Summary
Die Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb des Xylems liefert wichtige Informationen über die Wasserströmungsdynamik in holzigen Pflanzen. In dieser Studie zeigen wir den praktischen Ansatz zur Beobachtung der Xylem-Wasserverteilung vor Ort mithilfe eines Kryostats und Kryo-SEM, der artefaktische Veränderungen des Wasserstatus während der Probenvorbereitung eliminiert.
Abstract
Ein Rasterelektronenmikroskop, das Kryo-Unit (Cryo-SEM) installiert hat, ermöglicht probenbeobachtung bei Minustemperaturen und wurde zur Erforschung der Wasserverteilung in Pflanzengeweben in Kombination mit Gefrierfixierungstechniken mit flüssigem Stickstoff (LN) eingesetzt. 2). Für holzige Arten jedoch sind die Vorbereitungen zur Beobachtung der xylem quer geschnittenen Oberfläche aufgrund der Ausrichtung von Holzfasern mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Darüber hinaus kann eine höhere Spannung in der Wassersäule in Xylem-Leitungen gelegentlich zu artefaktischen Veränderungen in der Wasserverteilung führen, insbesondere während der Probenfixierung und -entnahme. In dieser Studie zeigen wir ein effizientes Verfahren zur Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb des Xylems von holzigen Pflanzen in situ mit Hilfe von Kryostat und Kryo-SEM. Zunächst sollte bei der Probenentnahme die Messung des Xylemwasserpotentials bestimmen, ob in den Xylem-Leitungen hochspannung vorhanden ist. Wenn das Xylem-Wasserpotential gering ist (< ca. 0,5 MPa), ist ein Spannungsentspannungsverfahren erforderlich, um eine bessere Erhaltung des Wasserzustands in Xylem-Schläuchen während der Probenfrostfixierung zu erleichtern. Als nächstes wird ein wasserdichter Kragen um den Baumstamm befestigt und mit LN2 gefüllt, um den Wasserzustand von Xylem zu fixieren. Nach der Ernte ist darauf zu achten, dass die Probe eingefroren aufbewahrt wird, während die Verfahren der Probenvorbereitung zur Beobachtung abgeschlossen sind. Ein Kryostat wird verwendet, um die xylem quer geschnittene Oberfläche deutlich zu belichten. In kryo-SEM-Beobachtungen ist eine Zeitverstellung für die Gefrierätzung erforderlich, um Froststaub zu entfernen und den Rand der Zellwände auf der Betrachtungsfläche zu akzentuieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit von Kryo-SEM-Techniken zur Beobachtung der Wasserverteilung innerhalb von Xylem auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Die Kombination von Kryo-SEM mit zerstörungsfreien In-situ-Beobachtungstechniken wird die Erforschung der holzigen Pflanzenwasserströmungsdynamik grundlegend verbessern.
Introduction
Die Verfügbarkeit von Wasserressourcen (d. h. Niederschlag, Bodenwassergehalt) bestimmt streng die Sterblichkeit und geografische Verteilung der Pflanzenarten, da sie Wasser aus dem Boden aufnehmen und zur photosynthetischen Produktion zu den Blättern transportieren müssen. Die Anlagen müssen ihr Wassertransportsystem unter schwankender Wasserversorgung aufrechterhalten. Insbesondere holzige Pflanzen erzeugen hohe Spannungen in ihren Leitungen entlang der Transpirationsströme, da sie in einigen Fällen ihre Krone mehr als 100 m über dem Boden halten müssen. Um Wassersäulen unter einem derart hohen Unterdruck zu erhalten, bestehen Xylemschläuche aus einem Kontinuum von Röhrenzellen mit starren und hydrophob-lignifizierten Zellwänden1. Die Anfälligkeit für xylem Dysfunktion von Xylem-Schläuchen in jeder Art ist eine gute Determinante des Artenüberlebens unter schwankender Wasserversorgung2. Darüber hinaus ist die Untersuchung des Wasserstatus von Xylem-Schläuchen wichtig für die Beurteilung des Gesundheitszustandes einzelner Bäume, die abiotischen oder biotischen Belastungen ausgesetzt sind. Die Messung des Saftdurchflusses oder des Wasserpotenzials kann aufgrund der integrierten hydraulischen Funktion von Xylem-Leitungen Schätzungen des Wasserzustands einer holzigen Pflanze liefern. Darüber hinaus kann die Visualisierung der Wasserverteilung in Xylemzellen den Zustand einzelner Komponenten des Xylem-Hydrauliksystems klären.
Es gibt mehrere Techniken zur Visualisierung des Wasserzustands von Xylem-Leitungen3. Die klassischen und nützlichen Methoden zur Beobachtung von Wasserwegen in holzigem Gewebe beinhalten das Färben der Wassersäule, indem die Enden geschnittener Äste in einen Farbstoff eingetaucht werden oder indem ein Farbstoff in stehende Baumstämme injiziert wird4. Weiche Röntgenfotografie ermöglicht auch die Visualisierung der Wasserverteilung von geschnittenen Holzscheiben aufgrund der differenziellen Röntgenabsorptionsintensität der Feuchtigkeit in Xylem5,6. Diese Methoden liefern jedoch nur Spuren der Wasserbewegung oder zeigen makroskopische Wasserverteilungen. Kürzlich wurden zerstörungsfreie Beobachtungstechniken, wie z. B. mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (CT)7,8,9,10und Magnetresonanztomographie (MRT)11, 12wurden deutlich verbessert, um die Beobachtung von Wasser in Xylem-Leitungen in intakten Setzlingen zu ermöglichen. Diese zerstörungsfreien Methoden haben große Vorteile, da wir den Wasserzustand des Xylems ohne künstliche Schnitteffekte beobachten können und wir die Wasserströmungsdynamik durch sequenzielle Bildgebung oder die Einführung eines Kontrastmittels10verfolgen können. Wir müssen jedoch eine kundenspezifische MRT für die Pflanzenbildgebung oder eine spezielle Einrichtung für Synchrotron-basiertes CT verwenden, um die Bilder zu erhalten, die den Zellpegelwassergehalt identifizieren können. Obwohl das Synchrotron-basierte CT-System feine Bilder mit hoher räumlicher Auflösung erhalten konnte, was mit der Lichtmikroskopie7,8,9vergleichbar ist, können lebende Zellen durch die Strahlung von hochenergetischer Röntgenstrahlung13,14. Der Einsatz eines Rasterelektronenmikroskops, in dem Kryo-Einheiten installiert sind (Cryo-SEM), ist eine sehr nützliche Methode, um das Wasser in Xylem auf zellulärer Ebene präzise zu lokalisieren, obwohl dies eine zerstörerische Entnahme der Probe zur Beobachtung erfordert. Zur Fixierung des Wassers in Xylemschläuchen wird ein Teil der Stiele (d. h. Zweige, Zweige oder Stiele) vor Ort durch flüssigen Stickstoff eingefroren (LN2). Beobachtungen der Oberfläche von getrimmten, gefrorenen Proben durch kryo-SEM liefern hochvergrößerte Bilder der Xylemstruktur, von denen aus wir das Wasser in Xylemschläuchen als Eis identifizieren können. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass eine sequenzielle Beobachtung der Wasserbeweglichkeit innerhalb derselben Probe unmöglich ist. Die Anwendung von CT oder MRT zur sequentiellen Beobachtung von Bäumen, die in einem Feld leben, ist jedoch äußerst anspruchsvoll, da diese Instrumente nicht tragbar sind. Im Gegensatz dazu hat cryo-SEM das Potenzial, diese Technik auf großen Bäumen in Feldexperimenten zu verwenden, um den Wassergehalt nicht nur auf zellulärer Ebene, sondern auch auf einer feineren Strukturebene, z.B. Wasser in intervaskulären Gruben15, Wasser in interzelluläre Leerzeichen16oder Blasen in Derwassersäule17.
Viele Studien zur Beobachtung von Xylemwasser durch kryo-SEM wurden 5 ,12,18,19,20,21,23berichtet. Utsumi et al. (1996) erstellten zunächst das Protokoll zur Beobachtung von Xylem in situ durch Einfrieren-Fixierung eines lebenden Stammes über das Befüllen von LN2 in einen Behälter, der auf den Stamm eingestellt ist21. Die Temperatur der Probe wurde während der Probenentnahme und während der Kryo-SEM-Vorbereitung unter -20 °C gehalten, um ein Schmelzen des Eises in Xylem-Leitungen zu vermeiden. Diese Methode wurde verwendet, um das Wasser in Xylem zu beobachten, um die Wasserverteilung unter wechselndem Wasserregime11,12,24,25,26zu klären. 27,28, die saisonale Variation der Wasserverteilung21,29,30, die Wirkung von Frost-Tau-Zyklen17,31, 32, die Verteilung von Wasser in nassem Holz5, Veränderungen in der Wasserverteilung während des Übergangs von Splintholz zu Kernholz20, saisonale Zeit Verlauf der cambial Aktivität und Differenzierung der Gefäße33, kavitation induziert durch bestimmte biotische Spannungen23,34. Hydraulische Leitfähigkeit und Leitungsanfälligkeit gegenüber Kavitation wurden ebenfalls mit kryo-SEM35,36überprüft. Cryo-SEM mit energiedispersiver Röntgenspektrometrie (EDX oder EDS) wurde verwendet, um die Elementverteilung über die Oberfläche einer Wasseraufnahme zu untersuchen37.
Die Frostfixierung eines lebenden Stammes, der Leitungen unter hoher hydraulischer Spannung enthält, verursacht manchmal künstliche Kavitationen, die von cryo-SEM als gebrochene Eiskristalle im Lumen der Leitungen38,39beobachtet werden. Insbesondere Breitlaubarten mit längeren und breiteren Schläuchen sind anfällig für spannungsinduzierte Artefakte, wie z. B. Kavitation durch Probenschneiden, auch wenn sie unter Wasser 3,40durchgeführt werden. Kavitationsartefakte werden nach der Probenahme eines sich aufstellenden Baumes (d. h. Probenahme während des Tages) oder unter schweren Dürrebedingungen auffällig und können zu einer Überschätzung des Kavitationsvorkommensführen 3,38, 39. Daher muss die Spannung, die in den Leitungen arbeitet, gelöst werden, um die artefaktuelle Kavitation3,12,39zu vermeiden.
Die Gefrier-Fraktur-Technik mit einem In einer Probenkammer installierten Messer wird häufig eingesetzt, um Probenoberfläche für kryo-SEM-Beobachtungen freizulegen. Gefrierfrakture Ebenen von holzigem Pflanzengewebe, insbesondere Querabschnitte von sekundärem Xylem, sind jedoch zu rau, um die anatomischen Merkmale und das Wasser im Gewebe deutlich zu beobachten6. Die Anwendung eines Kryostats zum Trimmen einer Probe ermöglicht eine schnelle und qualitativ hochwertige Aufbereitung von Probenoberflächen20,23. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Elektronenmikroskopie Auflösung der Wasserverteilung in verschiedenen Arten von Xylem-Zellen in situ ohne das Auftreten von Probenahmeartefakten. Wir führen unser aktualisiertes Verfahren ein, das seit unserer einführung stetig verbessert wurde, in Bezug auf die Probenahme, das Trimmen und die Reinigung der Probenoberfläche zur Gewinnung hochwertiger Elektronenmikroskopie von kryofixierten Xylemproben.
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Protocol
HINWEIS: Ein schematisches Diagramm dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Probenahme: Spannungsentspannung in der Wassersäule von Xylem-Schläuchen
HINWEIS: Die folgende Spannungsentspannungsbehandlung wird vor der LN 2-Anwendung empfohlen, um sowohl Einfrieren als auch Spannungsinduzierte Artefakte in der Xylem-Wasserverteilung zu vermeiden.
- Schließen Sie einen Ast und Blätter für die Probenahme mit einem schwarzen Plastikbeutel, um das Wasserpotenzial zwischen Xylem und Blättern mehr als zwei Stunden vor der Probenahme zu gleichziehen.
- Bestimmen Sie das Wasserpotenzial von mindestens zwei Blättern aus der Probe mit hilfe einer Druckkammer oder einem Psychrometer. Wenn das Wasserpotential höher ist als ca. 0,5 MPa (d. h. es gibt keine oder sehr niedrige Spannung), kann eine Probe nach dem Einfrieren geerntet werden (siehe Abschnitt 2: Fixierung einfrieren). Wenn das Wasserpotenzial unter 0,5 MPa liegt, ist eine Behandlung zur Entspannung erforderlich, wie unten beschrieben.
- Befestigen Sie einen wasserdichten Kragen um den Stiel, um mit Wasser gefüllt zu werden. Eine Plastiktasse ohne Boden kann als wasserdichter Kragen dienen. Es ist darauf zu achten, dass die Zwischenräume zwischen Stiel und Kragen mit einem Klebeband dicht versiegeln, um das Auslaufen von flüssigen Medien, die später verwendet werden, zu verhindern. Für die Ernte von flexiblen Stielen wie dünnen Zweigen oder Zweigen, versenken Sie einen Schneideteil in einen wassergefüllten Eimer, indem Sie den Stiel biegen. Mit Schnittscheren oder einer Säge unter die Wasseroberfläche schneiden. Übertragen Sie die Probe so schnell wie möglich in einen anderen Behälter mit Wasser, um die Auslage des Schnittendes der Luft zu minimieren.
- Halten Sie das geschnittene Ende der Probe unter Wasser. Stellen Sie bei Langblätttenarten sicher, dass die Länge von der Stelle, an der eine Kryoprobe für SEM bis zur Schnittkante des geernteten Stammes erhalten wird, länger ist als die maximale Gefäßlänge der Proben, um spannungsinduzierte Artefakte innerhalb der Kryoprobe zu verhindern.
- Bedecken Sie die Probe mit Blättern mit einem schwarzen Plastikbeutel, um die Transpiration zu reduzieren. Halten Sie das geschnittene Ende der Probe im Wasser und halten Sie diesen Zustand ca. 30 min, um die Xylemspannung zu entspannen. Vermeiden Sie eine längere Entspannungszeit (>1 h) durch mögliches künstliches Nachfüllen von kavitierten Leitungen12.
- Messen Sie das Wasserpotential erneut, um die Entspannung der Xylemspannung (fast 0 MPa) zu bestätigen.
HINWEIS: Vor der Probenahme sollte die maximale Gefäßlänge der Zielart mit ähnlichen Proben nach Luftinjektionsmethode erforscht oder bestimmt werden. Bei der Probenahme eines großen Baumes oder eines großen Asts ist es schwierig, die oben beschriebenen Spannungsentspannungsverfahren durchzuführen. Daher müssen Proben von großen Bäumen während der Vordämmerungszeit gesammelt werden, wenn das Xylem-Wasserpotenzial höher ist.
2. Fixierung mit LN2 einfrieren
- Schneiden und öffnen Sie eine Seite eines wasserdichten Kragens mit einer Schere oder einem Gebrauchsmesser. Befestigen Sie den Kragen um den Stiel mit einem Klebeband, während Sie die Blende horizontal halten.
- Tragen Sie Isolierhandschuhe/Handschuhe, aber stellen Sie sicher, die Flasche von LN2 sicher zu halten, und führen Sie LN2 in den Kragen, um es mit LN2zu füllen. Halten Sie es durch stetiges Hinzufügen von LN2 gefüllt, um das Wasser im Xylem vollständig einzufrieren. Die zeitabhängige Zeit für das Einfrieren hängt vom Stichprobenumfang ab; 1 min nach dem Kochen von gegossenLN2 hat für einen kleinen Zweig oder einen Sämling ausreichend, während mehr als 20 min für den Stamm eines größeren Baumes20benötigt wird. Fügen Sie LN2 während des Gefrierens kontinuierlich hinzu, da es aufgrund großer Temperaturunterschiede zwischen LN2 und Umgebungstemperaturen schnell verdunstet.
- Lösen Sie den Kragen vom gefrorenen Teil des Probenstiels, um LN2 nach ausreichender Gefrierzeit zu entfernen. Achten Sie darauf, Isolierhandschuhe zu tragen, um den Kontakt mit potenziellen LN 2-Verschüttungen zu vermeiden, die durch das Lösen des Kragens verursacht werden.
- Die Probe sofort mit einer feinen Handsäge ernten.
- Bedecken Sie die gefrorene Probe mit einem Stück Aluminiumfolie oder legen Sie sie in ein Probenrohr, auf das Proben-ID-Nummern geschrieben sind. Die geerntete Probe schnell in einen mit LN2 gefüllten Behälter geben oder in eine mit Trockeneis gefüllte isolierte Kiste packen.
- Bewahren Sie die Proben bis zur Beobachtung in einem Tiefkühlschrank auf. Die bevorzugte Lagertemperatur beträgt 80 °C, um eine Eissublimation und deren Rekristallisation während der Lagerung zu verhindern.
3. Probenvorbereitung
HINWEIS: Zur Beobachtung muss eine Probe gestutzt und ihre Oberfläche zur Beobachtung bei einer Temperatur unter Null gehobelt werden, um die Wasserverteilung in ihrem Xylem vor Ort zu halten. Ein biologisches Mikrotom mit einem Kryostatsystem (Kryostat) ist ideal zum Trimmen und Aussetzen der Oberfläche einer Probe bei dieser Art der Beobachtung durch Kryo-SEM.
- Stellen Sie die Temperatur der Probenkammer des Kryostats auf 30 °C ein, was normalerweise kalt genug ist, um den Xylemsaft der meisten Pflanzen in einem gefrorenen Zustand zu halten.
- Schneiden Sie eine Probe in ein kleines Stück (< ca. 2 cm in der Höhe und < ca. 1 cm in der Breite oder im Durchmesser) um, das für den Probenhalter eines Kryo-SEM eingestellt werden kann. Verwenden Sie ein scharfes Messer oder eine feinzahnige Säge zum Trimmen, um ein Brechen des Eises in der Probe zu verhindern. Bei einer größeren Probe, die nicht mit einem Messer geschnitten werden kann, schnell mit einer gekühlten Säge in einer Gefrierbox vorgeschnitten werden.
- Befestigen Sie das getrimmte Stück an einem Futter, einem Halter für einen Kryostat, indem Sie es auf ein Gewebe gefrierendes Einbettmedium (z. B. OCT-Verbindung) für Kryo-Sektionen montieren. Befestigen Sie dann das Futter an einem Probenhalter eines Mikrotom des Kryostats.
- Trimmen Sie die Oberfläche durch wiederholte Rasur mit 5–7 m Dickenschnitten. Das Schneiden von mehr als 1.000 bis 2.000 m in gesamter Tiefe von der Anfangsoberfläche bei der Probenentnahme ist nützlich, um den beschädigten Teil der Probe zu beseitigen, der durch Vorschneiden mit einem Messer oder einer Säge verursacht wird, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
- Nachdem Sie eine Oberfläche der Probe grob gestutzt haben, stellen Sie einen ungenutzten Teil der Mikrotomklinge über der Probenoberfläche ein. Lassen Sie die Klinge nicht die Probe berühren, die die Dickeneinstellung überschreiten würde.
- Vor dem ersten Schnitt durch den unbenutzten Klingenabschnitt den Abstand zwischen der Oberfläche der Probe und der Klinge leicht vergrößern.
- Schneiden Sie die Oberfläche der Probe nur ein- oder zweimal. Schieben Sie die Klinge anschließend erneut, indem Sie einen nicht verwendeten Klingenabschnitt auf der Oberfläche der Probe einstellen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7 drei- oder viermal. Dies ist wichtig, um eine klare Oberfläche ohne "Messerspuren" zu erhalten (Abbildung 4).
- Stellen Sie nach dem letzten Schnitt die Position der Klinge weit von der Probe ab, um zu verhindern, dass Staub auf die Probe klebt.
- Lösen Sie das Futter vom Probenhalter und lösen Sie das Exemplar vom Futter, indem Sie das gefrorene Einbettmedium mit einem scharfen Messer entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in die Kryostatkammer gelegt wird, um zu verhindern, dass ihre gehobelte Oberfläche von Froststaub absieht.
- Befestigen Sie die Probe an einem Kryo-SEM-Probenhalter mit einem Gewebe gefrierenden Einbettungsmedium in der Kryostatkammer.
4. Übertragung in die Cryo-SEM-Probenkammer
HINWEIS: Die oberflächenvorbereitete Probe muss während des Übergangs von der Kryostatkammer zur Beobachtungsstufe in der Kryo-SEM-Probenkammer vor einer Temperaturerhöhung oder Frostansammlung geschützt werden.
- Halten Sie die Kaltstufentemperatur in der Kryo-SEM-Probenkammer bei niedriger als -120 °C mit LN2 gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts.
- Legen Sie den Probenhalter mit der vorbereiteten Probe in einen mit LN2 gefüllten Isolierbehälter in die Kryostatkammer.
- Halten Sie den Probenhalter mit einer Probenaustauschstange unter der LN2. Vermeiden Sie es, den Probenhalter nach Möglichkeit der Luft auszusetzen.
- Stellen Sie den Probenhalter schnell in die Vorevakuierungskammer der Kryo-SEM-Probenkammer, sobald mit der Evakuierung der Vorevakuierungskammer begonnen wird. Legen Sie dann den Probenhalter auf die kalte Stufe, nachdem die Luft vollständig evakuiert wurde. Obwohl ein wenig Frostansammlung unvermeidbar ist, kann das "Freeze-Etching"-Verfahren (Schritt 6) es entfernen.
5. Einstellung in SEM
HINWEIS: Die typische Einstellung für die Beobachtung wird unten beschrieben. Je nach Vakuumzustand oder Elektronenstrahl sind einige Modifikationen erforderlich.
- Legen Sie die SEM-Parameter für die Beobachtung wie folgt fest:
Beschleunigungsspannung: 3–5 kV
Temperatur der Probenstufe: < -120 °C
Detektor: Sekundäremission
6. Gefrierätzung
HINWEIS: Freeze-Etching ist das Verfahren zur Akzentuierung der Kante der Zellwände der Probe durch leichte Eiskristallsublimation. Beim Gefrieren muss auch Der Oberflächenfrost entfernt werden.
- Schalten Sie die Beschleunigungsspannung der elektrischen Pistole während des Gefrierätzens ein. Es ist besser, Während der Beobachtung der Probe Gefrierätzung durchzuführen.
- Erhöhen Sie die Temperatur der Probenstufe auf 100 °C.
- Warten Sie einige Minuten, bis Froststaub entfernt wird und der Oberflächenpegel des Eises in Xylemzellen im Vergleich zu den Zellwänden leicht abgenommen hat.
- Senken Sie die Temperatur der Probenstufe auf 120 °C.
HINWEIS: Wenn für die Probenstufe kein Temperaturregler installiert ist, halten Sie die Probe mit dem Austauschstab fest und lösen Sie sie einige Minuten von der Probenstufe. Beobachten Sie die Probe mehrmals während dieses Gefrierätzungsprozesses, um den Sublimationsstatus der Probe zu überprüfen.
7. Metallbeschichtung (optional)
HINWEIS: Jüngste Verbesserungen am SEM-Instrument und der Bildverarbeitung können qualitativ hochwertige Bilder von elektrischen Isolierproben ohne Metallbeschichtung liefern. Nichtleitfähige Proben, wie z. B. biologische Materialien, sind jedoch manchmal gebührenpflichtig; höhere Helligkeit an bestimmten Positionen der Probe durch Ansammlung von Elektronen ("Aufladung"). Die Exposition der Probe gegenüber Elektronenstrahlen über einen längeren Zeitraum oder für eine hohe Vergrößerung erhöht die Ladeeffekte. Die Beschichtung der Probenoberfläche mit elektrisch-leitenden Metallmaterialien verhindert das Auftreten von Aufladungen. Verwenden Sie das Vakuumbeschichtungssystem, das in der Kryo-SEM-Einheit installiert ist, um zu verhindern, dass die Temperatur der Probe während der Beschichtung ansteigt.
- Stellen Sie sicher, dass Beschichtungsmaterial an einem bestimmten Verdampferkopf des Beschichtungssystems installiert ist.
- Halten Sie die Temperatur der Kältestufe im Beschichtungssystem unter 170 °C.
- Stellen Sie den Probenhalter nach ausreichender Gefrierätzung auf die kalte Stufe des Beschichtungssystems.
- Öffnen Sie eine Trennwand zwischen der kalten Bühne und dem Verdampferkopf.
- Stellen Sie den Strom- und Spannungswert des Verdampferkopfes auf ca. 30 mA bzw. ca. 5 V fest.
- Verdampfen Sie Beschichtungsmaterial für ca. 30 s, um die Oberfläche der Probe zu beschichten.
- Stellen Sie sowohl die Strom- als auch die Spannungswerte des Verdampferkopfes auf Null ein und schließen Sie die Trennwand.
- Stellen Sie den Probenhalter zur Beobachtung auf die kalte Stufe der Probenkammer.
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Representative Results
Repräsentative Bilder von quer geschnittenen Oberflächen von Nadel- und Breitblättchen-Xylem, beobachtet von cryo-SEM, sind in Abbildung 2dargestellt. Bei geringer Vergrößerung zeigt der schwarze Bereich in den Bildern die Hohlräume an, aus denen Wasser ganz oder teilweise verschwindet, und der graue Bereich zeigt Xylemzellenwände, Zytoplasma und Wasser an (Abbildung 2A). Bei hoher Vergrößerung ist es offensichtlich, dass das Wasser nicht vollständig von der Lumina von drei Tracheiden verloren geht, was auf das Auftreten von Makroblasen im Xylemsaft in situ hinweist (Abbildung 2B). In Bezug auf Breitlaubarten ist das Kavitationsvorkommen leicht in Gefäßen zu erkennen, während die Wasserexistenz innerhalb von Fasern schwer zu unterscheiden ist, insbesondere bei geringer Vergrößerung (Abbildung2C). Zytoplasma in Parenchymzellen kann durch eisglatte Texturen (z. B. Abbildung 2B)von Wasser innerhalb trahceids oder Gefäßen unterschieden werden.
Die Auswirkungen der Temperatur auf das Gefrierätzungsverfahren sind in Abbildung 3dargestellt. Froststaub wird nach und nach entfernt und intertracheäre Grubenmembranen werden durch das Fortschreiten der Sublimation mit zunehmender Temperatur klarer. Verbleibende große Froststaubpartikel können durch weitere Gefrierätzungen eliminiert werden, aber dies kann problematisch sein, da es unnötig den Oberflächengehalt von Eis in Xylem-Schläuchen verringert.
Die hohe Qualität der Beobachtung wird weitgehend durch eine genaue Probenvorbereitung erreicht; Besonders wichtig ist die Glättung der Oberfläche mit einer scharfen Klinge des Mikrotomes. Unzureichende Glättung durch eine gebrauchte Klinge kann manchmal zu rauer Oberfläche führen (so genannte "Messermarken", Abbildung 4) oder zahlreiche Staubvorkommen aus den Schnitten. Nach sorgfältiger Planung der Probenoberfläche ist die schnelle Übertragung der Probe in die Probenkammer auch entscheidend für die Beseitigung von Verunreinigungen durch Frostbildung.
Das Einfrieren von Proben ohne Entspannung des negativen Wassersäulendrucks führt zu einer artefaktuellen Kavitation in Xylem-Leitungen (Abbildung 5). Geballe Eiskristalle wurden in Gefäßen von Proben beobachtet, von denen die Probe nicht gelockert wurde (Pfeilspitzen in Abbildung 5A), im Gegensatz dazu wurden keine geclusterten Eiskristalle in entspannten Probenproben mit ähnlichem Wasserpotential beobachtet ( Abbildung 5 B). Dies ist bei Xylem von Laubbäumen eher signifikant als bei Nadelbäumen (unveröffentlichte Daten).
Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm dieses Protokolls. Der in diesem Dokument beschriebene Ablauf der Verfahren von der Probenahme bis zur SEM-Beobachtung wird dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel kryo-SEM-Mikrographien der quer geschnittenen Oberflächen von Angiosperm- und Gymnosperm-Baumarten. Graue und schwarze Bereiche in Xylemzellen entsprechen dem Wasser und den Hohlräumen in der Wassersäule von Xylemzellen. Da Proben vor der Probenentnahme mit flüssigem Stickstoff gefrierfixiert wurden, zeigen die Bilder von cryo-SEM den Wasserzustand der Pflanze und die native Embolie zum Zeitpunkt der Probenahme. (A) und (B): zweijähriger Zweig eines erwachsenen Baumes von Cryptomeria japonica (Nadelholz). Der Durchmesser des Zweiges betrug 3 mm, und das Wasserpotential betrug 0,39 MPa bei der Ernte im Vormorgen. (C): zweijähriger Trieb von Carpinus tschonoskii (diffuses poröses Holz) Sämling (1,4 m In-Höhe und 1,1 cm Im Basaldurchmesser). Der Sämling wurde nach Spannungsentspannungsverfahren nach längerer Bewässerungsbeschränkung für vier Tage beprobt. Das Wasserpotential betrug nach längerer Trockenheit 1,78 MPa und nach dem Spannungsentspannungsverfahren 0,15 MPa. Tr: Tracheid, R: ray parenchyma, V: Gefäß, F: Faser, AP: axiales Parenchym. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Abtauungs- und Ätzverfahren werden durch Anhebung der Temperatur der kalten Probenstufe fort. Quergeschnittene Oberfläche von Xylem eines Cryptomeria japonica Zweigs (Nadelholz). Die abnehmenden Temperaturen der Probenstufe betragen (A) -113,0 °C, (B) 105,3 °C, (C) 101,9 °C und (D) 99,7 °C. Jedes Bild wurde ca. 5 min erhalten, nachdem die Temperatur der kalten Probenstufe auf den jeweiligen Temperaturwert eingestellt wurde. Die Eissublimation schreitet fort, wenn die Temperatur der Stufe über ca. 120 °C (für unsere Geräte) gehalten wird. Tr: Tracheid, B: umrandetes Grubenpaar, Pm: Grubenmembran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiel Messermarkierung. Quergeschnittene Oberfläche von Xylem eines Cryptomeria japonica Zweigs (Nadelholz) mit sogenannten Messermarken. Pfeilspitzen und gestrichelte Linien stellen typische Messermarken dar. Die Reinigung der Oberfläche einer Probe durch einen Kryostat sollte durch einen ungenutzten Teil der Messerklinge vervollständigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiel für die Wirkung der Entspannung der Wassersäulenspannung in Leitungen. Quergeschnittene Oberfläche des Stiels eines Carpinus tschonoskii Sämling (diffuses poröses Holz), beobachtet durch kryo-SEM. Das Wasserpotenzial tagsüber war bei beiden Sämlingen ähnlich. Der Stamm des sich aufstellenden Sämlings war unversehrt gefroren (A), während der Stamm eines anderen Sämlings nach Entspannung der vorhandenen hydraulischen Spannung (B) eingefroren wurde. Das Wasserpotenzial von (B) bei der Ernte betrug nach dem Spannungsentspannungsverfahren 0,5 MPa. Pfeilspitzen in Tafel (A) sind gefrierende Artefakte von Eiskristallen in Gefäßen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die in diesem Papier eingeführten Kryo-SEM-Beobachtungsmethoden sind praktisch, um die Wasserverteilung im zellulären Maßstab klar zu visualisieren. Durch diese Methode kann die Erforschung der Veränderungen in der Verteilung von Wasser innerhalb von Xylem potenziell dazu beitragen, den Mechanismus der Toleranz von Baumarten gegenüber abiotischem Stress (Wassermangel oder Einfrieren) oder biotischem Stress (Baumkrankheit) zu klären.
Der wichtigste Schritt bei dieser Methode ist die Beibehaltung der Wasserverteilung, die für den nativen Wasserstatus während der Probenentnahme und der anschließenden Probenvorbereitung charakteristisch ist. Xylemgewebe von Arten mit langen Schläuchen (insbesondere frühe Holzgefäße von ringporösen Bäumen) kann leicht Wasser während der Ernte und des Einfrierens verlieren. Cochard et al. (2000) diskutierten gefrierende Artefakte aufgrund hoher Spannung in der Wassersäule entlang der Xylem-Schläuche38,41. Umebayashi et al. (2016) bestätigten die Gültigkeit von kryo-SEM-Beobachtungen spannungsentspannter Proben im Vergleich zu zerstörungsfreien MRT-Beobachtungen39. Beide Beobachtungstechniken zeigten ein ähnliches Muster der Wasserverteilung. Obwohl wir noch die artspezifische Robustheit gegen lufteintrittsbedingt durch Einfrieren unter hoher hydraulischer Spannung überprüfen müssen, sollten Entspannungsverfahren durchgeführt werden, um zuverlässige Schätzungen der Wasserverteilungen zu liefern, insbesondere für wassergestresste Pflanzen.
Frost- und Eispartikel sind erhebliche Hindernisse für eine detaillierte Beobachtung. Um Eine Frostansammlung zu verhindern, sollte die Probe erst dann der Atmosphäre ausgesetzt werden, wenn sie an der Kryo-SEM-Probenkammer befestigt ist. Obwohl die Exposition gegenüber der Atmosphäre während der Übertragung der Probe in die Probenkammer nicht vollständig verhindert werden kann, sollte die Transferzeit kurz gehalten werden. Der Isolierbehälter des Probenhalters sollte nach dem Entfernen des Probenhalters und LN2 gut getrocknet werden, um zu verhindern, dass Frost und Eis aus Dertaukondensation entstehen.
Die angemessene Dauer für die Gefrierätzung hängt von der Leistung der eingesetzten Instrumente ab. Wichtige Faktoren für die Bestimmung sind der Vakuumpegel in der Probenkammer und die Stabilität des Temperaturreglers der Probenstufe. Der Grad der Sublimation, der der Temperatur entspricht, sollte in erster Linie vor der formalen Anwendung beurteilt werden. Übermäßige Gefrierätzung dämlich das Vorhandensein von Wasser in Xylem-Schläuchen und macht es schwierig, identifiziert zu werden, insbesondere in der Leuchtdichte von schmalen Zellen.
Es unternimmt spezifische Schritte und Anstrengungen, um sicherzustellen, dass destruktive Methoden der Probenahme während des Einfrierens, Erntens und Trimmens frei von Artefaktvorkommen sind. Obwohl die Bedeutung des Vorkommens von Artefakten häufig hervorgehoben wird, wurde der Grad des Auftretens von Gefrierartefakten in Xylem-Schläuchen nicht ausreichend validiert38,39. Eine weitere Validierung durch zerstörungsfreie Methoden ist wünschenswert, um die Genauigkeit des Spannungsentspannungsverfahrens und der Gefrierfixierung zu bestätigen. Da die Synchrotron-basierten CT- oder MRT-Systeme bei der Untersuchung der Pflanzen-Wasser-Beziehungen im Vergleich zum Kryo-SEM-System nicht ausreichend verbreitet sind, kann die Anwendung eines kommerziellen CT-Systems möglicherweise die Validierung der Kryo-SEM-Ergebnisse voranbringen42 .
Hydraulische Baumeigenschaften, wie Saftfluss, hydraulische Leitfähigkeit von Stammsegmenten, prozentualer Verlust der Leitfähigkeit (SPS) oder Xylem-Kapazität liefern Schätzungen des Baumwassereinsatzes und der Trockenheitsbeständigkeit. Ein Vergleich des Wassereinsatzes unter den Arten ist notwendig, um das Überleben von Bäumen unter Wasserstress vorherzusagen, der durch den anthropogenen Klimawandel verursacht wird2. Die Cryo-SEM-Beobachtung hat viele Vorteile bei der Bereitstellung anatomischer Kenntnisse zur Klärung der Ursache von Veränderungen in hydraulischen Merkmalen. Die jüngsten Verbesserungen sowohl der destruktiven als auch der zerstörungsfreien Methoden der anatomischen und hydraulischen Studien können unser Verständnis der Natur des Baumwassereinsatzes vertiefen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
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