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木本植物的赛莱默水分布,用低温扫描电子显微镜可视化

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

观察木本植物中的水分布,可提供有关木本植物水流动力学的重要信息。在这项研究中,我们演示了使用低温和低温-SEM来观察原位赛莱默水分布的实用方法,消除了样品制备过程中水状态的伪性变化。

Abstract

安装低温单元(Cryo-SEM)的扫描电子显微镜允许在零度以下温度下观察标本,并用于利用液氮(LN)结合冷冻固定技术探索植物组织中的水分布2).然而,对于木本物种,由于木纤维的定向,观测木质横切表面的准备工作遇到了一些困难。此外,赛莱默导管中水柱的张力较高偶尔会导致水分布的伪性变化,尤其是在样品固定和收集过程中。在这项研究中,我们演示了一种使用低温和低温SEM来观察木本植物木质植物木质植物在原位中的水分布的有效程序。首先,在样品采集过程中,测量赛莱默水位应确定赛莱默导管中是否存在高张力。当赛莱默水位低时(2,用于冻结固定木莱姆的水状态。收获后,应注意确保样品保持冷冻,同时完成样品制备的观察程序。使用低温器来清楚地暴露木赛默横切表面。在 Cryo-SEM 观测中,需要对冷冻蚀刻进行时间调整,以消除霜尘并突出观察表面的细胞壁边缘。我们的研究结果证明了低温SEM技术在细胞和亚细胞水平上观察木莱默体内水分布的适用性。低温SEM与无损原位观测技术的结合,将大大提高对木本植物水流动力学的探索。

Introduction

水资源的可得性(即降水、土壤含水量)严格决定植物物种的死亡率和地理分布,因为它们需要从土壤中吸收水分并将其输送到叶子进行光合生产。工厂必须在水供应波动的情况下维护其水输送系统。特别是,木本植物在蒸腾流的管道中产生高度张力,因为在某些情况下,它们需要保持冠冠距地面100米以上。为了在如此高的负压下保持水柱,赛莱默导管由具有刚性和疏水性-玻璃化细胞壁1的管状细胞连续体组成。每个物种的赛莱默导管对赛莱默导管的脆弱程度是物种在波动的供水条件下生存的一个很好的决定因素。此外,研究赛莱默导管的水状况对于评估受非生物或生物胁迫的个别树木的健康状况非常重要。由于赛莱默导管的集成液压功能,测量树液流量或水位可以提供木本植物水状态的估计值。此外,可视化木马单元中的水分布可以阐明赛莱默液压系统各个部件的状况。

有几个技术来可视化赛莱默导管的水状态3。观察木质组织中的水通通的经典和有用的方法包括将切割树枝的末端浸入染料中或将染料注入立立的树茎4,从而染色水柱。软X射线摄影还允许可视化水分布的切片木盘,由于差异X射线吸收强度的水分在赛莱默5,6。然而,这些方法只提供水运动的轨迹或演示水的宏观分布。最近,无损观测技术,如微聚焦X射线计算机断层扫描(μCT)7,8,9,10和磁共振成像(MRI)11,12,已显著改善,允许观察水在木苗内的赛莱默管道内。这些无损方法具有很大的优点,即无需人工切割效果即可观察赛莱默的水状态,并通过顺序成像或引入对比剂10来跟踪水流动态。然而,我们需要使用定制的MRI进行植物成像或基于同步加速器的专门设施,以获得能够识别细胞水平含水量的图像。此外,虽然基于同步加速器的μCT系统能够获得具有高空间分辨率的精细图像,这与光显微镜7、8、9相媲美,但活细胞可能因此受伤。高能X射线辐射13,14。采用扫描电子显微镜,其中安装低温单元(cryo-SEM)是一种非常有用的方法,用于在细胞水平上精确定位木莱莱中的水,尽管这需要破坏性地采集样品进行观察。为了固定赛莱默导管中的水,部分茎(即树枝、树枝或茎)被液氮(LN2)原位冷冻。Cryo-SEM 对修剪的冷冻标本表面的观察提供了高度放大的赛莱默结构图像,从中我们可以将赛莱默管道中的水识别为冰。这种方法的一个重要限制是不可能对同一样品中的水可移动性进行连续观察。然而,应用_CT或MRI对生活在田地中的树木进行顺序观察是极具挑战性的,因为这些仪器是不可携带的。相比之下,Cryo-SEM有潜力在大树上使用这种技术进行实地实验,以清楚地显示水含量不仅在细胞水平,而且在更精细的结构水平,例如,水在血管间坑15,水细胞间空间16,或水柱17中的气泡。

许多研究观察木质水的低温SEM已报告5,12,18,19,20,21,23。 Utsumi等人(1996年)最初建立了观察木耳原地的规程,通过将LN2填充到固定在茎21上的容器中,将活的树干冷冻固定。样品在样品采集期间和低温SEM制备期间保持温度保持在-20°C以下,以避免在赛莱默导管内熔化冰。这种方法已用于观察赛莱默的水,以澄清在不断变化的水制度11,12,24,25,26下的水分布, 27、28、水分布的季节变化21、29、30,冻融周期的影响17、31 32、湿木中的水分布5、从树木到心木20的过渡过程中水分布的变化、季节的季节过程和容器的分化33,和由某些生物应力引起的气穴23,34。使用低温SEM35,36,也验证了液压导电性和导管容易气穴的影响。Cryo-SEM配备了能量分散X射线光谱仪(EDX或EDS),用于研究含有水37的试样表面的元件分布。

在高液压张力下,含有导管的活躯干的冷冻固定有时会导致人工气穴,而Cryo-SEM在导管38、39的流明中观察到这种气穴是断裂的冰晶。特别是,具有更长和更宽的导管的阔叶物种容易受到张力引起的伪影,例如样品切割引起的气穴,即使在水中进行3、40。在取样一棵透射树(即白天取样)或严重干旱条件下,气穴伪影变得显眼,它们可能会误导对气穴发生3、38的高估。 39.因此,必须释放在管道中工作的张力,以避免伪气穴3、12、39。

使用安装在试样室中的刀的冻裂技术通常用于暴露试样表面,以便进行低温-SEM 观察。然而,木质植物组织的冻裂平面,特别是次生木莱默的横截面,过于粗糙,无法清楚地观察组织6中的解剖特征和水。应用低温处理修剪试样,可快速、高质量地制备样品表面20、23。该方法的总体目标是为各种赛莱默细胞的原位水分布提供电子显微镜分辨率的证据,而没有出现采样伪影。我们介绍了我们更新的程序,自我们首次采用它以来,在样品表面的取样、修剪和清洁方面,为了获得木莱的低温固定样品的高质量电子显微图,程序得到了稳步改进。

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Protocol

注:此协议的原理图如图1所示。

1. 采样:赛莱默管道水柱内的张力松弛

注:在使用LN2之前,建议进行以下张力松弛处理,以避免在赛莱默水分布中出现冻结和紧张引起的伪影。

  1. 用黑色塑料袋将树枝和叶子封闭,以平衡木莱默和叶子之间的水位,在取样前两个多小时。
  2. 使用压力室或酶铬计确定样品中至少两片叶子的水位。当水位高于+0.5 MPa(即不存在或非常低的张力)时,可在冻结后采集样品(参见第2节:冻结固定)。当水位低于 ±0.5 MPa 时,需要进行放松处理,如下所述。
  3. 在阀杆周围固定一个防水衣领,以便充满水。没有底的塑料杯可以作为防水衣领。应小心使用胶带将茎和衣领之间的空间紧密密封,以防止随后使用的液体介质泄漏。对于收获灵活的茎,如细枝或树枝,通过弯曲茎将切割部分放入装满水的桶中。使用修剪剪或锯切到水面下。尽快将样品转移到另一个水容器中,以尽量减少将切端暴露到空气中。
  4. 将样品的切端放在水下。对于阔叶物种,确保从获得 SEM 的低温样品到收获的茎的切边处的长度超过样品的最大容器长度,以防止低温样品内出现张力诱发的伪影。
  5. 用黑色塑料袋覆盖含有叶子的样品,以减少蒸腾。将样品的切端留在水中,并将此情况保持大约 30 分钟,以放松木莱的张力。避免更长的放松时间(>1 h),因为可能人工重新填充气穴导管12。
  6. 再次测量水位,以确认木质张力的松弛(接近 0 MPa)。
    注:在取样前,应用空气注入方法研究或确定目标物种的最大容器长度。对一棵大树或大树枝进行取样时,很难执行上述张力松弛程序。因此,在天明水势较高时,必须在黎明前收集大树的样本。

2. 使用 LN2冻结固定

  1. 用剪刀或实用刀切割并打开防水衣领的一侧。用胶带将衣领紧紧固定在阀杆周围,同时水平握住孔径。
  2. 戴上绝缘手套/手套,但一定要安全地握住LN2瓶,并将LN2放入衣领中,用LN2填充。 通过稳定添加 LN2来完全冻结木莱姆中的水,保持填充。冻结所需的时间取决于样本大小;浇注LN2的沸腾后1分钟停止,足以用于小树枝或幼苗,而大树20的茎需要20分钟以上。由于 LN2与环境温度之间的巨大温差,在冻结期间连续添加 LN2,因为它会迅速蒸发。
  3. 从样品杆的冷冻部分取下衣领,以便在足够冷冻时间后去除LN 2。确保佩戴绝缘手套,以避免因拆卸衣领而出现潜在的 LN2溢出。
  4. 立即用精美的手锯收获样品。
  5. 用一块铝箔盖住冷冻样品,或将其放入样品管中,在样品管上写上样品ID号。迅速将收获的样品放入装满LN2的容器中,或包装在装满干冰的绝缘箱中。
  6. 将样品存放在深冰柜中,直到观察。首选储存温度为+80°C,以防止冰在储存过程中升华及其再结晶。

3. 标本制备

注:为了进行观察,必须修剪样品,并在零度以下温度下规划其观察表面,以保持水在原位分布。具有低温系统(低温)的生物微生物是使用Cryo-SEM进行此类观察时修剪和暴露标本表面的理想选择。

  1. 将低温室的试样室温度设置为+30°C,通常温度足够冷,使大多数植物的木质液处于冷冻状态。
  2. 将样品修剪成小块(
  3. 将修剪的件子连接到夹头上,将冷冻支架安装到组织冷冻嵌入介质(例如,OCT 化合物)上,用于冷冻切片。然后,将夹头连接到低温器微托的试样支架上。
  4. 通过用厚度为 5~7 μm 的截面重复剃须来修剪表面。通过从样品收集时的初始表面切割超过 1,000 到 2,000 μm 的总深度进行修剪,对于消除步骤 3.2 中所述的用刀或锯子预切造成的样品损坏部分非常有用。
  5. 大致修剪样品表面后,调整试样表面上方未使用的微托姆刀片部分。不要让刀片接触超过厚度设置的样品。
  6. 在第一次切割未使用的刀片部分之前,稍微拉宽试样表面和刀片之间的距离。
  7. 只切割样品表面一次或两次。此外,再次滑动刀片,调整试样表面未使用的刀片部分。
  8. 重复步骤 3.6 和 3.7 三或四次。这一点很重要,以便获得一个没有"刀痕"的清晰表面(图4)。
  9. 最终切割后,将刀片的位置设置在远离样品的位置,以防止灰尘粘在样品上。
  10. 将夹头从试样支架上拆下,用锋利的刀将冷冻嵌入介质从夹头上分离。确保将试样放置在冷冻室中,以防止其平面出现霜尘。
  11. 将标本连接到冷冻-SEM试样支架上,在冷冻室中加入组织冷冻嵌入介质。

4. 转移到Cryo-SEM标本室

注:在从冷冻室转移到低温-SEM试样室的观察阶段期间,必须保护表面准备的试样,防止温度升高或结霜。

  1. 根据设备的用户手册,使用 LN2将低温 SEM 试样室中的冷级温度保持在 ±120°C 以下。
  2. 将装有制备试样的试样支架放入装有LN2的绝缘容器中,放入冷冻室中。
  3. 在 LN2下方用试样交换杆握住试样支架。尽可能避免将试样支架暴露在空气中。
  4. 一旦开始疏散预疏散室,立即将试样支架设置为冷冻-SEM 试样室的预疏散室。然后,在空气完全排出后,将试样支架放在冷台上。虽然一点霜冻积累是不可避免的,但"冷冻蚀刻"程序(步骤6)可以去除它。

5. 在 SEM 中设置

注: 观察的典型设置如下所述。根据真空状况或电子束,需要进行一些修改。

  1. 设置用于观察的 SEM 参数,如下所示:
    加速度电压:3~5千伏
    试样阶段温度: < ±120 °C
    探测器:二次发射

6. 冷冻蚀刻

注:冷冻蚀刻是通过微微的冰晶升华来突出样品细胞壁边缘的过程。冷冻蚀刻还涉及去除表面霜尘。

  1. 在冻结蚀刻过程中打开电枪的加速度电压。最好在观察标本时进行冷冻蚀刻。
  2. 将试样阶段的温度升高至 +100 °C。
  3. 等待几分钟,直到除去霜尘,与细胞壁相比,木座细胞中的冰表面水平略有下降。
  4. 将试样阶段的温度降至 +120°C。
    注:如果试样阶段没有安装温度控制器,则使用交换杆握住试样,并将其从试样阶段分离几分钟。在此冷冻蚀刻过程中,多次观察试样,以验证试样的升华状态。

7. 金属涂层(可选)

注:SEM 仪器和图像处理的最新改进可提供没有金属涂层的电绝缘试样高质量图像。然而,非导电标本,如生物材料,有时要收费;由于电子的积累("充电"),样品特定位置的亮度更高。将试样暴露在电子束上更长时间或放大率较高,可增加充电效果。用导电金属材料涂覆试样表面可防止充电的发生。使用安装在 Cryo-SEM 单元中的真空涂层系统,以防止试样在涂布过程中温度升高。

  1. 确保涂层材料安装在涂层系统的指定蒸发器头。
  2. 将涂层系统中的冷级温度保持在 +170 °C 以下。
  3. 在充分冷冻蚀刻后,将试样支架放在涂层系统的冷台上。
  4. 打开冷级和蒸发器头之间的隔板。
  5. 将蒸发器头的电流值和电压值分别设置为 30 mA 和 ca 5 V。
  6. 蒸发涂层材料约30s,以涂覆试样的表面。
  7. 将蒸发器头的电流和电压值设置为零并关闭分区。
  8. 将试样支架放在试样室的冷台上进行观察。

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Representative Results

低温-SEM观察到的针叶树木莱默横切表面的代表性图像如图2所示。在低放大倍率下,图像中的黑色区域表示水完全或部分消失的空腔,灰色区域表示木座细胞壁、细胞质和水(图 2A)。在高放大倍率下,很明显,水并非完全从三个气管的亮度中消失,这表明在木质液原位中出现微泡(图2B)。对于阔叶物种,在容器内很容易检测到气穴发生,而水的存在很难在纤维内区分,特别是在低倍率下(图2C)。通过冰原纹理(如图2B),可区分帕伦奇马细胞中的细胞质与冰原或血管内的水。

温度对冷冻蚀刻过程的影响如图3所示。霜冻粉尘逐渐去除,隔膜膜随着温度的升高而逐渐变清。剩余的大霜尘颗粒可以通过进一步的冻结蚀刻来消除,但这可能是有问题的,因为它不必要地降低了赛莱默导管中的冰的表面水平。

高质量的观察主要通过精确的标本制备来实现;特别重要的是用微缩器的锋利刀片平滑表面。用过的刀片的平滑性不足有时会导致表面粗糙(称为"刀痕",图4)或切割产生的灰尘大量。在仔细规划试样表面后,将试样快速转移到试样室对于消除霜冻形成造成的污染也至关重要。

样品冻结而不松弛负水柱压力会导致木莱莱管道中气穴的伪诱导(图5)。在样品容器中观察到聚集的冰晶,样本没有放松(图5A中的箭头),与此相反,在具有类似水位的放松样品中未观察到聚集的冰晶(图 5B)这往往在阔叶树的木质比针叶树(未公布的数据)中更为显著。

Figure 1
图 1:此协议的示意图。显示了从取样到 SEM 观察的过程流程。本文介绍了这些过程。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:血管瘤树种和健美树种横向切面的低温-SEM显微图示例。木莱细胞中的灰色和黑色区域分别对应于赛莱默细胞水柱中的水和腔。由于样品在采集样品前用液氮冷冻固定,Cryo-SEM 的图像显示了植物在取样时的水分状况和原生栓塞。(A) 和 (B): 两岁的小树枝的成人树的加密木(针叶木)。树枝的直径为3毫米,在黎明前收获时,水势为±0.39 MPa。(C):两岁的卡皮努斯·乔诺斯基(漫射多孔木材)幼苗(1.4米高,基底直径1.1厘米)。在长时间的灌溉限制四天后,在紧张放松程序后对幼苗进行取样。长期干旱后,水位为 ±1.78 MPa,在张力放松程序后为 ±0.15 MPa。Tr: 气管, R: 射线气管, V: 容器, F: 纤维, AP: 轴向气管。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:通过提高冷试样阶段的温度进行除霜和蚀刻过程。隐式木枝(针叶木)的木耳的横向切割表面。试样阶段的降低温度为 (A) ±113.0 °C,(B) ±105.3 °C,(C) ±101.9 °C 和 (D) ±99.7 °C。在冷试样阶段温度设定在相应的温度值后,每幅图像大约5分钟。如果舞台温度保持在约 +120 °C 以上(对于我们的设备),则冰升华会进行。Tr:气管,B:边界坑对,Pm:坑膜。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:刀标示例。隐式木枝(针叶木)的木质表的横向切割表面,显示所谓的刀痕。箭头和虚线表示典型的刀痕。用冷冻器清除试样表面应由刀刃的未使用部分完成。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:导管中水柱张力松弛效果的例子。低温-SEM观测到的卡皮努斯·茨乔诺斯基幼苗(漫射多孔木材)的横切表面。白天的水位在两个幼苗中都相似。蒸腾幼苗的茎被完整地冷冻(A),而另一种幼苗的茎在放松现有的液压张力(B)后被冷冻。在拉伸放松程序后,(B)在收获时的水位为±0.5 MPa。面板(A)中的箭头是冰晶在容器内的冻结工件。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

本文引入的低温-SEM观测方法对于在细胞尺度上清晰地可视化水分布具有实用意义。通过这种方法,探索木莱默内水分布的变化,可能有助于阐明树种对非生物应激(缺水或冷冻)或生物应激(树病)的耐受性机制。

该方法最关键的步骤是在样品采集和随后的样品制备过程中保持原生水状态的水分布特性。具有长导管的物种的赛莱默组织(尤其是环状孔状树木的早期木容器)在收获和冷冻期间很容易失去水分。Cochard等人(2000年)已经讨论了冻结文物,由于水柱高度紧张沿赛莱默管道38,41。Umebayashi等人(2016年)通过非破坏性MRI观测39,证实了对张力放松样品的低温-SEM观测的有效性。两种观测技术都显示了类似的水分布模式。尽管我们仍然需要验证在高水力张力下冻结引起的空气进入的物种特定鲁棒性,但应执行松弛程序,以提供可靠的水分布估计,特别是水压植物。

霜冻和冰粒是详细观测的重要障碍。为了防止霜冻堆积,在附着在低温SEM试样室之前,不应将试样暴露在大气中。虽然在将样品转移到试样室期间不能完全防止接触大气,但转移时间应保持短。取出试样支架和LN2后,试样支架的绝缘转移容器应干燥良好,以防止因露水凝结而结霜和结冰。

冷冻蚀刻的适当时间长度取决于所用仪器的性能。确定这一点的重要因素是试样室中的真空水平和试样阶段温度控制器的稳定性。在正式使用之前,应主要评估与温度对应的升华程度。过度的冷冻蚀刻会减弱赛莱默导管中水的存在,并难以识别,特别是在狭窄细胞的灯具中。

它采取具体步骤和努力,确保在冷冻、收获和修剪过程中,破坏性取样方法没有伪影发生。虽然人们经常指出伪像发生的意义,但赛莱默导管中冻结伪像的发生程度尚未得到充分的验证。通过非破坏性方法进行进一步验证,是确认张力松弛程序和冻结固定的准确性。由于与低温-SEM系统相比,基于同步加速器的μCT或MRI系统在植物-水关系的研究中不够普遍,因此应用商用μCT系统可能会推进低温-SEM结果的验证42.

水力树状,如树液通量、茎段的液压电导率、电导率(PLC)或木质电容百分比,提供了树木用水和抗旱能力的估计。为了预测人为气候变化造成的水胁迫下的树木生存,需要比较物种之间的用水量2。Cryo-SEM 观测在提供解剖学知识以澄清液压特征内变化的原因方面有许多优势。最近植物解剖学和水力研究的破坏性和非破坏性方法的改进可以共同加深我们对树木用水性质的理解。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了JSPS KAKENHI(No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

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References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

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环境科学 问题 148 低温 SEM 低温 冷冻固定 张力松弛 水分配 赛莱默导管
木本植物的赛莱默水分布,用低温扫描电子显微镜可视化
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Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

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