利用冷冻扫描电子显微镜观察木本植物中木质部的水分分布

摘要

观察木质部内的水分分布可为了解木本植物中水分流动动态提供重要信息。本研究展示了原位观察木质部水分分布的实用方法。 通过使用冷冻切片机和冷冻扫描电镜（cryo-SEM），可在样品制备过程中消除水分状态的人为假象变化。

摘要

安装了低温装置的扫描电子显微镜（cryo-SEM）可在低于零度的温度下对样品进行观察，并已结合液氮（LN₂）冷冻固定技术用于研究植物组织中的水分分布。然而，对于木本植物，由于木材纤维的取向问题，制备用于观察木质部横切面的样品存在一定的困难。此外，木质部导管中水柱的较高张力有时会在样品固定和采集过程中引起水分分布的人为假象。在本研究中，我们展示了一种利用恒冷箱（cryostat）和 cryo-SEM 原位 观察木本植物木质部内水分分布的有效方法。首先，在采集样品时，应测定木质部水势，以判断木质部导管中是否存在高张力。当木质部水势较低（< 约 −0.5 MPa）时，需进行张力松弛处理，以在样品冷冻固定过程中更好地保持木质部导管内的水分状态。接着，在树干周围安装一个密封的环状夹具，并注入 LN₂ ，以实现木质部水分状态的快速冷冻固定。样品采集后，必须确保在完成样品制备以供观察的过程中始终保持样品处于冻结状态。使用恒冷箱可清晰暴露木质部的横切面。在 cryo-SEM 观察中，需调整冷冻蚀刻时间，以去除表面霜尘并增强观察面上细胞壁边缘的可见性。我们的结果证明了 cryo-SEM 技术在细胞和亚细胞水平上观察木质部内水分分布的适用性。将 cryo-SEM 与非破坏性原位观察技术相结合，将极大地促进对木本植物水分流动动态的研究。

引言

水资源（即降水、土壤含水量）的可获得性严格决定了植物物种的死亡率和地理分布，因为植物需要从土壤中吸收水分并将其运输至叶片以进行光合作用。植物必须在水分供应波动的条件下维持其水分运输系统的正常功能。特别是木本植物在其导管中沿蒸腾流产生很高的张力，因为在某些情况下，它们需要将树冠维持在距地面超过约100米的高度。为了在如此高的负压下维持水柱的连续性，木质部导管由一系列具有坚硬且富含疏水性木质素细胞壁的管状细胞构成¹。每种植物木质部导管对功能障碍的敏感性是判断该物种在水分供应波动条件下生存能力的良好指标²。此外，研究木质部导管的水分状态对于评估个体树木在非生物或生物胁迫下的健康状况具有重要意义。通过测量树液流速或水势，可以基于木质部导管的整体性水分传导功能来估算木本植物的水分状态。进一步地，对木质部细胞中水分分布进行可视化观察，有助于阐明木质部水分传导系统中各个组成部分的实际状况。

目前存在多种用于可视化木质部导管水分状况的技术³。观察木质组织中水分路径的经典且有效的方法包括：将切断枝条的末端浸入染料中，或向直立树木的茎干中注射染料，以对水柱进行染色⁴。软X射线摄影也可用于显示木材切片中的水分分布，其原理是基于木质部中水分对X射线吸收强度的差异^5,6。然而，这些方法仅能提供水分移动的轨迹，或展示水分的宏观分布情况。近年来，非破坏性观测技术，如微焦点X射线计算机断层扫描（µCT）^7,8,9,10和磁共振成像（MRI）^11,12，已得到显著改进，能够实现对完整幼苗木质部导管中水分的观察。这些非破坏性方法具有显著优势：可避免人为切割带来的影响，从而直接观察木质部的水分状态；同时，通过连续成像或引入对比剂，还可追踪水分流动的动态过程¹⁰。然而，要获得能够识别细胞水平含水量的图像，必须使用专用于植物成像的定制MRI设备，或基于同步辐射的µCT专用设施。此外，尽管基于同步辐射的µCT系统能够获得空间分辨率与光学显微镜相当的精细图像^7,8,9，但高能X射线的辐射可能对活细胞造成损伤^13,14。使用配备冷冻装置的扫描电子显微镜（cryo-SEM）是一种在细胞水平上精确定位木质部水分的非常有效的方法，但该方法需要对样品进行破坏性采样。为固定木质部导管中的水分，需将茎段（如小枝、枝条或茎）原位浸入液氮（LN₂）中进行速冻。通过cryo-SEM观察修整后的冷冻样品表面，可获得高度放大的木质部结构图像，从而将导管中的水分以冰的形式识别出来。该方法的一个显著局限性在于，无法对同一样品进行连续的水分可动性观察。然而，将µCT或MRI应用于野外生长树木的连续观测极具挑战性，因为这些仪器不具备便携性。相比之下，cryo-SEM在野外实验中对大型树木的应用具有潜力，可清晰地可视化不仅在细胞水平，而且在更精细结构水平上的水分分布，例如导管间纹孔中的水分¹⁵、细胞间隙中的水分¹⁶，以及水柱中的气泡¹⁷。

已有关于利用冷冻扫描电镜观察木质部水的大量研究报道 ^{5,12,18,19,20,21,23}Utsumi 等人（1996）首次建立了原位观察木质部的实验方案 通过液氮填充对活体树干进行冷冻固定₂ 放入置于茎部的容器中²¹样品采集及冷冻扫描电镜制样过程中，样品温度始终保持在-20 °C以下，以避免木质部导管中冰的融化。该方法已被用于观察木质部中的水分，以阐明不同水分条件下水分的分布情况。^{11,12,24,25,26,27,28}，水分分布的季节性变化^21,29,30，冻融循环的影响^17,31,32湿木材中水分的分布⁵，从边材向心材转变过程中水分分布的变化²⁰，形成层活动及导管分化的季节性时间进程³³以及某些生物胁迫引起的空穴现象^23,34. 使用冷冻扫描电镜（cryo-SEM）也验证了导水率和导管对空穴化的脆弱性^35,36配备能量色散X射线能谱仪（EDX或EDS）的冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）已被用于研究含水样品表面的元素分布³⁷.

对含有处于高水力张力下导管的活体树干进行冷冻固定时，有时会导致人为的空穴现象，这种现象在冷冻扫描电镜（cryo-SEM）下表现为导管腔内冰晶的破裂^38,39。特别是导管较长且较宽的阔叶树种更容易受到张力诱导的人为假象影响，例如即使在水下切割样本也可能引发空穴现象^3,40。在蒸腾作用进行中的树木采样（即白天采样）或严重干旱条件下，空穴假象尤为明显，可能导致对空穴发生程度的高估^3,38,39。因此，必须释放导管内的张力，以避免产生人为的空穴现象^3,12,39。

使用安装在样品室中的刀具进行冷冻断裂技术常用于暴露样品表面，以便进行冷冻扫描电镜（cryo-SEM）观察。然而，木本植物组织的冷冻断裂面，特别是次生木质部的横切面，表面过于粗糙，难以清晰观察组织结构特征以及组织中的水分分布⁶。应用恒冷切片机（cryostat）对样品进行修整，可实现样品表面的快速且高质量制备^20,23。本方法的总体目标是，在不产生取样假象的前提下，利用电子显微镜分辨率提供原位状态下不同类型木质部细胞中水分分布的直接证据。我们介绍了自首次采用以来持续改进的更新版操作流程，涉及取样、修整及清洁样品表面，以获得高质量的木质部冷冻固定样品的电子显微图像。

方案

注意：本实验方案的示意图见图1。

1. 取样：木质部导管水柱内的张力弛豫

注意：建议在应用液氮（LN₂）之前进行以下张力弛豫处理，以避免木质部水分分布中出现冻结和张力诱导的人为假象。

1. 在采样前两小时以上，用黑色塑料袋包裹待采样的枝条和叶片，使木质部与叶片之间的水势达到平衡。
2. 使用压力室或露点微伏计测定样品中至少两片叶片的水势。当水势高于约 −0.5 MPa（即无张力或张力极低）时，可在冷冻后采集样品（参见第2节：冷冻固定）。当水势低于 −0.5 MPa 时，则需进行如下所述的松弛处理。
3. 在茎干周围安装一个防水套环，以便注水。可使用无底的塑料杯作为防水套环。 应使用胶带严密封闭茎干与套环之间的缝隙，防止后续使用的液体介质泄漏。对于柔韧的茎干（如细枝或小枝），可通过弯曲茎干将切割部位浸入盛水的桶中，并在水面以下使用修枝剪或锯子进行切割。 应尽快将样品转移至另一盛水容器中，以尽量减少切口暴露于空气的时间。
4. 保持样品切口始终浸没于水中。对于阔叶树种，应确保用于扫描电镜（SEM）的冷冻样品取样位置至茎段切口的距离大于该物种导管的最大长度，以避免冷冻样品中出现张力诱导的人为假象。
5. 用黑色塑料袋覆盖带有叶片的样品，以减少蒸腾作用。将样品切口保持在水中，并维持此状态约30分钟，以解除木质部张力。应避免过长的松弛时间（>1 h），以防空穴化导管发生人为的重新充水¹²。
6. 再次测量水势，以确认木质部张力已得到释放（接近0 MPa）。
   注意：在采样前，应通过空气注入法对目标物种的最大导管长度进行研究或测定。当采集大型树木或粗大树枝时，难以实施上述张力松弛操作，因此必须在黎明前时段采集大树木的样品，此时木质部水势较高。

2. 使用液氮进行冷冻固定₂

1. 用剪刀或美工刀剪开并打开防水套管的一侧。将套管开口保持水平，用胶带紧密地固定在茎秆周围。
2. 佩戴绝缘手套或连指手套，但需确保握紧液氮瓶₂ 安全地运行 LN₂ 注入LN以填满套管₂持续添加液氮以保持其充满。₂ 完全冻结木质部中的水分。冻结所需时间取决于样品大小；1 分钟 煮沸倒入的液氮后₂ 已停止 对于小枝条或幼苗而言，足够的时间为20分钟，而较大的树木茎干则需要超过20分钟²⁰加入LN₂ 在冷冻过程中持续添加，因其在液氮（LN）与环境间存在较大温差时会迅速蒸发₂ 和环境温度。
3. 从样本茎的冷冻部分上取下套环，以移除液氮₂ 在充分冷冻后。务必佩戴隔热手套，以避免接触潜在的液氮₂ 因拆卸颈圈导致的溢出。
4. 立即使用细齿手锯采集样本。
5. 用铝箔覆盖冷冻样品或将样品放入已标记样品编号的样品管中。迅速将采集的样品置于装有液氮的容器中₂ 或装入装有干冰的保温箱中。
6. 将样品储存于超低温冰箱中直至观察。推荐储存温度为−80 °C，以防止储存过程中冰的升华及其再结晶。

3. 样品制备

注意：为了进行观察，必须在零下温度下对样品进行修整，并将其观察表面刨平，以保持其木质部中水分分布的原位状态。在冷冻扫描电镜观察中，使用带有恒冷系统（恒冷切片机）的生物切片机是修整样品并暴露其表面的理想选择。

1. 将冷冻切片机的样品室温度设置为−30 °C，该温度通常足以使大多数植物的木质部汁液保持在冻结状态。
2. 将样品修剪成小块（< 高约2 cm，< 宽或直径约1 cm），以便适配冷冻扫描电镜的样品台。使用锋利的刀片或细齿锯进行修剪，以防止样品内部的冰晶破裂。若样品较大而无法用刀切割，可在冷冻箱中用预冷的锯子快速预切。
3. 将修剪好的样品块附着在冷冻切片机的卡盘（即样品夹持器）上，方法是将其固定在组织冷冻包埋介质（例如OCT包埋剂）上，用于冷冻切片。 然后将卡盘安装到冷冻切片机的切片微调装置的样品台上。
4. 通过反复切去厚度为5–7 µm的切片来修平样品表面。从采样时的初始表面起，总共切去1,000至2,000 µm深度的材料，有助于消除步骤3.2中使用刀或锯预切时造成的样品损伤区域。
5. 在大致修平样品表面后，将切片刀未使用过的部分调整至样品表面上方。注意不要让刀片接触样品，以免超出设定的切片厚度。
6. 在使用刀片未使用部分进行首次切割前，略微增大样品表面与刀片之间的距离。
7. 仅对样品表面切割一至两次，随后再次滑动刀片，并将刀片的未使用部分重新调整至样品表面。
8. 重复步骤3.6和3.7三到四次。此操作至关重要，以获得无“刀痕”的清晰表面（图4）。
9. 完成最终切割后，将刀片移离样品较远位置，以防止灰尘粘附到样品上。
10. 将卡盘从样品台取下，并用锋利的刀片去除冻结的包埋介质，从而将样品从卡盘上分离。确保样品始终置于冷冻切片机室内，以防止其已切平面受到霜尘污染。
11. 在冷冻切片机室内，使用组织冷冻包埋介质将样品固定于冷冻扫描电镜的样品台上。

4. 转移至冷冻扫描电镜样品室

注意：从冷冻切片机腔室转移到冷冻扫描电镜样品室的观察台过程中，必须防止表面处理后的样品温度升高或结霜。

1. 根据设备用户手册，使用液氮（LN₂）将冷冻扫描电镜样品室中的冷台温度维持在 –120 ˚C 以下。
2. 将带有制备好样品的样品 holder 置于充满液氮（LN₂）的保温容器中，并放入冷冻恒温腔内。
3. 在液氮（LN₂）下方用样品交换杆夹持样品 holder。应尽可能避免将样品 holder 暴露于空气中。
4. 一旦开始对冷冻扫描电镜样品室的预抽真空室进行抽气，立即迅速将样品 holder 转移至预抽真空室 。待空气完全抽尽后，再将样品 holder 放置到冷台上。尽管会有少量霜的积聚难以避免，但后续的"冷冻蚀刻"步骤（步骤6）可将其去除。

5. 扫描电镜中的设置

注意：以下描述了观察的典型设置。根据真空条件或电子束的不同，需要进行一些调整。

1. 设置扫描电镜观察参数如下：
   加速电压：3–5 kV
   样品台温度：< −120 °C
   探测器：二次电子发射

6. 冷冻蚀刻

注意：冷冻蚀刻是通过轻微的冰晶升华来凸显样品细胞壁边缘的步骤。冷冻蚀刻还涉及去除表面的霜尘。

1. 在冷冻蚀刻过程中开启电子枪的加速电压。最好在观察样品的同时进行冷冻蚀刻。
2. 将样品台温度升至 −100 °C。
3. 等待数分钟，直至霜尘被去除，且木质部细胞中冰的表面水平相较于细胞壁略有下降。
4. 将样品台温度降至 −120 °C。
   注意：若样品台未配备温度控制器，可使用交换杆夹持样品并将其从样品台上取下数分钟。在此冷冻蚀刻过程中应多次观察样品，以确认样品的升华状态。

7. 金属涂层（可选）

注意：扫描电镜仪器和图像处理技术的近期改进使得无需金属镀膜即可获得电绝缘样品的高质量图像。然而，非导电样品（如生物材料）有时会发生电荷积累现象；即由于电子积聚，样品特定位置出现亮度升高（“荷电”）。对样品进行较长时间的电子束照射或高倍观察时，荷电效应会加剧。通过在样品表面镀覆导电性金属材料可防止荷电现象的发生。为防止镀膜过程中样品温度升高，应使用安装在冷冻扫描电镜单元内的真空镀膜系统进行操作。

1. 确保将镀膜材料安装在镀膜系统的指定蒸发头上。
2. 保持镀膜系统冷台的温度低于 −170 °C。
3. 在充分完成冷冻蚀刻后，将样品台置于镀膜系统的冷台上。
4. 打开冷台与蒸发头之间的隔板。
5. 将蒸发头的电流值和电压值分别设置为约 30 mA 和约 5 V。
6. 蒸发镀膜材料约 30 秒，以对样品表面进行镀膜。
7. 将蒸发头的电流和电压值均设为零，并关闭隔板。
8. 将样品台移至观察用样品室的冷台上。

结果

通过冷冻扫描电镜观察到的针叶树和阔叶树木质部横切面的代表性图像如图2所示。在低倍镜下，图像中的黑色区域表示水分完全或部分消失的空腔，灰色区域则表示木质部细胞壁、细胞质以及水分（图2A）。在高倍镜下，可以明显看出三个管胞的腔体中水分并未完全丧失，表明木质部汁液中原位存在大尺度气泡（图2B）。对于阔叶树种而言，导管内的空穴现象易于检测，而纤维内部的水分则难以分辨，尤其是在低倍镜下（图2C）。通过冰晶纹理特征，可将薄壁细胞中的细胞质与管胞或导管中的水分区分开来（例如，图2B）。

讨论

本文介绍的冷冻扫描电镜观察方法在清晰可视化细胞尺度上的水分分布方面具有实用性。通过该方法，探究木质部内水分分布的变化，有望帮助阐明树种对非生物胁迫（缺水或冰冻）或生物胁迫（树木病害）耐受性的机制。

该方法中最关键的步骤是在样品采集及后续制备过程中保持样品原有水分状态的水分分布特征。具有较长导管的物种（尤其是环孔树种的早材导管）在采收和冷冻过程中容易失水。Cochard 等人（2000 年）曾讨论过由于木质部导管中水柱处于高张力状态而导致的冷冻假象^38,41。Umebayashi 等人（2016 年）通过与非破坏性的磁共振成像（MRI）观测结果进行比较，验证了张力释放样品的低温扫描电镜（cryo-SEM）观测结果的可靠性³⁹。两种观测技术显示出相似的水分分布模式。尽管我们仍需验证不同物种在高水力张力下因冷冻引发的进气现象所表现出的特异性抗性，但为获得可靠的水分分布估算结果，特别是对于水分胁迫植物，应实施张力释放处理步骤。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包被材料	JOEL Ltd., Japan	金丝，0.50 × 1000 mm，纯度99.99%，货号 125000499
冷冻扫描电子显微镜	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510，配备 MP-Z09085T / MP-51020ALS
恒冷箱切片机	Thermo Scientific	CryoStar NX70
切片机刀片	Thermo Scientific	HP35 ULTRA 一次性切片刀片，3153735
组织冷冻包埋介质	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix 包埋树脂，6769006