídeo purificação
Nota: Este procedimento de dessalinização e purificação de amostra do peptídeo é realizado com o uso de pontas de pipetas C18 (ver C15 na Tabela de materiais). Use uma ponta nova para cada amostra.
- Prepare o seguinte fresh soluções em tubos de centrifuga conico e alíquota para tubos de microcentrifuga de 2 mL para o processo de purificação do peptide, conforme mostrado na tabela 4. Um resumo dos tubos para a purificação de peptídeo é a seguinte: uma (solução amostra), de tubo tubo B (solução de umectação), tubo C (solução de equilíbrio), tubo D (solução de lavagem), E tubo (solução de eluição), tubo F (um vazio 2 mL ou 5 mL microcentrifuga tubo, dependendo da o número de amostras a ser limpo, para eliminação de resíduos) e o tubo G (um microtubo limpo, vazio, capacidade 0,2 mL).
- Reconstituir extratos secos do peptide da etapa 8.6.3 com 10 µ l de 0,1% TFA. Este tubo é designado tubo A.
- Proceda à sonicação tubos A em um banho ultra-sônico com gelo por 5 min.
- Spin para baixo a solução da amostra em uma centrífuga de bancada a 1.000 x g por 1 min.
- Ajuste uma micropipeta P10 para o volume máximo de 10 µ l e anexar uma ponta da pipeta C18 firmemente.
- Mergulhe a ponta da pipeta na solução de umectação (tubo B) e Aspire cuidadosamente para o material de embalagem. Lentamente dispense os resíduos em tubo F. Repita este passo pelo menos 7 - 8 vezes.
Nota: Pressione o êmbolo de pipeta capim pela raiz e libere lentamente ou dispensar o êmbolo durante todo o procedimento. Tome precauções para não introduzir bolhas de ar nas dicas durante a pipetagem para garantir a ligação peptídica máxima à coluna C18. - Equilibrar a ponta para ligação peptídica por aspiração 10 µ l solução de equilíbrio no tubo C. descarte a solução e repita este procedimento 3 a 4 vezes.
- Em seguida, aspirar e dispensar a solução de amostra no tubo A várias vezes (dependendo da espessura de banda de gel correspondente) para vincular os peptídeos de ponta coluna.
Atenção: A aspiração e dispensação passos durante o processo de vinculação (etapa 9,8) são realizados dentro do tubo A. Não dispense a solução de amostra para o lixo. - Lave a ponta da pipeta C18 por aspirar a solução de lavagem no tubo D e descartá-lo para resíduos (tubo F) 4 a 5 vezes.
- Finalmente, eluir os peptídeos ligados por pipetagem a solução de eluição (E tubo) e dispensa o eluente para tubo de G.
- Repita as etapas de toda 2 a 3 ciclos por exemplo para aumentar a recuperação de amostra.
- Descartar a ponta após a purificação de uma amostra e usar uma nova dica para a próxima amostra.
- Seque os eluídos peptídeo purificado em um concentrador a vácuo.
Nota: As amostras purificadas agora estão prontas para análises de LC-MS/MS no sistema LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS. Armazene as amostras secas em-20 ° C até utilização posterior.
10. líquida cromatografia-electrospray análises de ionização-MS/MS
Nota: Análise proteômica quantitativa rótulo livre é realizado em um sistema de MS de ionização-linear ion trap-Orbitrap (LC-ESI-LTQ Orbitrap) cromatografia líquida-electrospray. A LC é composto de bomba quaternária Rheos Allegro, equipada com um desgaseificador on-line (acoplado a um mostruário de HTS PAL e o sistema é composto por uma 30 x 0,5 mm C18 pré-coluna ligada a uma coluna de18 150 x 0,5 mm C. Uso inverter a fase aquosa A solvente consistindo de água de grau de LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico e B solvente orgânico, consistindo de acetonitrila grau de LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico. Use o gradiente com um tempo de execução de 60 min por gel de banda, conforme descrito em detalhes no nosso anterior estudos6,16.
- Dissolver as amostras purificadas peptídeo em 10 µ l de 0.1% TFA. Proceda à sonicação as amostras no gelo por 5 min.
- Pipetar 10 amostras µ l para uma placa de 96 V-fundo e selar com um filme de capa clara, autoadesivo.
- Transfira a placa para o mostruário.
- Use o seguinte gradiente para cada tempo de execução de 60 min: 0-35 min (15-40% solvente B), 35-40 min (40-60% solvente B), 40-45 min (60-90% solvente B), 45-50 min (90% solvente B), 50-53 min (90-10% solvente B) e 53-60 min (10% de solvente B).
- Use as seguintes condições de espectrometria de massa do instrumento: modo de ionização do íon positivo electrospray, tensão do pulverizador (2.15 kV), temperatura capilar (220 ° C), modo de aquisição de dados dependentes, aquisição automática de comutação entre Orbitrap-MS e LTQ MS/MS, resolução orbitrap (30.000), faixa de m/z (300 a 1.600), alvo automático ganho de controle (AGC, 1,0 x 106 íons), recalibração interna (polydimethlycyclosiloxane [PCM] no 445.120025 íons de m/z em tempo real), bloquear massa opção habilitada no modo de MS, dados em tandem obtidos selecionando o top 5 mais intensa precursor íons, fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID), normalizada ainda mais energia de colisão (NCE, 35% com tempo de ativação de 30 ms com contagem de repetição de 3) e duração de exclusão dinâmica (600 s).
Nota: Os íons resultantes fragmentados são registrados do LTQ. - Execução biológica pelo menos três repetições para cada amostra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Amostra limitada disponibilidade é uma das principais desvantagens na pesquisa oftálmica. Correspondentemente, métodos de extração para proteína ideal rendem de pequenas quantidades de amostras, tais como vasos oculares são muitas vezes discutíveis. Até o momento, há uma escassez de métodos servidos particularmente para a extração da proteína dos vasos sanguíneos retrobulbar. Portanto, como um primeiro passo na otimização de método e como um prova de princípio para comparar a eficácia e a robustez dos vários comumente utilizados detergentes de extração da proteína de um reagente relativamente novo, T-PER, foi realizado um estudo-piloto usando tecidos cardíacos de ratos (devido à disponibilidade de amostra fácil e suficiente para passos de otimização). Comparamos o rendimento de proteína, comparando as concentrações de proteína total e proteínas totais identificadas usando os seguintes reagentes: T-PER, 0,02% n-dodecil-β-D-maltoside (DDM), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-sulfonato de propano (CAPS), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14) e uma mistura de ACN e TFA (20% ACN / 1% TFA). A quantidade total de proteínas em amostras extraídas com cada um destes detergentes é como ilustrado na Figura 6A, com o maior rendimento de tecidos extraídos com T-PER (56.4 tecido µ g/mg), seguido por DDM (tecido 22.88 µ g/mg), caps (16.01 µ g/mg tecido), ASB-14 (tecido 11.56 µ g/mg) e o menor rendimento de ACN/TFA (tecido de 4,38 µ g/mg). Consistentemente, as proteínas totais identificadas também foram os mais altos na amostra T-por-extraído (proteínas de 1649) > DDM (proteínas de 1310) > Caps (proteínas de 1319) > ASB-14 (1121 proteínas) > ACN/TFA (924 proteínas), como mostrado na Figura 6B. Com base nestes resultados, procedemos com a extração de proteínas das amostras sPCA com T-PER.
Em seguida, otimização de protocolos de preparação de amostra antes da pré-fracionamento em 1DE é um passo crucial para obter resultados altamente reprodutíveis entre amostras e repetições e bandas de proteínas bem separadas. A importância dessas etapas é refletida e destaque nos resultados de 1DE. A Figura 7 mostra a comparação dos perfis 1DE proteína da sPCA, antes e depois submetido à preparação de amostra otimizada e etapas de limpeza. Em geral, um alto grau de separação mancha e pobre das bandas de proteínas foi observada na pista 3. Este perfil demonstra que as amostras podem conter reagente de extração e também contaminantes, tais como lipídios e restos celulares. No entanto, as sPCA amostras que foram separados em sobrenadante e sedimento e, submetido para o otimizado protocolo resultou em perfis de 1DE exemplar, como representado na pista 1 e 2 (Figura 7).
Em síntese, com base nestes resultados, prometendo-o método otimizado para extração de proteína solúvel rápida, robusta e eficiente de microvessels ocular está empregando reagente de extração de proteína de tecido (T-PER) e utilizando solução tampão 2A (TM-PEK) para extrair baseados em membrana proteínas encontradas no pellet de amostra. Posteriormente, a amostra homogenates (o T-por fração) estão sujeitos a troca do amortecedor e amostra de limpeza com as 3 unidades de filtro centrífugo kDa antes de 1DE. A concentração de amostra ideal é 50 µ g por bem. Por outro lado, precisa ser destacado aqui que este protocolo não só é aplicável para pequenos tecidos, tais como os vasos sanguíneos, mas também é viável para outras amostras de tecido-baseado. Isto é evidenciado pela 1DE perfis de murino cerebrais e os tecidos do coração, que demonstraram que há um grande número de proteínas que podem ser extraídos do sobrenadante (Figura 8A, B) e frações de pelota (Figura 8C, D ).
Figura 1 : Visão geral do fluxo de trabalho. Uma representação esquemática dos protocolos utilizados para análise de proteome rótulo livre quantitativa da sPCA porcina. Em geral, este procedimento é dividido em duas seções principais, compreendendo as etapas de preparação de amostra microvessel e abordagem proteômica baseada em MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fotografias representativas dos olhos porcinos. (A) Lateral Ver os do olho globo mostra a córnea, que está localizada na parte anterior do olho, a esclerótica, circundante músculo e nervo óptico. (B) Posterior Ver os do olho mostra o nervo óptico. (C) ramos da sPCA, visto na parte de trás do globo do olho composto do paraoptic e distais ramos. (D) sPCA isolado com gordura e tecidos conectivos circundantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Homogeneização da amostra. Representante de fotografias mostrando a amostra (A) antes e (B) após homogeneização. (C) o homogeneizado amostras mais foram separadas em sobrenadante contendo proteínas solúveis e sedimento contendo proteínas insolúveis, transmembrana-based. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Procedimento de extração de proteína de Pelotas. Para evitar a desnaturação de proteínas, amostras de sedimento são extraídas no gelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Amostra limpeza. Troca de reserva é realizada com 3 kDa corte filtros centrífugos para limpar as amostras antes da análise de MS. Representante de fotografias mostrando o homogeneizado (A) antes e (B) após a filtração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Comparação da eficácia de extração de proteínas e robustez entre T-por e quatro detergentes de extração da proteína comum. Gráficos de barras representando as quantidades de proteína (A) e (B) número total de proteínas identificados usando T-PER, 0,02% DDM, CHAPS de 1%, 1% ASB-14 e 20% do Grupo ACN / 1% TFA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Gel de 1DE representativa dos perfis de proteína sPCA suínos antes e depois da otimização. Lane 3 retrata o perfil de 1DE da amostra que não foi submetida a qualquer prévia limpeza passos. Pista 1 e 2 mostram os perfis de proteína exemplar de sPCA sobrenadante e sedimento, respectivamente, após submeter as amostras para a preparação da amostra otimizada e etapas de limpeza. Gel foi corado com coloidal azul kit de coloração. M = marcador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Gel de representante coloidal 1DE manchadas de azul de amostras de tecido com base em exemplares. Perfis de proteína do sobrenadante (A, B) e da pelota (C, D) do cérebro murino e tecido cardíaco amostras, respectivamente, em 50 µ g por bem. Proteínas do sobrenadante e sedimento foram extraídas empregando o T-PER e do transmembrane kit de extração da proteína, respectivamente. M = marcador. R1-R3 representam três repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de | Volume (µ l) |
| Amostra (sobrenadante ou pelota) | x |
| Amostra LDS Buffer (4x) | 2.5 |
| Agente redutor (10x) | 1 |
| Água desionizada | Até 6,5 (dependendo do volume de amostra) |
| Volume total por amostra | 10 |
| Nota: x é calculado com base na concentração da proteína (50 µ g da proteína total por exemplo). | |
Eletroforese em Gel de Dimensional (1DE) tabela 1:1. Os detalhes dos componentes necessários para a preparação de amostra realizar 1DE.
| Solução | Para 1 gel (mL) | Para 2 géis (mL) | Para 4 géis (mL) |
| Água desionizada | 40 | 80 | 160 |
| Metanol | 50 | 100 | 200 |
| Ácido acético | 10 | 20 | 40 |
Tabela 2: fixação de Gel. Os detalhes dos componentes necessários para preparar a solução de fixação para a 1DE.
| Solução | Para 1 gel (mL) | Para 2 géis (mL) | Para 4 géis (mL) |
| * Deionizada | 55 | 110 | 220 |
| * Metanol | 20 | 40 | 80 |
| * Corante A | 20 | 40 | 80 |
| Corante B | 5 | 10 | 20 |
Tabela 3: coloração de Gel. Os detalhes dos componentes para preparação do Blue coloidal solução de coloração.
| Solução (para) | Composição | ACN * * | H2O * * | TFA | Volume total * |
| Umectante | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing e equilíbrio | 0,1% TFA | 10 mL | 10 Μ l | ~ 10 mL | |
| Eluição de peptídeo | 0,1% TFA em 60: 40 = ACN: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 Μ l | ~ 10 mL |
| Nota: * o volume total deve ser ajustado de acordo com o número total de amostras a ser submetido a Zip dica limpeza. | |||||
| * * Use grau HPLC ou LC-MS-grau. | |||||
| # Prepare-se dois tubos de Eppendorf separados para lavagem e equilibração, respectivamente. | |||||
Tabela 4: purificação de peptídeo. Os detalhes dos componentes e suas respectivas composições para procedimento de purificação de peptídeo usando as pontas de pipetas de18 C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteome abrangente de perfil de uma variada gama de amostras oculares é um primeiro passo importante e indispensável para elucidar os mecanismos moleculares e vias de sinalização implicadas na saúde e na doença. Para obter dados de alta qualidade e garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir dessas análises, as etapas de preparação de amostra anterior são cruciais, como destacado em uma revisão por Matos et al. que discutiu em profundidade os procedimentos de processamento de amostra para diferentes partes do olho utilizando gel bidimensional eletroforese e massa espectrometria de estratégia1. Na linha destas investigações, nosso estudo atual prevê um protocolo otimizado de passo a passo rápido, robusto e altamente eficiente compatível com o MS preparação da amostra usando a sPCA porcina como modelo ocular microvessels. Esta investigação foi iniciada após a escassez de metodologia específica para extrair quantidades suficientes de proteínas de amostras arteriais de quantidade limitada para gerar dados de MS de alta qualidade. Nosso método também é um esforço para contribuir para o acervo de conhecimentos sobre o uso das técnicas de micro escala que permitem excelente proteome mapeamento18.
Há vários aspectos críticos neste protocolo experimental que precisam ser tomadas em consideração para um desempenho ideal para uma análise quantitativa do proteoma. Em primeiro lugar, é importante que as amostras, independentemente dos montantes, estão sujeitos a homogeneização completa para garantir a extração de proteína ideal. Em nossa metodologia, o uso de uma mistura de grânulos de tamanhos diferentes e homogenizador de liquidificador bala foi instrumental para lise completa de tecido. O tipo e tamanho de grânulos usados dependem do tipo de amostra e quantidade. Grânulos com densidades maiores, como a utilizada atualmente ZrO2 e aço inoxidável, são apropriados para tecidos meio-duro e trabalharam especialmente bem para os vasos sanguíneos.
Em segundo lugar, é imperativo para separar o sobrenadante do sedimento e, submeter-se a último a digestão e extração usando o kit especificado. Esta etapa é essencial para extrair proteínas de alto peso molecular, tais como proteínas transmembrana, que caso contrário são difíceis de homogeneizar usando detergentes suaves19,20,21. Pelota precipitada é dissolvida melhor usando sonication para evitar perda de amostra incorrida por respingo-up introduzida durante a agitação vigorosa ou métodos a tremer.
Em terceiro lugar, vale ressaltar que todos os procedimentos de preparação de amostra são efectuados em baixa temperatura (4 ° C), salvo indicação em contrário na metodologia. Isso é para garantir a desnaturação da proteína mínima durante os procedimentos de extração. Quarta, repetido congelamento-descongelamento das amostras deve ser evitada para evitar a degradação proteica e deterioração da qualidade da amostra.
Finalmente, a remoção de contaminantes e detergentes é necessária após extração de proteínas para evitar interferência a jusante durante o fracionamento em gel, digestão enzimática e MS análise18,22. Estes contaminantes muitas vezes interferem com a resolução da separação eletroforética e correspondentemente, influenciam a visualização do resultado, conforme mostrado no perfil de 1DE (Figura 7). Para contornar esse problema, o uso de dispositivos de filtro de corte centrífuga é favorecido por sua facilidade de utilização e perda de proteína mínima.
Embora os atuais procedimentos experimentais fornecem uma perspectiva aprofundada para as etapas de preparação de amostra importante para análises de MS livre de rótulo quantitativas ideais, existem duas limitações. Primeiro, amostras de sPCA foram agrupadas de dois olhos porcinos para fornecer quantidades suficientes de tecidos para posterior análise. Desde que os olhos obtidos a partir do matadouro local são randomizados e, portanto, não se sabe se os vasos sanguíneos estão sendo isolados dos olhos do mesmo animal, pool de amostra reduz variações inter individuais5,6. No entanto, a metodologia atual também pode ser adaptada para a preparação de amostra individual, dependendo da quantidade de amostras disponíveis. Em segundo lugar, a metodologia apresentada foi desenvolvida especificamente para 1DE baseada em gel de fracionamento. Embora a compatibilidade do método atual para integração com top-down e outros métodos de fracionamento garante investigação, optou-se por 1DE devido a diversos fatores que variam de boa reprodutibilidade, facilidade de controle de qualidade a melhor profundidade de análises , especialmente para amostras complexas, tais como os vasos oculares atualmente exemplificado1,5,23.
Em conclusão, apesar das limitações destacadas acima, o fluxo de trabalho descrito representa uma abordagem simples, porém robusta para as etapas de preparação de amostra rigorosas catered especificamente para análise de pequena quantidade de vasos sanguíneos. Também é importante salientar aqui que esse método pode ser facilmente integrado para análise de espectrometria de massa-baseado proteomic de outras células e tecidos-com base em amostras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Dr. Manicam é suportado pelo interno Universidade pesquisa financiamento (1 Stufe) do centro médico de Universidade de o Mainz de Universidade Johannes Gutenberg e uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H.
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I.
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
