Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

Körte su dağılımının gözlemlenmesi, odunsu bitkilerde suyun akış dinamikleri ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Bu çalışmada, örnek hazırlama sırasında su durumundaki artifaktüel değişiklikleri ortadan kaldıran bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ 'da xylem su dağıtımını gözlemlemek için pratik bir yaklaşım gösteririz.

Abstract

Bir tarama elektron mikroskop yüklü Kriyo-birimi (Cryo-SEM) Subzero sıcaklıklarda numune gözlem sağlar ve sıvı nitrojen kullanarak dondurma fiktasyon teknikleri ile birlikte bitki dokularında su dağıtımı keşfetmek için kullanılmıştır (LN 2). odunsu türler için, ancak, xylem enine kesme yüzeyi gözlem hazırlıkları ahşap liflerin oryantasyonu nedeniyle bazı zorluklar içerir. Ayrıca, xylem kanallarının su sütununda daha yüksek gerilim, özellikle örnek fiktasyon ve toplama sırasında su dağıtımında artifaktüel değişikliklere neden olabilir. Bu çalışmada, bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ 'daki odunsu bitkilerin xylem içerisindeki suyun dağılımını gözlemlemek için etkili bir prosedür sergiliyoruz. İlk başta, numune toplama sırasında, xylem su potansiyelinin ölçülmesi, xylem kanalında yüksek gerilimin bulunup bulunmadığını belirlemelisiniz. Xylem su potansiyeli düşükken (< CA. − 0,5 MPa), numune dondurulması sırasında xylem kanallarında su durumunun daha iyi korunmasını kolaylaştırmak için bir gerginlik rahatlama prosedürü gereklidir. Sonra, bir su geçirmez yaka ağaç kökü etrafında eklenir ve LN ile dolu2 xylem su durumunun donması için sabitleme. Hasat sonrası, örnek gözlem için numune hazırlama prosedürlerini tamamlarken numunenin donmuş şekilde korunduğundan emin olmak için bakım alınmalıdır. Xylem enine kesilmiş yüzeyi açıkça açığa çıkarmak için bir kriyostat kullanılmaktadır. Cryo-SEM gözlemlerde, donma-aşındırma için zaman ayarlaması, Frost tozunu kaldırmak ve izleme yüzeyinde hücre duvarlarının kenarını vurgulamak için gereklidir. Sonuçlarımız, hücresel ve hücre altı seviyelerinde xylem içinde su dağılımı gözlem için Cryo-SEM tekniklerinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Cryo-SEM ile tahribatsız in situ gözlem teknikleri ile kombinasyonu derin odunsu bitki suyu akış dinamiklerinin keşfi geliştirmek olacaktır.

Introduction

Su kaynaklarının kullanılabilirliği (yani, yağış, toprak suyu içeriği) kesinlikle bitki türlerinin mortalite ve coğrafi dağılımını belirler, çünkü topraktan su absorbe etmek ve fotosentetik üretim için yaprakları taşımak gerekir. Bitkiler su taşıma sistemini dalgalanan su kaynakları altında tutmalıdır. Özellikle, odunsu bitkiler, bazı durumlarda, onların taç daha ~ 100 m zemin üzerinde tutmak gerekir gibi transpirasyon akışları boyunca kendi kanallarında yüksek gerginlik üretir. Bu kadar yüksek negatif basınç altında su sütunları korumak için, xylem kanallar sert ve hidrofobik-lignified hücre duvarları ile tübüler hücrelerin bir süreklilik oluşur1. Her türün xylem boru disfonksiyonunun xylem bozukluğu için güvenlik açığı, dalgalanan su kaynağı altında türlerin hayatta kalmasının iyi bir belirleyici olduğunu2. Buna ek olarak, xylem kanallarının su durumunun incelenmesi, Abiotik veya biyotik gerilmelere maruz kalan ayrı ağaçların sağlık durumunun değerlendirilmesi için önemlidir. SAP akışını veya su potansiyelini ölçmek, xylem kanallarının Entegre hidrolik fonksiyonu nedeniyle odunsu bir bitkinin suyun durumunun tahminlerini sağlayabilir. Ayrıca, xylem hücrelerinde suyun dağılımını görselleştirerek xylem Hidrolik sisteminin bireysel bileşenlerinin durumunu açıklığa kavuşturabilirsiniz.

Xylem kanallarının su durumunu görselleştirmeye yarayan çeşitli teknikler var3. Ahşap doku su yolları gözlemleme için klasik ve yararlı yöntemler bir boya içine kesim dalları uçları daldırarak veya ayakta ağaca bir boya enjekte ederek su sütunu boyama içerir4kaynaklanıyor. Soft x-ışını fotoğrafçılığı, xylem5,6' da nem diferansiyel x-ışını emilimi yoğunluğu nedeniyle dilimlenmiş ahşap diskler su dağılımı görselleştirme sağlar. Bu yöntemler, ancak, sadece su hareketi parçaları sağlamak veya su makroskopik dağılımları göstermek. Son zamanlarda, mikro odaklama X-Ray bilgisayarlı tomografi (μct)7,8,9,10ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)11 gibi tahribatsız gözlem teknikleri, 12, önemli ölçüde sağlam fidanlar içinde xylem kanallar su gözlem sağlamak için geliştirilmiştir. Bu yıkıcı olmayan yöntemler biz yapay kesme efektleri olmadan xylem su durumunu gözlemlemek ve biz ardışık görüntüleme veya bir kontrast Ajan10tanıtmak su akışı dinamikleri izleyebilirsiniz büyük avantajları vardır. Ancak, hücresel düzeyde su içeriğini tanımlayabilen görüntüleri elde etmek için bitki görüntüleme veya Synchrotron tabanlı μCT için özel bir tesis için özelleştirilmiş bir MRI kullanmanız gerekir. Buna ek olarak, Synchrotron tabanlı μct sistemi, ışık mikroskobu7,8,9ile karşılaştırılabilir yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip ince görüntüler elde etmek için etkin olsa da, yaşam hücreleri tarafından yaralanabilir yüksek enerji X-ışını13,14radyasyon. Hangi Cryo-birimleri yüklü bir tarama elektron mikroskop istihdam (Cryo-SEM) tam bir hücresel düzeyde xylem su bulmak için çok yararlı bir yöntemdir, bu yıkıcı gözlem için örnek hasat gerektirir rağmen. Xylem kanalları su düzeltmek için, (yani, dallar, dalları veya kaynaklanıyor) kaynaklanan bir kısmı sıvı nitrojen (LN2) tarafından situ dondurulmuş. Cryo-SEM tarafından kesilmiş, dondurulmuş numunelerin yüzeyinin gözlemleri, biz buz olarak xylem kanallarının su tanımlayabilir hangi xylem yapısının yüksek büyütülmüş görüntüler sağlar. Bu yöntemin önemli bir sınırlama, aynı numune içinde su taşınabilirlik sıralı gözlem imkansız olmasıdır. Ancak, bu aletler taşınabilir olmadığından bir alanda yaşayan ağaçların sıralı gözlem için μCT veya MRI uygulaması son derece zordur. Buna karşılık, Cryo-SEM açık bir şekilde sadece hücresel düzeyde değil, aynı zamanda daha ince bir yapı düzeyinde su içeriğini görselleştirmek için alan deneylerinde büyük ağaçlar bu tekniği kullanarak bir potansiyele sahiptir, örneğin, intervasküler çukurlarda su15, su içinde hücre içi alanlar16, veya su sütununda Bubbles17.

Cryo-SEM tarafından xylem su gözlem birçok çalışmalar bildirilmiştir 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ve ark. (1996) başlangıçta bir konteyner içine kök21üzerine set içine LN2 doldurma yoluyla bir yaşam gövdesinin dondurma-fiksasyonu ile situ içinde xylem gözlem için protokol kuruldu. Numune toplama sırasında ve Cryo-SEM hazırlığı sırasında, kıt kanallarının içindeki buzu erime önlemek amacıyla, numunenin sıcaklığı-20 °C ' nin altında tutulur. Bu yöntem, değişen su rejimi11,12,24,25,26, altında su dağılımı açıklığa kavuşturmak için xylem su gözlemlemek için kullanılmıştır 27,28, su dağıtımı mevsimsel varyasyonu21,29,30, Freeze-çözülme döngüleri etkisi17,31, 32, ıslak ahşaptan su dağılımı5, diri odun 'dan kalp ağacından20' ye geçiş sırasında su dağıtımında değişiklikler, cambial aktivite ve damarları33farklılaşma mevsimsel zaman ders, ve kavitasyon bazı biyotik gerilimler tarafından indüklenen23,34. Hidrolik iletkenlik ve boruları kavitasyon için güvenlik açığı da Cryo-SEM35,36kullanılarak doğrulandı. Enerji Dispersif X-ışını spektrometresi (EDX veya EDS) ile donatılmış Cryo-SEM, su37içeren bir numunenin yüzeyi üzerinde eleman dağılımını incelemek için kullanılmıştır.

Yüksek hidrolik gerginlik altında kanallar içeren bir yaşam gövdesinin donma-fiktasyonu bazen Cryo-SEM ' i hangi boru hatlarının lümeninde kırık buz kristalleri tarafından gözlenen yapay kavimlere neden olur38,39. Özellikle, daha uzun ve daha geniş kanallara sahip geniş türler, su3,40altında yürütülse bile, numune kesiminin neden olduğu kavitasyon gibi gerginlik kaynaklı eserler için savunmasız. Kavitasyon eserler bir nirengi ağacının örnekleme sonra göze çarpan olur (yani, gün boyunca örnekleme) veya şiddetli kuraklık koşulları altında ve kavitasyon oluşumu bir aşırı tahmin yanıltabilir3,38, 39. Bu nedenle, borular içinde çalışan gerginlik artifaktüel kavitasyon önlemek için serbest bırakılmalıdır3,12,39.

Bir numune odasına takılı bir bıçağı kullanan donma-kırılma tekniği genellikle Cryo-SEM gözlem için numune yüzeyini açığa çıkarmak için kullanılmaktadır. Ancak, odunsu bitki dokularının Freeze-kırık uçaklar, ikincil xylem özellikle enine bölümleri, doku6anatomik özellikleri ve suyu açıkça gözlemlemek için çok kaba. Bir numunenin kırpması için bir kriyostat uygulaması, örnek yüzeylerin hızlı ve yüksek kalitede hazırlanması20,23sağlar. Bu yöntemin genel hedefi, numune alma oluşumları olmadan situ 'daki çeşitli Ksilem hücrelerinde su dağılımının Elektron Mikroskopisi çözünürlüğüne sahip kanıt sağlar. Biz ilk kabul beri sürekli olarak geliştirilmiş olan güncel prosedürü tanıtmak, örnekleme ile ilgili, kırpma ve yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için numune yüzeyi Temizleme xylem Cryo-sabit numuneler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: bu protokolün şematik şeması Şekil 1' de gösterilir.

1. örnekleme: xylem boru su sütun içinde gerginlik gevşeme

Not: aşağıdaki gerilim rahatlama tedavisi, LN2 uygulamasından önce, hem donma hem de gerginlik kaynaklı eserler ile xylem su dağıtımında önlemek için önerilir.

  1. Bir şube içine ve siyah plastik bir torba ile örnekleme için yaprakları xylem arasında su potansiyelini doğrultma ve örnekleme önce iki saatten fazla yaprakları.
  2. Bir basınç odası veya bir psychrometer kullanarak numunenin en az iki yaprakları su potansiyelini belirleyin. Su potansiyelinin daha 0,5 yüksek olduğu zaman-MPa (yani, Hayır veya çok düşük gerginlik var), bir numune dondurulduktan sonra hasat edilebilir (bkz. Bölüm 2: donma sabitleme). Su potansiyeli − 0,5 MPa 'dan düşük olduğunda, aşağıda açıklandığı gibi dinlenmek için bir tedavi gereklidir.
  3. Su ile doldurulabilmesi için kök etrafında bir su geçirmez yaka düzeltin. Alt olmadan bir plastik bardak su geçirmez yaka olarak hizmet verebilir. Bakım, daha sonra kullanılan sıvı medyanın sızıntısını önlemek için yapışkan bir bant kullanarak kök ve yaka arasındaki boşlukları sıkıca mühürlemek için alınmalıdır. Esnek hasat için ince dalları veya twigs gibi kaynaklanıyor, kök eğilerek bir su dolu kova içine bir kesme bölümü batırın. Su yüzeyinin altında budama makasları veya testere kullanarak keser. Kesme ucunu havaya indirgemek için, numuneyi mümkün olduğunca çabuk su başka bir kabına aktarın.
  4. Numunenin kesme ucunu su altında tutun. Genişletilen türler için, SEM için bir Cryo-numunenin hasat edilen kökü kesme kenarına elde edileceği noktadan gelen uzunluğun, Cryo numunesi içindeki gerginlik kaynaklı eserleri önlemek için numunelerin maksimum gemi uzunluğundan daha uzun olmasını sağlayın.
  5. Transpirasyon azaltmak için siyah plastik torba ile yaprakları içeren örnek kapak. Su numunenin kesme ucunu tutun ve xylem gerginlik dinlenmek için yaklaşık 30 dakika için bu durumu korumak. Kaviteli kanallar12olası suni dolum nedeniyle daha uzun rahatlama süresi (> 1 saat) kaçının.
  6. Xylem gerginliğinin (yaklaşık 0 MPa) dinlendiğini onaylamak için su potansiyelini tekrar ölçün.
    Not: numune almadan önce, hedef türlerin maksimum damar uzunluğu, hava enjeksiyon yöntemiyle benzer örneklerle araştırılmalıdır veya belirlenmelidir. Büyük bir ağaç veya büyük bir dal örneklemesinde, yukarıda açıklanan gerginlik-rahatlama prosedürlerini yürütmek zordur. Bu nedenle, büyük ağaçlardan numuneler, xylem su potansiyeli daha yüksek olduğunda Predawn döneminde toplanmalıdır.

2. LN2 Ile Dondurma sabitleme

  1. Kesme ve makas veya bir yardımcı bıçak ile bir su geçirmez yaka bir tarafı açın. Diyaframı yatay olarak tutarken, yaka gövdeye yapışkan bir bant ile sıkıca takın.
  2. İzolasyonlu eldiven/mitten, ama2 ' deki şişesi güvenli bir şekilde tutun ve 2 ' si ile doldurmak için at2 ' ye gir. Tamamen xylem su dondurmak için LN2 ekleyerek dolu tutun. Donma için gereken süre örnek boyutuna bağlıdır; 1 dk dökülme sonra atladıktan LN2 durdu küçük bir dal veya fide için yeterlidir, daha fazla 20 dakika daha büyük bir ağaç kök için gerekli20. LN 2 ve ortam sıcaklıkları arasındaki büyük sıcaklık farklılıkları nedeniyle hızlı bir şekilde buharlaşır gibi donma sırasında SÜREKLI olarak LNiki ekleyin.
  3. LN2 ' nin yeterli dondurmadan sonra kaldırılabilmesi için, yakalı numunenin dondurulmuş kısmından ayırın. Yaka ayırma nedeniyle potansiyel LN2 dökülmeleri ile temas önlemek için yalıtım eldiven giymek emin olun.
  4. Numuneyi hemen ince bir el testeresi ile topla.
  5. Dondurulmuş numuneyi alüminyum folyo bir parça ile kapatın veya örnek bir tüp içine koyun, örneğin KIMLIK numaraları yazılır. Hasat edilen numuneyi LN2 veya Pack ile dolu bir konteynırı kuru buzla dolu yalıtılmış bir kutuya hızla yerleştirin.
  6. Örnekleri gözlem kadar derin bir dondurucu içinde saklayın. Tercih edilen depolama sıcaklığı, depolama sırasında buz süblimasyonu ve rerystallizasyonu önlemek amacıyla − 80 °C ' dir.

3. numune hazırlama

Not: gözlem Için, bir örnek kesilmiş olmalıdır ve gözlem için yüzeyi içinde situ içinde onun xylem su dağılımı tutmak için Subzero sıcaklıkta planlanmış olmalıdır. Bir kriyostat sistemi ile biyolojik bir mikrotome (kriyostat) Cryo-SEM tarafından gözlem bu tür bir numune yüzeyi kırpma ve açığa çıkarmak için idealdir.

  1. Kriyostat numune odasının sıcaklığını − 30 °C ' ye ayarlayın, bu da çoğu bitkinin koklem SAP durumunu dondurulmuş bir durumda tutmak için genellikle yeterince soğuktur.
  2. Bir numuneyi küçük bir parçaya kırpın (< CA. yükseklik ve < CA. 1 cm genişliğinde veya çapı), bir Cryo-SEM numune tutucusuna ayarlanabilir. keskin bir bıçak ya da numunede buzu kırmasını önlemek için ince dişli testere kullanın. Bir bıçak ile kesilmiş olamaz büyük bir örnek durumunda, hızlı bir dondurucu kutusunda soğutulmuş testere ile önceden kesilmiş.
  3. Kırpılmış parçayı, Cryo-bölümleme için bir doku dondurucu gömme Orta (örn. OCT bileşik) üzerine monte ederek, bir kriyostat için bir tutucu olan bir Chuck 'a takın. Sonra, kriyostat bir mikrotome bir numune tutucusuna Chuck takın.
  4. Kalınlığı 5 – 7 μm bölümlerle tekrar tekrar tıraş ederek yüzeyi kırpın. 1.000 ' den fazla 2.000 μm ' den fazla kesme ile kırpma, örnek toplama sırasında ilk yüzeyden toplam derinlikte, bir bıçağla ön kesme veya adım 3,2 ' de açıklandığı gibi testere ile kaynaklanan numunenin hasarlı kısmını ortadan kaldırmak için yararlıdır.
  5. Numunenin bir yüzeyini kabaca kırptıktan sonra, mikrotome bıçağının kullanılmayan bir kısmını numunenin yüzeyinin üzerinde ayarlayın. Bıçağın, kalınlık ayarını aşan örneğe dokunmasına izin verme.
  6. Kullanılmayan Blade bölümünün ilk kesmeden önce, numune ve bıçak yüzeyi arasındaki mesafeyi hafifçe genişletin.
  7. Numunenin yüzeyini sadece bir veya iki kez keser. Dahası, numunenin yüzeyinde kullanılmayan bir bıçak parçasının ayarlanması için bıçağı tekrar kaydırın.
  8. 3,6 ve 3,7 üç veya dört kez adımları yineleyin. Bu, "bıçak izleri" olmadan açık bir yüzey elde etmek için önemlidir (Şekil 4).
  9. Son Kesme işleminden sonra, tozun numunenin üzerine yapışmasını önlemek için bıçağın konumunu örnekten uzağa ayarlayın.
  10. Fırfırını numune tutucusuna ayırın ve dondurulmuş gömme ortamını keskin bir bıçakla kaldırarak numuneyi aynadan ayırın. Numunenin, rendeli yüzeyini Don tozundan önlemek için kriyostat odasına yerleştirildiğinden emin olun.
  11. Numuneyi, kriyostat odasına bir doku donma gömme orta ile Cryo-SEM numune tutucusuna takın.

4. Cryo-SEM numune odasına transfer

Not: yüzey – hazırlanmış numune, kriyostat odasından Cryo-SEM numune odasındaki gözlem aşamasına transfer sırasında sıcaklık veya Don birikiminin artması ile korunmalıdır.

  1. Ekipman kullanım kılavuzuna göre LN2 ile Cryo-SEM numune odasındaki soğuk aşama sıcaklığını – 120 °c ' den daha düşük olarak koruyun.
  2. Numune tutucusunu hazırlanmış numuneye, kriyostat odasında LN2 ile dolu bir yalıtım konteynerine yerleştirin.
  3. Numune tutucusunu LN2' nin altında bir numune değişimi çubuğu ile tutun. Numune tutucusunun mümkün olduğunda havaya maruz kalmaması.
  4. Numune tutucuyu, tahliye öncesi odanın tahliyesini başlatarak Cryo-SEM numune odasının ön tahliye odasına hızlıca ayarlayın. Ardından, hava tamamen boşaltıldıktan sonra numune tutucusunu soğuk aşamaya yerleştirin. Biraz Don birikimi kaçınılmaz olmasına rağmen, "Freeze-etching" prosedürü (adım 6) kaldırabilirsiniz.

5. SEM ayarı

Not: gözlem için tipik ayar aşağıda açıklanmıştır. Vakum durumuna veya elektron ışınına bağlı olarak bazı değişiklikler gereklidir.

  1. İzleme için SEM parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın:
    Hızlanma voltajı: 3 – 5 kV
    Numune aşamasının sıcaklığı: < − 120 °C
    Dedektör: Ikincil emisyon

6. dondurma-gravür

Not: Freeze-etching hafif buz kristal süblimasyon ile örnek hücre duvarları kenarı vurgulamak için prosedürdür. Freeze-etching ayrıca yüzey Don tozları kaldırma içerir.

  1. Donma-etching sırasında elektrik tabancası ivme voltajı açın. Numuneyi gözlemlerken donma-Etleme yapmak daha iyidir.
  2. Numune aşamasının sıcaklığını − 100 °C ' ye yükseltin.
  3. Don tozu çıkarılıncaya kadar birkaç dakika bekleyin ve xylem hücrelerinde buzun yüzey seviyesi hücre duvarlarına kıyasla biraz azalmıştır.
  4. Numune aşamasının sıcaklığını − 120 °C ' ye indirin.
    Not: numune aşaması için yüklü Sıcaklık kumandası yoksa, numuneyi değişim çubuğunu kullanarak tutun ve birkaç dakika için numune aşamasından ayırın. Numunenin süblimasyon durumunu doğrulamak için bu donma-aşındırma işlemi sırasında numuneyi birkaç kez izleyin.

7. metal kaplama (opsiyonel)

Not: SEM enstrüman ve görüntü işleme son iyileştirmeler metal kaplama olmadan elektrik yalıtım numunelerin yüksek kaliteli görüntüler sağlayabilir. Ancak, biyolojik malzemeler gibi iletken olmayan örnekler, bazen şarj edilir; elektronlar birikimi nedeniyle numunenin belirli pozisyonlarında daha yüksek parlaklık ("şarj"). Numunenin daha uzun bir süre veya yüksek büyütme için elektron ışınlarının açığa çıkması, şarj efektlerini arttırır. Numunenin yüzeyini Elektrik iletkenli metal malzemeyle kaplama, şarj işleminin oluşmasını önler. Numune sıcaklığının kaplama sırasında artması için Cryo-SEM ünitesi içinde yüklü olan vakum kaplama sistemini kullanın.

  1. Kaplama malzemesi kaplama sisteminin belirlenmiş bir evaporatör kafası yüklü olduğundan emin olun.
  2. Kaplama sistemindeki soğuk aşamanın sıcaklığını − 170 °C ' ye kadar koruyun.
  3. Numune tutucuyu, yeterli donma-Etleme işleminden sonra kaplama sisteminin soğuk aşamasına yerleştirin.
  4. Soğuk sahne ve Evaporatör kafası arasında bir bölme açın.
  5. Geçerli değeri ve buharlaştırıcı kafasının voltaj değerini sırasıyla 30 mA ve CA. 5 V olarak ayarlayın.
  6. Numunenin yüzeyini kat etmek için 30 s ısı için kaplama malzemesi Buharlık.
  7. Evaporatör kafasının geçerli ve voltaj değerlerinin her ikisini de sıfır olarak ayarlayın ve bölümü kapatın.
  8. Numune tutucuyu numune odasının soğuk aşamasına, gözlem için yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cryo-SEM tarafından gözlenen, iğne kesimli ve yaylı ağaç xylem 'in Transverse kesilmiş yüzeylerinin temsili görüntüleri Şekil 2' de gösterilir. Düşük büyütmede, görüntüdeki siyah alan, suyun tamamen veya kısmen kaybolacağı boşlukları gösterir ve gri alan Ksil hücresi duvarları, sitoplazması ve suyu gösterir (Şekil 2A). Yüksek büyütme, bu su tamamen üç tracheids Lumina kayıp değildir belirgindir, kıt içinde situ SAP makro kabarcıkların oluşumunu gösteren (Şekil 2B). Geniş türler ile ilgili olarak, kavitasyon oluşumu kolayca gemiler içinde tespit edilir, su varlığı lifleri içinde ayırt etmek zordur, özellikle düşük büyütme (Şekil 2C). Parankimat hücrelerinde sitoplazma buz düz dokular (örn., Şekil 2B) ile trahceids veya gemiler içinde su ayırt edilebilir.

Soğuk Etleme sürecinde sıcaklığın etkisi Şekil 3' te gösterilir. Donma tozu giderek artar ve intertrakheary pit membranlarında artan sıcaklık ile süblimasyon ilerlemesi ile daha net hale gelir. Kalan büyük Don tozu parçacıkları daha fazla donma-etching tarafından ortadan kaldırılabilir, ancak bu sorunlu olabilir gibi gereksiz yere xylem kanallar buz yüzey seviyesi azalır.

Yüksek gözlem kalitesi büyük ölçüde doğru numune hazırlama yoluyla elde edilir; özellikle önemli bir mikrotome keskin bir bıçak ile yüzeyi yumuşatma olduğunu. Kullanılmış Blade tarafından yetersiz yumuşatma bazen pürüzlü yüzeye neden olabilir ("bıçak işaretleri", Şekil 4) veya kesiklerden çok sayıda toz oluşumu. Numunenin yüzeyini dikkatle planlamadan sonra, numune odasına hızlı transfer, Don oluşumunun neden olduğu kontaminasyonları ortadan kaldırmak için de çok önemlidir.

Negatif su sütun basıncının gevşemesi olmadan numune dondurulması, xylem kanallarının kavitasyon artakının artifaktüel indüksiyonuna neden olacaktır (Şekil 5). Numunenin rahat olmadığı numunelerin damarlarında kümelenmiş buz kristalleri gözlendi ( Şekil 5A'da ok uçları), contrastingly, benzer bir su potansiyeline sahip rahat numune örneklerinde hiçbir kümelenmiş buz kristalleri gözlemlendi ( Şekil 5 B). Bu, daha çok kaslı ağaçlarda (yayınlanmamış veriler) daha geniş ağaçlardaki xylem 'de daha önemli olma eğilimindedir.

Figure 1
Şekil 1: bu protokolün şematik şeması. Bu yazıda açıklanan örneklemden SEM gözlem prosedürlerinin akışı gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kapalı tohumlu ve Açık tohumlular ağacı türlerinin Transverse kesilmiş yüzeylerinin örnek Cryo-SEM mikrografları. Xylem hücrelerinde gri ve siyah alanlar, sırasıyla xylem hücrelerinin su sütunundaki su ve boşluklarla ilişkilidir. Numuneler, numune toplama işleminden önce sıvı nitrojen ile sabit olduğu için, Cryo-SEM ' i s görüntüler, numune alma anında bitkinin su durumunu ve yerli embolizmi gösterir. (A) ve (B): Cryptomeria japonica (iğne odun) bir yetişkin ağacının iki yıllık dal. Dal çapı 3 mm, su potansiyeli ise − 0,39 MPa, Predawn hasat sırasında oldu. (C): Carpinus tschonoskii 'nin iki yıllık çekimi (diffü gözenekli ahşap) fide (1,4 m yükseklikte ve 1,1 cm bazal çaplarda). Fide, dört gün boyunca uzun süreli sulama sınırlamasından sonra gerginlik-rahatlama prosedürünü takiben örneklenmiş. Su potansiyeli, uzun bir kuraklık sonrası MPa 1,78 ve gerilim-rahatlama prosedürinden sonra − 0,15 MPa 'dır. Tr: tracheid, R: Ray parankimat, V: gemi, F: fiber, AP: eksenel parankimat. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: soğuk numune aşamasının sıcaklığını yükselterek defrost ve dağlama prosedür ilerlemesi. Bir Cryptomeria japonica dal (iğne ağacı) kkesin enine kesim yüzeyi. Numune aşamasının azalan sıcaklıkları (A) − 113,0 °C, (B) − 105,3 °C, (C) − 101,9 °C ve (D) − 99,7 °C ' dir. Her görüntü, soğuk numune aşamasının sıcaklığı ilgili sıcaklık değerine ayarlandıktan sonra yaklaşık 5 dakika elde edildi. Sahne sıcaklığının yaklaşık − 120 °C (ekipmanlarımız için) üzerinde tutulması durumunda buz süblimasyonu ilerler. Tr: tracheid, B: çukur çifti, PM: pit membran. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: bıçak işareti örneği. Bir Cryptomeria japonica dal (kıvrım ahşap) bir xylem enine kesim yüzeyi sözde bıçak işaretleri gösteren. Ok uçları ve kesikli çizgiler tipik bıçak işaretlerini temsil eder. Bir numunenin yüzeyinin bir kriyostat ile temizlenmesi, bıçak bıçağının kullanılmayan bir kısmı ile tamamlanmalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: su sütun gerginliğinin kanalların gevşemesi etkisi örneği. Cryo-SEM tarafından gözlenen bir Carpinus tschonoskii fide (diffü-gözenekli ahşap) kök enine kesim yüzeyi. Gün boyunca su potansiyeli her iki fide de benzerdi. Nirengi fide kökü bozulmamış dondurulmuş (A), başka fide kökü mevcut Hidrolik gerginlik (B) rahatlama sonra dondurulmuş iken. Hasat sırasında (B) su potansiyeli, gerginlik-rahatlama işleminden sonra − 0,5 MPa idi. Paneldeki ok uçları (A) gemiler içinde buz kristallerinin dondurulması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda sunulan Cryo-SEM gözlem yöntemleri, hücresel ölçekte su dağıtımını açıkça görselleştirmeye yönelik pratiktir. Bu yöntem sayesinde, xylem içinde su dağılımı değişiklikleri keşfetmek potansiyel abiyotik stres (su sıkıntısı veya donma) veya biyotik stres (ağaç hastalığı) ağaç türlerinin toleransı mekanizması açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir.

Bu yöntemde en önemli adım, numune toplama ve sonraki numune hazırlama sırasında yerel su durumunun su dağılımı özelliğini korumaktır. Uzun kanallar (özellikle halka gözenekli ağaçlar earlywood damarları) ile türlerin xylem doku kolayca hasat ve donma sırasında su kaybedebilir. Cochard ve al. (2000) xylem kanallar boyunca su sütununda yüksek gerginlik nedeniyle donma eserleri tartıştılar38,41. Umebayashi ve ark. (2016) Cryo-SEM gözlemleri gerilme-gevşek numuneler, tahribatsız MRG gözlem39karşılaştırıldığında geçerliliği doğruladı. Her iki gözlem teknikleri de benzer bir su dağılımı deseni gösterdi. Yüksek hidrolik gerginlik altında donma yoluyla indüklenen hava girişine karşı türlerin spesifik sağlamlığını doğrulamanız gerekse de, su dağılımlarının güvenilir tahminlerini sağlamak için rahatlama prosedürleri yapılmalıdır ve özellikle su-bitkiler vurguladı.

Frost ve buz parçacıkları ayrıntılı gözlem için önemli engellerdir. Don birikimini önlemek için, numune, Cryo-SEM numune odasına bağlı olana kadar atmosfere maruz kalmamalıdır. Numunenin numune odasına aktarılması sırasında atmosfere maruz kalma tamamen engellenmese de, Transfer süresi kısa tutulmalıdır. Numune tutucusunun yalıtım transfer konteynırı, numune tutucu ve LN2 ' nin ortadan kaldırıldıktan sonra, buz ve buzun çiğ yoğuşmadan kaynaklandığını önlemek için kurutulmalıdır.

Dondurulması için uygun zaman uzunluğu kullanılan araçların performansına bağlıdır. Bunu belirlemede önemli faktörler, numune odasındaki vakum seviyesi ve numune aşamasının sıcaklık kontrolörlerinin stabilitisidir. Sıcaklığa karşılık gelen süblimasyon kapsamı öncelikle resmi kullanmadan önce değerlendirilmelidir. Aşırı donma-aşındırma xylem kanallarının su varlığını zayıflatmak ve zor tespit edilmesi, dar hücrelerin Lumina özellikle yapmak.

Donma, hasat ve kesme prosedürleri sırasında yıkıcı numune alma yöntemlerinin artifakı oluşumuna karşı serbest kalmasını sağlamak için belirli adımlar ve çabaları gerektirir. Eserler oluşumunun önemi sıklıkla ortaya çıksa da, xylem kanallarının donma yapıtlarının oluşumu derecesi yeterli oranda doğrulanmadı38,39. Tahribatsız yöntemlerle daha fazla doğrulama, gerginlik-rahatlama prosedürü ve donma-fikreme doğruluğunu teyit etmek için arzu edilir. Synchrotron tabanlı μCT veya MRG sistemleri, Cryo-SEM sistemine kıyasla bitki-su ilişkilerinin çalışmasında yeterince yaygın olmadığından, ticari bir μCT sisteminin uygulanması Cryo-SEM sonuçlarının doğrulanmasını mümkün olabilir42 .

SAP Flux, kök segmentlerinin Hidrolik iletkenliği, iletkenlik yüzdesi kaybı (PLC) veya xylem kapasitans gibi hidrolik ağaç özellikleri, ağaç suyu kullanımı ve kuraklık direnci tahminleri sağlar. Türler arasında su kullanımı karşılaştırması, antropojenik iklim değişikliği2neden su stres altında ağaç hayatta kalma tahmin için gereklidir. Cryo-SEM gözlem Hidrolik özellikleri içinde değişikliklerin nedenini açıklığa kavuşturulması için anatomik bilgi sağlayarak birçok avantajı vardır. Bitki anatomik ve hidrolik çalışmalar hem yıkıcı ve yıkıcı olmayan yöntemlerin son gelişmeler birlikte ağaç suyu kullanımı doğası anlayışımızı derinleştirmek olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma JSPS KAKENHI tarafından desteklenmektedir (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 148 Cryo-SEM cryostat Freeze Fixation gerginlik gevşeme su dağılımı xylem kanallar
Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter