Summary
Het observeren van de waterdistributie binnen de Xylem geeft belangrijke informatie over de Water stromings dynamiek in bosrijke planten. In deze studie demonstreren we de praktische aanpak om Xylem waterdistributie in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM, die artefactuele veranderingen in de water status elimineert tijdens de monstervoorbereiding.
Abstract
Een Scanning elektronenmicroscoop geïnstalleerd Cryo-Unit (Cryo-SEM) maakt specimen observatie op subzero temperaturen en is gebruikt voor het verkennen van waterdistributie in plantaardige weefsels in combinatie met Freeze fixatie technieken met behulp van vloeibare stikstof (LN 2). voor houtachtige soorten, echter, de voorbereidingen voor het observeren van de Xylem transversale-cut oppervlak te betrekken sommige problemen als gevolg van de oriëntatie van houtvezels. Bovendien, hogere spanning in de waterkolom in Xylem leidingen kan soms leiden tot artefactuele veranderingen in de waterdistributie, vooral tijdens de steekproef fixatie en collectie. In deze studie demonstreren we een efficiënte procedure om de waterverdeling binnen de Xylem van bosrijke planten in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM. Op het eerste, tijdens de monsterverzameling, het meten van de Xylem water potentiaal moet bepalen of hoge spanning aanwezig is in de Xylem leidingen. Wanneer het Xylem water potentieel laag is (< ca. − 0,5 MPa), is een spannings ontspannings procedure nodig om een betere bewaring van de watertoestand in Xylem leidingen te vergemakkelijken tijdens steekproef bevriezen fixatie. Vervolgens is een waterdichte kraag bevestigd rond de boomstam en gevuld met LN2 voor het bevriezen van de fixatie van de watertoestand van Xylem. Na het oogsten moet ervoor worden gezorgd dat het monster bevroren blijft, terwijl de procedures voor de monstervoorbereiding voor observatie worden voltooid. Een cryostat wordt gebruikt om het Xylem transversale-besnoeiings oppervlak duidelijk bloot te stellen. In Cryo-SEM observaties, is de tijd aanpassing voor vorst-etsen vereist om vorst stof te verwijderen en de rand van de celwanden op de het bekijken oppervlakte te accentueren. Onze resultaten tonen de toepasbaarheid van Cryo-SEM technieken voor de observatie van de waterdistributie binnen Xylem op cellulaire en subcellulaire niveaus. De combinatie van Cryo-SEM met niet-destructieve in situ observatietechnieken zal de exploratie van de hout Stromingsdynamica van de plantaardige water diep verbeteren.
Introduction
Beschikbaarheid van watervoorraden (dat wil zeggen, neerslag, bodem waterinhoud) bepaalt strikt de sterfte en de geografische spreiding van plantensoorten, omdat ze nodig hebben om water te absorberen uit de bodem en het vervoer naar de bladeren voor fotosynthetische productie. De installaties moeten hun systeem van het watervervoer onder fluctuerende watervoorraden handhaven. In het bijzonder, bosrijke planten genereren hoge spanningen in hun leidingen langs de transpiratie stromen als, in sommige gevallen, ze nodig hebben om hun kroon te houden meer dan ~ 100 m boven de grond. Om water kolommen onder zulk hoge negatieve druk te handhaven, bestaan de Xylem leidingen uit een continuüm van tubulaire cellen met stijve en hydrofobe-lignified celwanden1. De kwetsbaarheid voor Xylem dysfunctie van Xylem leidingen in elke soort is een goede determinant van de soorten overleving onder fluctuerende watervoorziening2. Bovendien is het bestuderen van de water status van Xylem leidingen belangrijk voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van individuele bomen die aan abiotische of biotische spanningen worden onderworpen. Het meten van SAP flow of water potentiaal kan schattingen geven van de water status van een bosrijke plant door de geïntegreerde hydraulische functie van Xylem leidingen. Bovendien kan het visualiseren van de distributie van water in Xylem cellen de conditie van individuele componenten van het Xylem hydraulisch systeem verduidelijken.
Verscheidene technieken om de water status van Xylem leidingen te visualiseren bestaan3. De klassieke en nuttige methoden voor het observeren van waterwegen in woody weefsel te betrekken kleuring de waterkolom door het onderdompelen van de uiteinden van de gesneden takken in een kleurstof of door het injecteren van een kleurstof in staande boom stengels4. Zachte x-ray fotografie maakt het ook mogelijk de visualisatie van het waterdistributie van gesneden hout schijven als gevolg van de differentiële x-ray absorptie intensiteit van het vocht in Xylem5,6. Deze methodes, echter, verstrekken slechts sporen van water beweging of tonen macroscopische distributies van water aan. Onlangs, niet-destructieve observatietechnieken, zoals MicroFocus X-Ray computertomografie (µ CT)7, 8,9,10en Magnetic Resonance Imaging (MRI)11, 12, zijn significant verbeterd om observatie van water in Xylem leidingen binnen intacte jonge boompjes toe te staan. Deze niet-destructieve methoden hebben grote voordelen in dat we de water status van de Xylem kunnen observeren zonder kunstmatige snij effecten, en we kunnen water Stromingsdynamica volgen door sequentiële beeldvorming of een contrast agent10. Echter, we moeten gebruik maken van een aangepaste MRI voor plant Imaging of een gespecialiseerde faciliteit voor synchotron-based µ CT om de beelden die kunnen identificeren cellulaire niveau waterinhoud te verkrijgen. Bovendien, hoewel het synchotron-based µ CT-systeem in staat om fijne beelden te verkrijgen met een hoge ruimtelijke resolutie, die vergelijkbaar is met de Lichtmicroscopie7,8,9, levende cellen kunnen worden verwond door de straling van hoge energie röntgenstraal13,14. Gebruik maken van een Scanning elektronenmicroscoop waarin Cryo-units zijn geïnstalleerd (Cryo-SEM) is een zeer nuttige methode voor het nauwkeurig lokaliseren van het water in Xylem op een cellulair niveau, hoewel dit vereist destructief oogsten van de steekproef voor observatie. Om het water in Xylem leidingen vast te stellen, wordt een deel van de stengels (d.w.z. twijgen, takken of stengels) in situ bevroren door vloeibare stikstof (LN2). Observaties van het oppervlak van getrimd, bevroren specimens door Cryo-SEM bieden sterk vergrote beelden van de Xylem structuur van waaruit we kunnen het water in Xylem leidingen als ijs te identificeren. Een significante beperking van deze methode is dat de opeenvolgende observatie van water beweeglijkheid binnen de zelfde steekproef onmogelijk is. Nochtans, is de toepassing van µ CT of MRI voor opeenvolgende observatie van bomen die in een gebied leven uiterst uitdagend omdat deze instrumenten niet draagbaar zijn. In tegenstelling, Cryo-SEM heeft een potentieel voor het gebruik van deze techniek op grote bomen in veldexperimenten om duidelijk te visualiseren waterinhoud op niet alleen het cellulaire niveau, maar ook op een fijnere structuur niveau, bijvoorbeeld, water in intervasculaire pits15, water in intercellulaire ruimten16, of bellen in waterkolom17.
Veel studies observeren Xylem water door Cryo-SEM zijn gemeld 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) vestigde aanvankelijk het protocol voor observatie van Xylem in situ door bevriezen-bevestiging van een het leven boomstam via het vullen van LN2 in een container die op de steel wordt geplaatst21. De temperatuur van de steekproef werd gehandhaafd onder-20 °C tijdens steekproef inzameling en tijdens Cryo-SEM voorbereiding om het smelten van het ijs binnen Xylem leidingen te vermijden. Deze methode is gebruikt om het water in Xylem te observeren om de waterverdeling te verduidelijken onder een ander waterregime11,12,24,25,26, 27,28, de seizoensgebonden variatie van waterverdeling21,29,30, het effect van Freeze-ontdooicycli17,31, 32, de verdeling van water in nat hout5, veranderingen in de waterverdeling tijdens de overgang van spint naar heartwood20, seizoengebonden tijdsverloop van cambial activiteit en differentiatie van schepen33, en cavitatie geïnduceerd door bepaalde biotische beklemtoont23,34. Hydraulische geleidbaarheid en leidingen kwetsbaarheid voor cavitatie zijn ook geverifieerd met behulp van Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM uitgerust met energie dispersieve röntgenstraal spectrometrie (EDX of EDS) is gebruikt om elementdistributie over de oppervlakte van een specimen te bestuderen dat water37bevat.
Freeze-fixatie van een levende stam die leidingen bevat onder hoge hydraulische spanning veroorzaakt soms kunstmatige cavitatie die worden waargenomen door Cryo-SEM als gebroken ijs kristallen in het lumen van de leidingen38,39. In het bijzonder, loof soorten met langere en bredere leidingen zijn kwetsbaar voor spanning-geïnduceerde artefacten, zoals cavitatie veroorzaakt doorsteek proef snijden, zelfs indien uitgevoerd onder water3,40. De artefacten van de cavitatie worden opvallend na bemonstering van een het transpireren boom (d.w.z., bemonstering tijdens de dag tijd) of onder strenge droogte voorwaarden en zij kunnen aan een overschatting van cavitatie voorkomen misleiden3,38, 39. Daarom moet de spanning die in de leidingen werkt worden vrijgegeven om de artefactuele cavitatie3,12,39te vermijden.
De Freeze-fractuur techniek met behulp van een mes geïnstalleerd in een specimen kamer wordt vaak gebruikt om het monster oppervlak bloot voor Cryo-SEM observatie. Nochtans, zijn de bevriezen-gebroken vliegtuigen van bosrijke installatie weefsels, vooral transversale secties van secundaire Xylem, te ruw om de anatomische eigenschappen en het water in het weefsel6duidelijk waar te nemen. De toepassing van een cryostat voor het trimmen van een specimen maakt een snelle en kwalitatief hoogwaardige voorbereiding van monster oppervlakken20,23mogelijk. Het algemene doel van deze methode is het verstrekken van bewijsmateriaal met elektronenmicroscopie resolutie van de waterverdeling in verschillende soorten Xylem cellen in situ zonder het voorkomen van bemonsterings artefacten. We introduceren onze geactualiseerde procedure, die gestaag is verbeterd sinds we voor het eerst aangenomen, met betrekking tot de bemonstering, trimmen en reinigen van het specimen oppervlak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen van Cryo-vaste monsters van Xylem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: een schematisch overzicht van dit protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
1. bemonstering: spanning ontspanning binnen de kolom van het water van Xylem leidingen
Opmerking: de volgende spanning ontspanning behandeling wordt aanbevolen voor de LN2 aanvraag om zowel bevriezing en spanning te voorkomen-geïnduceerde artefacten in de Xylem waterdistributie.
- Plaats een tak en laat voor bemonstering met een zwarte plastic zak om het water potentiaal tussen Xylem equilibrate en laat meer dan twee uur voor de bemonstering.
- Bepaal het water potentieel van ten minste twee bladeren uit het monster met behulp van een drukkamer of een psychrometer. Wanneer het water potentieel hoger is dan ca. − 0,5 MPa (dat wil zeggen, geen of zeer lage spanning bestaat), een monster kan worden geoogst na het invriezen (zie paragraaf 2: bevriezen fixatie). Wanneer het water potentieel lager is dan − 0,5 MPa, is een behandeling voor ontspanning nodig zoals hieronder beschreven.
- Bevestig een waterdichte kraag rond de stengel om gevuld te worden met water. Een plastic beker zonder bodem kan dienen als een waterdichte kraag. Zorg moet worden genomen om stevig afdichting van de ruimten tussen de stengel en de kraag met behulp van een plakband voor het voorkomen van lekkage van vloeibare media die later worden gebruikt. Voor het oogsten van flexibele stengels, zoals dunne takken of twijgen, zinken een snijgedeelte in een met water gevulde emmer door het buigen van de stengel. Snijd onder het wateroppervlak met behulp van snoeischaren of een zaag. Breng het monster naar een andere container van het water zo snel mogelijk te minimaliseren blootstelling van de cut-end aan de lucht.
- Houd het snij einde van het monster onder water. Voor loof soorten moet ervoor worden gezorgd dat de lengte vanaf de plaats waar een Cryo-monster voor SEM wordt verkregen aan de snijkant van de geoogste stam langer is dan de maximale lengte van de monsters om spanning te voorkomen – geïnduceerde artefacten in het Cryo-monster.
- Bedek het monster met bladeren met een zwarte plastic zak om transpiratie te verminderen. Houd de snede einde van het monster in het water en handhaven van deze voorwaarde voor ongeveer 30 min in om de Xylem spanning te ontspannen. Vermijd een langere ontspanningstijd (> 1 uur) als gevolg van mogelijke kunstmatige navulling van cavitated leidingen12.
- Meet het water potentieel opnieuw om de ontspanning van de Xylem spanning (bijna 0 MPa) te bevestigen.
Opmerking: voorafgaand aan de bemonstering, moet de maximale vaartuig lengte van de doelsoort worden onderzocht of bepaald met soortgelijke monsters door de lucht injectie methode. Bij de bemonstering van een grote boom, of een grote tak, is het moeilijk om de spanning-ontspanningsprocedures beschreven hierboven te voeren. Daarom moeten monsters van grote bomen worden verzameld tijdens de predawn periode wanneer het Xylem water potentieel hoger is.
2. Freeze fixatie met LN2
- Knip en open een kant van een waterdichte kraag met een schaar of een utility mes. Bevestig de kraag rond de stengel met een plakband terwijl het diafragma horizontaal.
- Draag isolerende handschoenen/want, maar zorg ervoor dat de fles van LN2 veilig te houden, en voer LN2 in de kraag om het te vullen met ln2. Houd het gevuld door gestaag toe te voegen LN2 volledig te bevriezen het water in de Xylem. De tijd die nodig is voor het bevriezen is afhankelijk van de steekproefgrootte; 1 min na het koken van gegoten LN2 is voldoende voor een kleine takje of een zaailing, terwijl meer dan 20 min is nodig voor een stam van een grotere boom20. Voeg LN2 continu toe tijdens het bevriezen omdat het snel verdampt door grote temperatuurverschillen tussen LN2 en omgevingstemperaturen.
- Maak de kraag los van het bevroren gedeelte van de monster stam om LN2 na voldoende bevriezings tijd te verwijderen. Zorg ervoor dat u isolerende handschoenen te dragen om contact te vermijden met potentiële LN2 morsen veroorzaakt door het losmaken van de kraag.
- Oogst het monster met een fijne zaag onmiddellijk.
- Bedek de bevroren monster met een stuk aluminiumfolie of zet het in een monsterbuis, waarop monster ID nummers worden geschreven. Plaats het geoogste monster snel in een container gevuld met LN2 of pak in een geïsoleerde doos gevuld met droog ijs.
- Bewaar de monsters in een diepvriezer tot observatie. De aangewezen opslagtemperatuur is − 80 °C om ijs sublimatie en zijn herkristallisatie tijdens het opslaan te verhinderen.
3. specimen voorbereiding
Opmerking: voor observatie moet een monster worden bijgesneden en moet het oppervlak voor observatie worden geschaafd bij een temperatuur van nul om de waterverdeling in zijn Xylem in situ te houden. Een biologisch microtome met een cryostat systeem (cryostat) is ideaal voor het trimmen en het blootstellen van het oppervlak van een specimen in dit type van observatie door Cryo-SEM.
- Stel de temperatuur van het specimen kamer van de cryostat tot − 30 ° c, die meestal koud genoeg is om de Xylem sap van de meeste planten te houden in een bevroren toestand.
- Trim een monster in een klein stuk (< ca. 2 cm in hoogte en < ca. 1 cm in breedte of diameter) die kunnen worden aangepast voor de specimen houder van een Cryo-SEM. gebruik een scherp mes of een fijn getande zaag voor het trimmen om te voorkomen dat het breken van het ijs in het specimen. In het geval van een groter monster dat niet kan worden gesneden met een mes, snel pre-cut met een gekoelde zaag in een diepvries doos.
- Bevestig de bijgesneden stuk aan een boorkop, een houder voor een cryostat door montage op een weefselbevriezing inbedding medium (bijv. OCT compound) voor Cryo-sectioning. Bevestig vervolgens de boorkop aan een specimen houder van een microtome van de cryostat.
- Trim het oppervlak door herhaaldelijk scheren met 5 – 7 µm secties in dikte. Trimmen door het wegknippen van meer dan 1.000 tot 2.000 µm, in totale diepte van de initiële oppervlak bij monster collectie, is nuttig voor het elimineren van het beschadigde gedeelte van het monster veroorzaakt door pre-Cutting met een mes of zaag zoals beschreven in de stap 3,2.
- Na ruwweg het trimmen van een oppervlakte van het monster, pas een ongebruikt gedeelte van de microtome blad boven het oppervlak van het specimen. Laat het mes niet aan de steekproef die zou groter zijn dan de dikte instelling te raken.
- Voordat de eerste snede door de ongebruikte Blade gedeelte, iets breder de afstand tussen het oppervlak van het monster en het mes.
- Snijd het oppervlak van het monster slechts een of twee keer. Verder, schuif het mes opnieuw het aanpassen van een ongebruikt mes gedeelte op het oppervlak van het specimen.
- Herhaal de stappen 3,6 en 3,7 drie of vier keer. Dit is belangrijk om een duidelijk oppervlak te verkrijgen zonder "mes merken" (Figuur 4).
- Na de laatste snede, zet het mes de positie ver van het monster om te voorkomen dat stof te plakken op het monster.
- Maak de boorkop los van het specimen houder en maak het monster los van de boorkop door het bevroren inbedmiddel te verwijderen met een scherp mes. Zorg ervoor dat het specimen in de cryostat kamer wordt geplaatst om het geplante oppervlak van vorst stof te voorkomen.
- Bevestig het specimen aan een Cryo-SEM specimen houder met een weefsel bevriezend inbeddend middel in de cryostat kamer.
4. Transfer naar de Cryo-SEM specimen kamer
Opmerking: het oppervlak-voor bereide specimen moet worden beschermd tegen een verhoging van de temperatuur of de accumulatie van vorst tijdens de overdracht van de cryostat kamer naar de observatiefase in de Cryo-SEM specimen kamer.
- Handhaaf de koude stadium temperatuur in de Cryo-SEM specimen kamer bij lager dan-120 ˚ C met LN2 volgens de gebruikershandboek van de uitrusting.
- Plaats de specimen houder met het voor bereide specimen in een isolerende recipiënt gevuld met LN2 in de cryostat kamer.
- Houd het specimen houder met een specimen het uitwisselen van staaf onder LN2. Vermijd blootstelling van het specimen houder aan de lucht waar mogelijk.
- Snel zet het specimen houder van de Pre-evacuatie kamer van de Cryo-SEM specimen kamer zodra het starten van de evacuatie van de Pre-evacuatie kamer. Dan, plaats het specimen houder op de koude fase nadat de lucht volledig is geëvacueerd. Hoewel een beetje van de vorst accumulatie onvermijdelijk is, de "Freeze-ETS" procedure (stap 6) kan verwijderen.
5. instelling in SEM
Opmerking: de typische instelling voor de waarneming wordt hieronder beschreven. Sommige wijzigingen zijn vereist, afhankelijk van de vacuüm conditie of elektronenbundel.
- Stel de SEM parameters voor observatie als volgt:
Versnelling voltage: 3 – 5 kV
Temperatuur van het specimen stadium: < − 120 °C
Detector: secundaire emissie
6. Freeze-ETS
Opmerking: Freeze-ETS is de procedure voor accentueren de rand van de celwanden van de steekproef door lichte Ice Crystal sublimatie. Freeze-etsen impliceert ook het verwijderen van oppervlakte vorst stof.
- Zet de versnelling spanning van de elektrische pistool tijdens Freeze-etsen. Het is beter om te voeren Freeze-etsen, terwijl het observeren van het specimen.
- Verhoog de temperatuur van het monster stadium tot − 100 °C.
- Wacht enkele minuten tot vorst stof wordt verwijderd en het oppervlak van het ijs in Xylem cellen is enigszins gedaald in vergelijking met de celwanden.
- Verlaag de temperatuur van het monster stadium tot − 120 °C.
Opmerking: als er geen geïnstalleerde temperatuurregelaar voor het monster stadium, houd het specimen met behulp van de wissel stang en los het uit specimen fase voor een paar minuten. Observeer het specimen meerdere malen tijdens dit Freeze-ETS proces om de sublimatie status van het specimen te verifiëren.
7. Metal coating (optioneel)
Nota: de recente verbeteringen aan het SEM instrument en de beeldverwerking kunnen de beelden van uitstekende kwaliteit van elektrische isolerende specimens zonder metaaldeklaag verstrekken. Niet-geleidende specimens, zoals biologische materialen, zijn echter soms onderworpen aan last; hogere helderheid op specifieke posities van het specimen als gevolg van accumulatie van elektronen ("opladen"). Het blootstellen van het specimen aan elektronenstralen voor een langere periode van tijd of voor een hoge vergroting, verhoogt de het laden gevolgen. Coating het oppervlak van het monster met elektrisch geleidende metalen materialen voorkomt het voorkomen van het opladen. Gebruik het vacuüm deklaag systeem dat binnen de Cryo-SEM eenheid wordt geïnstalleerd om de temperatuur van het specimen te verhinderen van het stijgen tijdens deklaag.
- Zorg ervoor dat coating materiaal is geïnstalleerd op een aangewezen verdamper hoofd van het coating systeem.
- Behoud de temperatuur van het koude stadium in het deklaag systeem onder − 170 °C.
- Plaats de specimen houder op het koude stadium van het deklaag systeem na voldoende bevriezen-etsen.
- Open een partitie tussen het koude stadium en de verdamper hoofd.
- Stel de huidige waarde en de spanningswaarde van de verdamper in op respectievelijk ca. 30 mA en ca. 5 V.
- Verdampen van coating materiaal voor ca. 30 s om het oppervlak van het specimen te bedekken.
- Stel zowel de huidige als de spanningswaarden van de verdamper in op nul en sluit de partitie.
- Plaats het specimen houder op de koude fase van het specimen kamer voor observatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden van dwars-gesneden oppervlakken van naald-en loofboom Xylem, waargenomen door Cryo-SEM, zijn weergegeven in Figuur 2. Bij lage vergroting, het zwarte gebied in de beelden geeft de holten van waaruit het water geheel of gedeeltelijk verdwijnt, en het grijze gebied geeft Xylem celwanden, cytoplasma, en water (Figuur 2a). Bij hoge vergroting is het duidelijk dat het water niet volledig verloren gaat van de lumina van drie tracheids, met vermelding van het optreden van macro bubbels in het Xylem SAP in situ (Figuur 2B). Met betrekking tot loof soorten, cavitatie voorval is gemakkelijk te detecteren binnen schepen, terwijl het water bestaan is moeilijk te onderscheiden binnen vezels, vooral bij lage vergroting (Figuur 2C). Cytoplasma in parenchym cellen kan worden onderscheiden van water binnen trahceids of vaartuigen door middel van ijs effen texturen (bijv. Figuur 2b).
Het effect van de temperatuur op de Freeze-ETS proces wordt weergegeven in Figuur 3. Vorst stof wordt geleidelijk verwijderd en de luchtpijp membranen worden duidelijker door de progressie van sublimatie met toenemende temperatuur. Resterende grote vorst stofdeeltjes kunnen worden geëlimineerd door verdere Freeze-ETS, maar dit kan problematisch zijn als het onnodig vermindert het oppervlak-niveau van ijs in Xylem leidingen.
De hoge kwaliteit van observatie wordt grotendeels bereikt door nauwkeurige specimen voorbereiding; vooral belangrijk is het effenen van het oppervlak met een scherp mes van de microtome. Het ontoereikende gladmaken door een gebruikt-blad kan soms ruwe oppervlakte (genoemd "mes tekens", Figuur 4) of talrijk voorkomen van stof van de besnoeiingen veroorzaken. Na zorgvuldige planning van het specimen oppervlak, de snelle overdracht van het specimen naar de specimen kamer is ook van cruciaal belang voor het elimineren van verontreinigingen veroorzaakt door vorst vorming.
Monster bevriezing zonder de versoepeling van de negatieve waterkolom druk zal leiden tot artefactuele inductie van cavitatie in Xylem leidingen (Figuur 5). Geclusterde ijs kristallen werden waargenomen in vaartuigen van specimens waaruit het monster was niet ontspannen (pijlpunten in Figuur 5a), contrastloos, geen geclusterde ijs kristallen werden waargenomen in ontspannen monster specimens met een soortgelijk water potentieel ( Figuur 5 B). Dit neigt significanter te zijn in Xylem van loofbomen eerder dan in naaldbomen (ongepubliceerde gegevens).
Figuur 1: een schematisch overzicht van dit protocol. De stroom van procedures van bemonstering naar SEM observatie die in dit document wordt beschreven wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: voorbeeld Cryo-SEM micrografen van de transversale-besnoeiings oppervlakten van Angiosperm en Gymnosperm boomsoorten. De grijze en zwarte gebieden in Xylem cellen corresponderen aan het water en de holten in de waterkolom van Xylem cellen, respectievelijk. Aangezien de monsters werden bevriezen-vast met vloeibare stikstof voorafgaand aan de monsterverzameling, de beelden door Cryo-SEM tonen de plant water status en inheemse embolie op het moment van bemonstering. (A) en (B): twee jaar oude takje van een volwassen boom van Cryptomeria japonica (naaldhout). De diameter van de takje was 3 mm, en het water potentieel was − 0,39 MPa bij predawn oogsten. (C): twee-jaar-oude spruit van Carpinus tschonoskii (diffuus-poreus hout) zaailing (1,4 m in hoogte en 1,1 cm in basale diameter). De zaailing werd bemonsterd na spanning-ontspannings procedure na verlengde beperking van irrigatie vier dagen. Het water potentieel was − 1,78 MPa na een verlengde droogte en was − 0,15 MPa na de spanning-ontspannings procedure. Tr: tracheid, R: Ray parenchym, V: schip, F: vezel, AP: axiale parenchym. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: ontdooiing en ETS procedure vooruitgang door het verhogen van de temperatuur van de koude monster fase. Dwars-gesneden oppervlakte van Xylem van een Cryptomeria japonica takje (naaldhout). De dalende temperaturen van het specimen stadium zijn (A) − 113,0 °C, (B) − 105,3 °C, (C) − 101,9 °C en (D) − 99,7 °C. Elk beeld werd verkregen ongeveer 5 min nadat de temperatuur van het koude specimen stadium bij de respectieve temperatuur waarde werd geplaatst. Ice sublimatie vordert als de temperatuur van het podium wordt gehandhaafd boven ongeveer − 120 ° c (voor onze apparatuur). Tr: tracheid, B: gegrensde kuil paar, PM: het membraan van de kuil. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: mes merk voorbeeld. Dwars-besnoeiings oppervlakte van Xylem van een Cryptomeria japonica takje (naaldhout) vertonend zogenaamde mes tekens. Pijlpunten en stippellijnen vertegenwoordigen typische mes merken. Het opruimen van het oppervlak van een specimen door een cryostat moet worden aangevuld met een ongebruikt gedeelte van het mes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: voorbeeld van het effect van ontspanning van de waterkolom spanning in leidingen. Dwars-besnoeiings oppervlakte van stam van een Carpinus tschonoskii zaailing (diffuus-poreus hout) waargenomen door Cryo-SEM. Het water potentieel overdag was vergelijkbaar in beide zaailingen. De stam van de transpirerende zaailing was bevroren intact (A), terwijl de stengel van een andere zaailing werd bevroren na de ontspanning van de bestaande hydraulische spanning (B). Het water potentieel van (B) bij het oogsten was − 0,5 MPa na de spanning-ontspannings procedure. Pijlpunten in paneel (A) zijn bevriezing artefacten van ijs kristallen binnen schepen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Cryo-SEM observatiemethodes die in dit document worden geïntroduceerd zijn praktisch voor duidelijk het visualiseren van waterdistributie op een cellulaire schaal. Door middel van deze methode, het verkennen van de veranderingen in de verdeling van het water binnen Xylem kan potentieel helpen verduidelijken het mechanisme van boomsoorten tolerantie voor abiotische stress (watertekort of bevriezing) of biotische stress (boom ziekte).
De meest cruciale stap in deze methode is het behoud van de waterverdeling karakteristiek van de inheemse water status tijdens het monster verzamelen en de daaropvolgende monstervoorbereiding. Xylem weefsel van soorten met lange leidingen (vooral earlywood vaten van ring-poreuze bomen) kan gemakkelijk water verliezen tijdens het oogsten en bevriezen. COCHARD et al. (2000) hebben besproken bevriezing artefacten als gevolg van hoge spanning in de waterkolom langs Xylem conduits38,41. Umebayashi et al. (2016) bevestigde de geldigheid van Cryo-SEM observaties van spanning-ontspannen steekproeven door vergelijking aan niet destructieve MRI observaties39. Beide observatietechnieken toonden een gelijkaardig patroon van waterdistributie. Hoewel we nog steeds moeten controleren of de soort-specifieke robuustheid tegen lucht-binnenkomst geïnduceerd door invriezen onder hoge hydraulische spanning, moet ontspanningsprocedures worden uitgevoerd om betrouwbare schattingen van de water distributies, en in het bijzonder voor water-beklemtoonde installaties.
Vorst en ijs deeltjes zijn belangrijke obstakels voor gedetailleerde observatie. Om vorst accumulatie te voorkomen, mag het specimen niet aan de atmosfeer worden blootgesteld totdat het aan de Cryo-SEM specimen kamer is bevestigd. Hoewel blootstelling aan de atmosfeer niet volledig kan worden voorkomen tijdens de overdracht van het monster naar de specimen kamer, moet de overdrachtstijd kort worden gehouden. De isolerende overdrachts container van de specimen houder moet na het verwijderen van de specimen houder en LN2 goed gedroogd zijn om vorst en ijs te voorkomen dat afkomstig is van dauw condensatie.
De juiste tijdsduur voor Freeze-ETS is afhankelijk van de prestaties van de gebruikte instrumenten. Belangrijke factoren bij het bepalen van dit zijn het vacuüm niveau in de specimen kamer en de stabiliteit van de temperatuurregelaar van het specimen stadium. De omvang van de sublimatie die overeenkomt met de temperatuur moet in de eerste plaats worden beoordeeld vóór formeel gebruik. Overmatige Freeze-ETS zal de aanwezigheid van water in Xylem leidingen verzwakken en het moeilijk maken om geïdentificeerd te worden, vooral in de lumina van smalle cellen.
Het neemt specifieke stappen en inspanningen om ervoor te zorgen dat destructieve methoden van bemonstering vrij zijn van artefact optreden tijdens het bevriezen, oogsten en trimmen procedures. Hoewel de betekenis van het voorkomen van artefacten vaak wordt opgemerkt, is de graad van voorkomen van het bevriezen van artefacten in Xylem leidingen niet voldoende gevalideerd38,39. Verdere validatie door niet-destructieve methoden is wenselijk voor de bevestiging van de nauwkeurigheid van de spanning-relaxatie procedure en de Freeze-fixatie. Aangezien synchotron-based µ CT-of MRI-systemen zijn niet voldoende gangbaar in de studie van de planten-water-relaties in vergelijking met de Cryo-SEM-systeem, de toepassing van een commerciële µ CT-systeem kan eventueel de vooruitgang van de validatie van Cryo-SEM resultaten42 .
Hydraulische boom eigenschappen, zoals SAP flux, hydraulische geleidbaarheid van stam segmenten, percentageverlies van geleidbaarheid (PLC), of Xylem capaciteit bieden schattingen van het gebruik van bomen water en de weerstand tegen droogte. Vergelijking van het watergebruik bij soorten is nodig voor het voorspellen van de overleving van bomen onder water stress veroorzaakt door antropogene klimaatverandering2. De observatie van Cryo-SEM heeft vele voordelen in het verstrekken van anatomische kennis voor het verduidelijken van de oorzaak van veranderingen binnen hydraulische eigenschappen. De recente verbeteringen van zowel destructieve en niet-destructieve methoden van plantaardige anatomische en hydraulische studies kunnen samen verdiepen ons begrip van de aard van het gebruik van bomen water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
