Summary
Observation av vatten distributionen inom Xylem ger viktig information om vattenflödesdynamik i vedartade växter. I denna studie visar vi den praktiska metoden för att observera Xylem vatten distribution in situ genom att använda en kryostat och Cryo-SEM, vilket eliminerar artifaktuella förändringar i vatten status under prov beredning.
Abstract
Ett svep elektron Mikroskop installerat Cryo-Unit (Cryo-SEM) tillåter preparat observation vid minus grader och har använts för att undersöka vatten distribution i växt vävnader i kombination med frys bindnings teknik med flytande kväve (LN 2). för Woody arter, dock preparat för observation av Xylem tvärgående yta innebära vissa svårigheter på grund av orientering av trä fibrer. Dessutom kan högre spänningar i vattenpelare i Xylem ledningar ibland orsaka artefakt förändringar i vatten distribution, särskilt under prov fixering och insamling. I denna studie visar vi ett effektivt förfarande för att observera vatten distributionen inom Xylem av vedartade växter på plats genom att använda en kryostat och Cryo-SEM. Vid första, under prov insamling, mätning av Xylem vattenpotentialen bör avgöra om hög spänning är närvarande i Xylem conduits. När Xylem vattenpotentialen är låg (< ca. − 0,5 MPa), en spänning avslappnings förfarande behövs för att under lätta bättre bevarande av vatten status i Xylem ledningar under provet frysa fixering. Därefter fästs en vatten tät krage runt träd stammen och fylls med LN2 för frys fixering av XYLEMS vatten status. Efter skörd skall försiktighet iakttas för att säkerställa att provet bevaras fryst medan förfarandet för prov beredning för observation är slutfört. Kryostat används för att tydligt exponera den tvärgående ytan av Xylem. I Cryo-SEM observationer krävs tids justering för frysning-etsning för att ta bort frost damm och accentuera kanten av cell väggarna på utsikts ytan. Våra resultat visar tillämpligheten av Cryo-SEM tekniker för observation av vatten distribution inom Xylem på cellulär och subcellulär nivå. Kombinationen av Cryo-SEM med icke-förstörande in situ observation tekniker kommer att grundligt förbättra utforskandet av vedartade växtvattenflödesdynamik.
Introduction
Till gången på vatten resurser (dvs. nederbörd, mark vatten halt) bestämmer strängt dödligheten och den geografiska fördelningen av växt arter, eftersom de måste absorbera vatten från marken och transportera det till bladen för foto syntetisk produktion. Anläggningarna måste bibehålla sitt vatten transport system under fluktuerande vatten leveranser. I synnerhet vedartade växter genererar höga spänningar i sina ledningar längs transpiration strömmar som, i vissa fall, de behöver för att hålla sin krona mer än ~ 100 m ovan jord. För att bibehålla vattenpelare under så högt negativt tryck består Xylem-conduits av ett kontinuum av tubulära celler med stela och hydrofoba-lignifierade cell väggar1. Den sårbarhet för Xylem dysfunktion av Xylem conduits i varje art är en bra avgörande av arten överlevnad under fluktuerande vattenförsörjning2. Dessutom är det viktigt att studera vatten status av Xylem conduits för utvärdering av hälso tillståndet hos enskilda träd som utsätts för abiotiska eller biotiska påfrestningar. Mätning SAP flöde eller vattenpotential kan ge uppskattningar av en Woody anläggningens vatten status på grund av den integrerade hydrauliska funktionen av Xylem conduits. Dessutom kan visualisering av vatten distributionen i Xylem-celler klargöra tillståndet för enskilda komponenter i XYLEMS hydraul system.
Flera tekniker för att visualisera vatten status av Xylem conduits finns3. Den klassiska och användbara metoder för observation av vatten vägar i vedartade vävnad innebär färgning av vattenpelaren genom att doppa ändarna av skurna grenar i ett färg ämne eller genom att injicera ett färg ämne i stående träd stammar4. Mjuk röntgen fotografering gör det också möjligt visualisering av vatten distribution av skivade trä skivor på grund av den differentiella x-ray absorptionsintensiteten av fukten i Xylem5,6. Dessa metoder, dock endast ge spår av vatten rörelse eller demonstrera makroskopiska distributioner av vatten. Nyligen, icke-förstörande observation tekniker, såsom Micro Focus X-ray datortomografi (μct)7,8,9,10och magnetisk resonanstomografi (MRI)11, 12, har förbättrats avsevärt för att möjliggöra observation av vatten i Xylem ledningar inom intakt plantor. Dessa icke-destruktiva metoder har stora fördelar i att vi kan observera XYLEMS vatten status utan konstgjorda skär effekter, och vi kan spåra vattenflödet dynamik genom sekventiell avbildning eller införa ett kontrast medel10. Vi måste dock använda en anpassad MRI för växt avbildning eller en specialiserad anläggning för synkrotronbaserad μCT för att erhålla de bilder som kan identifiera vattenhalten i cell nivå. Dessutom, även om synkrotron-baserade μct-systemet är aktiverat för att erhålla fina bilder med hög rumslig upplösning, vilket är jämförbart med ljusmikroskopi7,8,9, kan levande celler skadas av strålning av hög energi röntgen,13,14. Använda ett svep elektron Mikroskop där Cryo-enheter är installerade (Cryo-SEM) är en mycket användbar metod för att exakt lokalisera vattnet i Xylem på cell nivå, även om detta kräver destruktivt skörd provet för observation. För att fixera vattnet i XYLEMS ledningar är en del av stjälkarna (dvs. kvistar, grenar eller stammar) frysta in situ av flytande kväve (LN2). Observationer av ytan av trimmade, frysta exemplar av Cryo-SEM ger mycket förstorade bilder av Xylem struktur som vi kan identifiera vattnet i Xylem ledningar som is. En betydande begränsning av denna metod är att sekventiell observation av vattnets movabilitet inom samma prov är omöjlig. Tillämpningen av μCT eller MRI för sekventiell observation av träd som lever i ett fält är dock extremt utmanande eftersom dessa instrument inte är portabla. I motsats, Cryo-SEM har en potential för att använda denna teknik på stora träd i fält experiment för att tydligt visualisera vatten innehåll på inte bara cell nivå utan också på en finare struktur nivå, e.g., vatten i intervascular gropar15, vatten i intercellulära utrymmen16, eller bubblor i vatten kolumn17.
Många studier som observerar Xylem Water av Cryo-SEM har rapporter ATS 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) upprättade inlednings vis protokollet för observation av Xylem in situ genom frysning-fixering av en levande stam genom att fylla LN2 i en behållare inställd på stammen21. Temperaturen på provet bibehölls under-20 ° c under provtagning och under Cryo-SEM beredning för att undvika smältande is inom Xylem-ledningar. Denna metod har använts för att observera vattnet i Xylem för att klargöra vatten distributionen under förändrade vatten system11,12,24,25,26, 27,28, den säsongsbetingade variationen i vattendistribution 21,29,30, effekten av frys-tö cykler17,31, 32, fördelningen av vatten i vått trä5, förändringar i vatten fördelningen under över gången från sapwood till kärnved20, säsongsbunden tid av kambial aktivitet och differentiering av fartyg33, och kavitation induceras av vissa biotiska spänningar23,34. Hydraulisk konduktivitet och conduits sårbarhet för kavitation har också verifierats med Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM utrustad med energidispersiv röntgenspektrometri (EDX eller EDS) har använts för att studera elementets fördelning över ytan av ett prov som innehåller vatten37.
Frysning-fixering av en levande stam som innehåller ledningar under hög hydraulisk spänning orsakar ibland konstgjorda kavitation som observeras av Cryo-SEM som brutna iskristaller i lumen av conduits38,39. I synnerhet, ädel löv arter med längre och bredare ledningar är sårbara för spännings-inducerad artefakter, såsom kavitation orsakad av provtagning, även om den utförs under vatten3,40. Kavitation artefakter blir iögonfallande efter provtagning av ett transpiring träd (dvs provtagning under dagtid) eller under svåra tork förhållanden och de kan vilseleda till en överskattning av kavitation förekomst3,38, på 39. Därför måste spänningen som arbetar i ledningarna släppas för att undvika den artifaktuella kavitation3,12,39.
Frys fraktur tekniken med hjälp av en kniv monterad i en preparat kammare används ofta för att exponera preparat ytan för Cryo-SEM-observation. Men frysa-Fractured plan av vedartade växt vävnader, särskilt tvärgående delar av sekundära Xylem, är för grova för att tydligt observera de anatomiska egenskaper och vatten i vävnaden6. Användning av kryostat för att trimma ett preparat möjliggör snabb och högkvalitativ beredning av prov ytorna20,23. Det övergripande målet med denna metod är att ge bevis med elektronmikroskopi upplösning av vatten distributionen i olika typer av Xylem celler in situ utan förekomst av provtagning artefakter. Vi introducerar vårt uppdaterade förfarande, som har förbättrats stadigt sedan vi först antog det, om provtagning, putsning och rengöring av preparat ytan för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer av Cryo-fasta prover av Xylem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: en schematisk tabell över detta protokoll visas i figur 1.
1. provtagning: spänning avslappning inom Water Column av Xylem conduits
Anmärkning: följande spänning avslappnings behandling rekommenderas innan LN2 ansökan för att undvika både frysning och spänningar-inducerad artefakter i Xylem vatten distribution.
- Bifoga en gren och blad för provtagning med en svart plast påse för att jämvikt vattenpotentialen mellan Xylem och lämnar mer än två timmar före provtagning.
- Bestäm vattenpotentialen hos minst två blad från provet med hjälp av en tryck kammare eller en psykromometer. När vattenpotentialen är högre än ca. − 0,5 MPa (dvs. ingen eller mycket låg spänning finns), kan ett prov skördas efter frysning (se avsnitt 2: frys fixering). När vattenpotentialen är lägre än − 0,5 MPa behövs en behandling för avslappning enligt beskrivningen nedan.
- Fäst en vatten tät krage runt stammen för att fyllas med vatten. En plastkopp utan botten kan fungera som en vatten tät krage. Var noga med att täta utrymmena mellan stammen och halsbandet med hjälp av en tejp för att förhindra läckage av flytande media som används senare. För skörd av flexibla stjälkar som tunna grenar eller kvistar, sjunka en skärande del i en vattenfylld hink genom att böja stammen. Skär under vatten ytan med hjälp av beskärning saxar eller en såg. Överför provet till en annan behållare med vatten så snabbt som möjligt för att minimera utsätta den skurna änden till luft.
- Håll den skurna änden av provet under vatten. För ädel löv art, se till att längden från den plats där ett Cryo-prov för SEM erhålls till den skurna kanten av den skördade stammen är längre än provets maximala fartygs längd för att förhindra spänningar – inducerade artefakter inom Cryo-provet.
- Täck provet som innehåller löv med en svart plast påse för att minska transpiration. Håll den skurna änden av provet i vattnet och bibehålla detta tillstånd för ca 30 min för att slappna av Xylem spänningen. Undvik en längre avslappnings tid (> 1 h) på grund av möjlig artificiell påfyllning av kaviterade ledningar12.
- Mät vattenpotentialen igen för att bekräfta uppmjukning av Xylem spänningen (nästan 0 MPa).
Anmärkning: före provtagning bör den maximala fartygs längden för målarten undersökas eller bestämmas med liknande prov med luft insprutnings metod. När provtagning ett stort träd, eller en stor gren, är det svårt att genomföra spänningen-avkoppling förfaranden som beskrivs ovan. Därför måste prover från stora träd samlas in under grynings period när Xylem vattenpotentialen är högre.
2. frys fixering med LN2
- Klipp och öppna ena sidan av en vatten tät krage med sax eller en bruks kniv. Tätt fästa kragen runt stammen med en tejp medan du håller bländaren horisontellt.
- Använd Isolerande handskar/tumhandske, men se till att hålla flaskan LN2 säkert, och kör ln2 i halsbandet för att fylla den med ln2. Håll den fylld genom att stadigt lägga LN2 att helt frysa vattnet i Xylem. Den tid som krävs för frysning beror på urvals storleken. 1 min efter kokningen av hällde LN2 har slutat är tillräcklig för en liten kvist eller en frö planta, medan mer än 20 min behövs för en stam av en större träd20. Tillsätt LN2 kontinuerligt under frysningen eftersom den avdunstar snabbt på grund av stora temperatur skillnader mellan ln2 och omgivnings temperaturer.
- Lossa halsbandet från den frusna delen av prov stammen för att ta bort LN2 efter tillräcklig frys tid. Se till att ha på dig Isolerande handskar för att undvika kontakt med potentiella LN2 -spill som orsakas av att kragen lossnar.
- Skörda provet med en fin handsåg omedelbart.
- Täck det frysta provet med en bit aluminiumfolie eller Lägg den i ett prov rör, där provet ID-nummer skrivs. Placera snabbt det skördade provet i en behållare fylld med LN2 eller packa i en isolerad låda fylld med torris.
- Förvara proverna i en djup frys tills observationen. Den föredragna lagrings temperaturen är − 80 ° c för att förhindra is sublimering och dess rekristallisering under lagring.
3. Preparering av preparat
Anmärkning: för observation måste ett prov trimmas och dess yta för observation måste hysas vid under noll temperatur för att hålla vatten distributionen i dess Xylem in situ. En biologisk mikrotom med ett kryostat system (kryostat) är idealisk för trimning och exponera ytan av ett prov i denna typ av observation av Cryo-SEM.
- Ställ in temperaturen i kryostatens preparat kammare på − 30 ° c, som vanligt vis är tillräckligt kall för att hålla de flesta växters Xylem i fryst tillstånd.
- Trimma ett prov i en liten bit (< ca. 2 cm i höjd och < ca. 1 cm i bredd eller diameter) som kan justeras för preparat hållaren på en Cryo-SEM. Använd en vass kniv eller en fintandad såg för putsning för att förhindra att bryta isen i preparatet. I fallet med ett större prov som inte kan klippas med en kniv, snabbt pre-cut med en kyld såg i en frys låda.
- Fäst den trimmade biten till en Chuck, en hållare för en kryostat genom att montera på en vävnad frysning inbäddnings medium (t. ex., OCT förening) för Cryo-skärning. Fäst sedan chucken på en preparat hållare på en mikrotom i kryostaten.
- Trimma ytan genom att upprepade gånger raka med 5 – 7 μm sektioner i tjocklek. Trimning genom att skära bort mer än 1 000 till 2 000 μm, i totalt djup från den initiala ytan vid provtagning, är användbart för att eliminera den skadade delen av provet som orsakas av pre-skärning med en kniv eller såg som beskrivs i steg 3,2.
- Efter att grovt ha trimmar en yta av provet justerar du en oanvänd del av mikrotombladet ovanför preparatets yta. Låt inte bladet röra vid provet som skulle överstiga tjock Leks inställningen.
- Innan det första snittet av den oanvända blad delen, något bredda avståndet mellan ytan av preparatet och bladet.
- Klipp ytan av provet endast en eller två gånger. Skjut sedan bladet igen och justera en oanvänd blad del på preparatets yta.
- Upprepa steg 3,6 och 3,7 tre eller fyra gånger. Detta är viktigt för att få en klar yta utan "kniv märken" (figur 4).
- Efter det sista snittet, Ställ in bladets position långt från provet för att förhindra att damm fastnar på provet.
- Lossa chucken från preparat hållaren och lossa preparatet från chucken genom att ta bort det frysta inbäddnings mediet med en vass kniv. Se till att preparatet är placerat i kryostatkammaren för att förhindra att dess hytlade yta kommer från frost damm.
- Fäst preparatet på en Cryo-SEM preparat hållare med ett vävnads frysnings medium i kryostatkammaren.
4. överföring till Cryo-SEM preparat kammare
Anmärkning: det ytpreparerade preparatet måste skyddas från en temperaturhöjning eller ansamling av frost under överföringen från kryostatkammaren till observations stadiet i prov kammaren Cryo-SEM.
- Behåll kall stegs temperaturen i prov kammaren Cryo-SEM vid lägre än – 120 ° c med LN2 enligt utrustningens bruksanvisning.
- Placera preparat hållaren med det preparerade preparatet i en isolerings behållare fylld med LN2 i kryostatkammaren.
- Håll preparat hållaren med ett preparat som utbyter stav under LN2. Undvik att utsätta preparat hållaren för luft när det är möjligt.
- Ställ snabbt in preparat hållaren på förevakuerings kammaren i Cryo-SEM-provkammaren så snart evakueringen av förevakuerings kammaren påbörjas. Placera sedan preparat hållaren på det kalla stadiet efter att luften har evakuerats helt. Även om lite frost ansamling är oundviklig, den "frysa-etsning" förfarande (steg 6) kan ta bort den.
5. inställning i SEM
Anmärkning: typisk inställning för observationen beskrivs nedan. Vissa ändringar krävs beroende på vakuum tillstånd eller elektron stråle.
- Ställ in SEM-parametrarna för observation enligt följande:
Accelerations spänning: 3 – 5 kV
Temperatur på preparat stadiet: < − 120 ° c
Detektor: sekundär emission
6. frys-etsning
Anmärkning: frys-etsning är förfarandet för accentuering kanten av provet cell väggar av lätt is kristall sublimering. Frysning-etsning innebär också att ta bort ytan frost damm.
- Slå på accelerations spänningen för den elektriska pistolen under frys-etsning. Det är bättre att genomföra frys-etsning medan Observera preparatet.
- Höj temperaturen på preparat stadiet till − 100 ° c.
- Vänta några minuter tills frost damm avlägsnas och ytan av isen i Xylem celler har minskat något i jämförelse med cell väggarna.
- Sänk temperaturen på preparat stadiet till − 120 ° c.
Anmärkning: om det inte finns någon installerad temperatur regulator för preparat stadiet, håll preparatet med hjälp av växlings staven och lossa den från preparat stadiet i några minuter. Observera preparatet flera gånger under denna frys-etching process för att kontrol lera preparatets sublimering status.
7. metall beläggning (tillval)
Obs: nya förbättringar av SEM-instrumentet och bild behandling kan ge högkvalitativa bilder av Elektriskt isolerande preparat utan metall beläggning. Men icke-ledande exemplar, såsom biologiska material, är ibland föremål för laddning; högre ljus styrka vid specifika positioner av preparatet på grund av ackumulering av elektroner ("laddning"). Om du utsätter preparatet för elektron strålar under en längre tid eller för hög förstoring ökar laddnings effekterna. Beläggning av ytan av preparatet med elektriskt ledande metall material förhindrar uppkomsten av laddning. Använd det vakuum beläggnings system som är installerat i Cryo-SEM-enheten för att förhindra att temperaturen på preparatet ökar under beläggningen.
- Se till att beläggnings materialet är monterat på ett anvisad för ångaren huvudet av beläggnings systemet.
- Behåll temperaturen på den kalla fasen i beläggnings systemet under − 170 ° c.
- Placera preparat hållaren på det kalla stadiet av beläggnings systemet efter tillräcklig frys-etsning.
- Öppna en partition mellan den kalla scenen och för ångaren huvudet.
- Ställ in det aktuella värdet och spännings värdet för för ångarens huvud vid ca. 30 mA respektive ca. 5 V.
- Indunsta beläggnings material för ca 30 s för att belägga ytan på preparatet.
- Ställ in både ström-och spännings värden för för ångarens huvud vid noll och stäng partitionen.
- Placera preparat hållaren på den kalla fasen av preparat kammaren för observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av tvärskurna ytor av barr-och lövträd Xylem, observerade av Cryo-SEM, visas i figur 2. Vid låg förstoring indikerar det svarta området i bilderna håligheter från vilka vatten helt eller delvis försvinner, och det gråa området indikerar XYLEMS cell väggar, cytoplasman och vatten (figur 2a). Vid hög förstoring, är det uppenbart att vattnet inte är helt förlorad från Lumina av tre tracheids, vilket tyder på förekomsten av makro bubblor i Xylem SAP in situ (figur 2B). När det gäller ädel löv arter, kavitation förekomst lätt upptäcks inom fartyg, medan vatten existens är svårt att urskilja inom fibrer, särskilt vid låg förstoring (figur 2C). Cytoplasman i lungparenkym celler kan särskiljas från vatten inom trahceids eller fartyg genom istäcket texturer (t. ex. figur 2b).
Temperatur effekten på frys-etsnings processen visas i figur 3. Frost damm avlägsnas gradvis och intertracheary grop membran blir tydligare genom utvecklingen av sublimering med ökande temperatur. Kvarvarande stora frost damm partiklar kan elimineras genom ytterligare frysning-etsning men detta kan vara problematiskt eftersom det onödigt minskar ytnivån av is i Xylem conduits.
Den höga kvaliteten på observationen uppnås till stor del genom noggrann preparat beredning. särskilt viktigt är utjämning ytan med ett skarpt blad av mikrotomen. Otillräcklig utjämning av en begagnad blad kan ibland orsaka grov yta (kallas "kniv märken", figur 4) eller många förekomster av damm från stycknings delarna. Efter noggrann planering av preparatets yta är den snabba överföringen av preparatet till preparat kammaren också avgörande för att eliminera föroreningar orsakade av Frost bildning.
Prov frysning utan avslappning av negativa vatten kolonn trycket kommer att orsaka artifaktuella induktion av kavitation i Xylem conduits (figur 5). Klustrade iskristaller observerades i kärl av prover från vilka provet inte var avslappnad (pilspetsar i figur 5a), contrastingly, inga klustrade iskristaller observerades i avspända prov exemplar med en liknande vattenpotential ( Figur 5 B). detta tenderar att vara mer betydande i Xylem av ädel löv träd snarare än i Barr träd (opublicerade data).
Figur 1: ett Schematiskt diagram över detta protokoll. Flödet av procedurer från provtagning till SEM observation som beskrivs i detta dokument visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel Cryo-SEM mikrografer av tvärgående-cut ytor av gömfröiga och gymnosperm trädslag. Grå och svarta områden i Xylem celler motsvarar vatten och håligheter i vatten kolumnen i Xylem celler, respektive. Eftersom proverna frystes fast med flytande kväve före provtagning, visar bilderna av Cryo-SEM anläggningens vatten status och infödda emboli vid tidpunkten för provtagningen. (A) och (B): två år gammal kvist av en vuxen träd av Cryptomeria japonica (Barr trä). Diametern på kvist var 3 mm, och vattenpotentialen var − 0,39 MPa vid grynings skörd. (C): två-åriga skott av Carpinus tschonoskii (diffust-poröst trä) frö planta (1,4 m i höjd och 1,1 cm i basal diameter). Plantan provades efter spänning-avslappnings förfarande efter långvarig begränsning av bevattning för fyra dagar. Vattenpotentialen var − 1,78 MPa efter en långvarig torka och var − 0,15 MPa efter spännings-avslappnings förfarandet. Tr: tracheid, R: Ray parenchyma, V: fartyg, F: fiber, AP: axiell parenchyma. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: avfrostning och etsnings förlopp genom att höja temperaturen på det kalla preparat stadiet. Tvär skuren yta av Xylem av en Cryptomeria japonica Twig (Barr trä). De minskande temperaturerna av preparat stadiet är (A) − 113,0 ° c, (B) − 105,3 ° c, (C) − 101,9 ° c och (D) − 99,7 ° c. Varje bild erhölls ungefär 5 minuter efter det att temperaturen på det kalla preparat stadiet sattes vid respektive temperatur värde. Issublimering fortskrider, om temperaturen av arrangera underhålls över ungefärligt − 120 ° c (för vår utrustning). Tr: tracheid, B: gränsar grop parar, PM: grop membran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på kniv märke. Tvär skuren yta av Xylem av en Cryptomeria japonica kvist (Barr träd) som visar så kallade kniv märken. Pilspetsar och streckade linjer representerar typiska kniv märken. Att rensa ytan på ett preparat med en kryostat ska fyllas med en oanvänd del av kniv bladet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på effekten av avslappning av vatten pelar spänningen i kraft ledningar. Tvärgående-cut yta av stammen av en Carpinus tschonoskii frö planta (diffust-poröst trä) observerats av Cryo-SEM. Vattenpotentialen under dagtid var likartad i båda frö plantor. Stammen av den transpiring frö planta frystes intakt (A), medan stammen av en annan frö planta frystes efter avslappning av den befintliga hydrauliska spänningen (B). Vattenpotentialen hos (B) vid skörd var − 0,5 MPa efter spännings-avslappnings förfarandet. Pilspetsar i panel (A) är frysning artefakter av iskristaller inom fartyg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Cryo-SEM observations metoder som införts i detta dokument är praktiska för att tydligt visualisera vatten distribution på cellulär skala. Genom denna metod, utforska förändringar i distributionen av vatten inom Xylem kan potentiellt bidra till att klargöra mekanismen för trädslag tolerans mot abiotisk stress (vatten brist eller frysning) eller biotiska stress (träd sjukdom).
Det mest avgörande steget i denna metod är att bevara vatten distributionen som kännetecknar den ursprungliga vatten statusen under provtagning och efterföljande prov beredning. Xylem vävnad av arter med långa ledningar (särskilt earlywood fartyg av ring-porösa träd) kan lätt förlora vatten under skörd och frysning. Cochard et al. (2000) har diskuterat frysning artefakter på grund av hög spänning i vattenpelaren längs Xylem conduits38,41. Umebayashi et al. (2016) bekräftade giltigheten av Cryo-SEM observationer av spänningsavspända prover i jämförelse med icke-förstörande MRT observationer39. Båda observations teknikerna visade ett liknande mönster av vatten distribution. Även om vi fortfarande måste kontrol lera den artspecifika robustheten mot luft inmatning som orsakas av frysning under hög hydraulisk spänning, bör avslappnings procedurer utföras för att ge tillförlitliga uppskattningar av vatten fördelningar, särskilt för vatten-stressade växter.
Frost och is partiklar är betydande hinder för detaljerad observation. För att förhindra frost ansamling bör preparatet inte utsättas för atmosfären förrän det fästs vid preparat kammaren Cryo-SEM. Även om exponering för atmosfären inte helt kan förhindras under överföring av provet till preparat kammaren, bör överförings tiden hållas kort. Den isolerande överförings behållaren på preparat hållaren bör torkas väl efter borttagning av preparat hållaren och LN2 för att förhindra frost och is från dagg kondensation.
Den lämpliga tids längden för frys-etsning beror på prestandan hos de instrument som används. Viktiga faktorer vid bestämning av detta är vakuum nivån i preparat kammaren och stabiliteten hos temperaturkontrollanten på preparat stadiet. Omfattningen av sublimering som motsvarar temperaturen bör i första hand bedömas före formell användning. Överdriven frysning-etsning kommer att dämpa närvaron av vatten i Xylem ledningar och gör det svårt att identifieras, särskilt i lumina av smala celler.
Det vidtar särskilda åtgärder och ansträngningar för att säkerställa att destruktiva provtagnings metoder är fria från artefakt förekomst under frys-, skörde-och trimnings förfarandena. Även om betydelsen av förekomsten av artefakter ofta påpekas, har graden av förekomst av frys artefakter i Xylem conduits inte varit tillräckligt validerade38,39. Ytterligare validering av icke-destruktiva metoder är önskvärt för att bekräfta noggrannheten i spänningen-avslappnings förfarandet och frys-fixering. Eftersom synkrotronbaserade μCT-eller MRI-system inte har varit tillräckligt utbredda i studiet av växt vatten relationer i jämförelse med Cryo-SEM-systemet, kan tillämpning av ett kommersiellt μCT-system möjligen gå vidare med valideringen av Cryo-SEM-resultat42 .
Hydrauliska träd egenskaper, såsom SAP Flux, hydraulisk konduktivitet av stamceller, procentuell förlust av konduktivitet (PLC), eller Xylem kapacitans ger uppskattningar av träd vattenanvändning och motstånds kraft mot torka. Jämförelse av vattenanvändningen bland arter behövs för att förutsäga träd överlevnad under vatten stress orsakad av antropogena klimat förändringar2. Cryo-SEM observation har många fördelar med att ge anatomisk kunskap för att klargöra orsaken till förändringar inom hydrauliska funktioner. De senaste förbättringarna av både destruktiva och icke-destruktiva metoder för växt anatomiska och hydrauliska studier kan tillsammans fördjupa vår förståelse av arten av träd vattenanvändning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
