Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

התבוננות בחלוקת המים בתוך העצה מספקת מידע משמעותי בנוגע לדינמיקה של זרימת מים בצמחי הודי. במחקר זה, אנו מדגימים את הגישה המעשית להתבונן הפצת מים עצה באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM, אשר מבטלת שינויים מעשיים במצב המים במהלך הכנת המדגם.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מותקן מותקנת-יחידת (ההקפאה-SEM) מאפשר תצפית דגימה בטמפרטורות מתחת ושימש לחקר הפצת מים ברקמות הצמח בשילוב עם הקפאת טכניקות קיבוע באמצעות חנקן נוזלי ( ב 2). עבור מינים וודי, עם זאת, ההכנות להתבוננות במשטח החתך הרוחבי של עצה כרוכות בקשיים כתוצאה מכיוון של סיבי עץ. בנוסף, מתח גבוה יותר בעמודת המים ב-עצה יכול מדי פעם לגרום לשינויים העובדתיים בהפצת המים, במיוחד במהלך קיבוע המדגם והגבייה. במחקר זה, אנו להפגין הליך יעיל להתבונן התפלגות המים בתוך עצה של צמחים וודי באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM. בתחילה, במהלך איסוף המדגם, מדידת פוטנציאל המים עצה צריך לקבוע אם המתח הגבוה נמצא בתעלות עצה. כאשר הפוטנציאל הגלום במים נמוך (< ca. 0.5 MPa), נדרש הליך הרפיה במתח כדי לאפשר שימור טוב יותר של מעמד המים ב-עצה במהלך דגימת קיבוע ההקפאה. בשלב הבא, צווארון המים האטומה מוצמד מסביב לגבעול העץ ומתמלא ב-LN2 לצורך הקפאת הקיבעון של מעמד המיים של xylem. לאחר הקציר, יש לנקוט כדי להבטיח כי המדגם נשמר קפוא תוך השלמת ההליכים של הכנה לדוגמה להתבוננות. קריוסטט מועסק בבירור לחשוף את המשטח הרוחבי עצה. בתצפיות ההקפאה, התאמת הזמן לחריטה בהקפאה נדרשת כדי להסיר אבק כפור ולהדגיש את קצה קירות התא על משטח הצפייה. התוצאות שלנו להפגין את תחולת טכניקות ההקפאה-SEM להתבוננות של הפצת מים בתוך עצה ברמות סלולר ו subcellular. השילוב של ההקפאה-SEM עם שאינם הרסניים טכניקות תצפית באתרו יהיה מאוד לשפר את החקירה של הדינמיקה זרימת מים צמח וודי.

Introduction

זמינות של משאבי מים (כלומר, משקעים, תוכן אדמה) קובעת בקפדנות את התמותה ואת ההתפלגות הגיאוגרפית של מינים צמחיים, שכן הם צריכים לקלוט מים מהאדמה ולהעביר אותו לעלים לייצור פוטוסינתטי. הצמחים חייבים לשמור על מערכת התחבורה. המים שלהם תחת תנודות המים בפרט, צמחים וודי ליצור מתחים גבוהים התעלות שלהם לאורך הזרמים דיות כמו, במקרים מסוימים, הם צריכים להחזיק את הכתר שלהם יותר מ ~ 100 m מעל הקרקע. כדי לשמור על עמודי המים בלחץ שלילי כה גבוה, מורכבות התעלות ברצף של תאים צינורי עם קירות תאים קשיחים והידרופוביות מסוג1. הפגיעות בתפקוד הלקוי של המין השני במינים היא הדטרמיננטה טובה של הישרדות המינים תחת אספקתהמים. בנוסף, לימוד מעמד המים של התעלות הוא חשוב להערכת מצבם הבריאותי של העצים הבודדים החשופים ללחצים בריאותיים או ביוטיים. מדידת זרימת sap או פוטנציאל מים יכול לספק הערכות של מעמד המים של צמח וודי בשל הפונקציה הידראולי משולבת של התעלות עצה. יתר על כן, להמחיש את התפלגות המים בתאי עצה יכול להבהיר את המצב של רכיבים בודדים של מערכת הידראולי עצה.

מספר טכניקות להמחיש את מצב המים של התעלות האלה הם3. השיטות הקלאסיות והשימושיות להתבוננות במסלולי המים ברקמת העור כרוכות בצביעת עמודת המים על-ידי הטבאתה בקצות הענפים החתוכים לצבע או על-ידי הזרקת צבע לתוך עץ עומד. צילומי רנטגן רכים מאפשרים גם הדמיה של הפצת מים של דיסקי עץ חתוכים בשל עוצמת הספיגה הדיפרנציאלי של קרני רנטגן של הלחות ב-עצה5,6. שיטות אלו, עם זאת, מספקות רק שירים של תנועת מים או הפגנת הפצות מאקרוסקופי במים. לאחרונה, טכניקות תצפית שאינן הרסניות, כגון מיקרו מיקוד רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (μct)7,8,9,10ודימות תהודה מגנטית (MRI)11, 12, שופרו באופן משמעותי כדי לאפשר השגחה של מים בתוך שתילים שלמים. לשיטות אלה שאינן הרסניות יש יתרונות גדולים בכך שאנו יכולים להתבונן במצב המים של xylem ללא אפקטים מלאכותיים, ואנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של זרימת המים באמצעות הדמיה רציפה או החדרת סוכן ניגודיות10. עם זאת, אנחנו צריכים להשתמש ב-MRI מותאם אישית עבור הדמיה של הצמח או מתקן מיוחד עבור Μסינכרוטרון מבוסס-Ct כדי לקבל את התמונות אשר יכול לזהות תוכן המים ברמה התאית. בנוסף, למרות מערכת μct מבוסס סינכרוטרון לקבל תמונות משובחות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הדומה למיקרוסקופיה קלה7,8,9, תאים חיים יכולים להיפגע על ידי ה קרינה של אנרגיה גבוהה X-ray13,14. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סריקה שבו יחידות ההקפאה מותקנות (ההקפאה-SEM) היא שיטה שימושית מאוד לאיתור בדיוק את המים ב-עצה ברמה התאית, למרות שהדבר דורש לקצור את הדגימה להסתכלות. כדי לתקן את המים ב-עצה, חלק מהגבעולים (כלומר, זרדים, ענפים או גבעולים) קפואים באתרו על ידי חנקן נוזלי (LN2). תצפיות של פני השטח של גזוז, יצורים קפואים על ידי ההקפאה-SEM לספק תמונות מוגדלות ביותר של מבנה עצה שממנו אנו יכולים לזהות את המים ב-עצה כקרח. הגבלה משמעותית של שיטה זו היא כי התבוננות רציפה על מתנוכי המים בתוך אותה דוגמית היא בלתי אפשרית. עם זאת, היישום של μCT או MRI עבור התבוננות רציפה של עצים החיים בשדה הוא מאוד מאתגר משום שמכשירים אלה אינם ניידים. לעומת זאת, לבית-SEM יש פוטנציאל לשימוש בטכניקה זו על עצים גדולים בניסויים בשטח כדי להמחיש בבהירות את תוכן המים במישור הסלולר בלבד, אלא גם ברמת מבנה עדינה יותר, למשל, מים בבורות בין-כלים15, מים ב החללים הבינתאיים16, או בועות בעמודת המים17.

מחקרים רבים התבוננות מים עצה על ידי ההקפאה-SEM דווחו 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ואח ' (1996) הקים בתחילה את הפרוטוקול להתבוננות של עצה באתרו על ידי הקפאת קיבעון של גזע חי באמצעות מילוי LN2 לתוך מיכל להגדיר על גזע21. הטמפרטורה של המדגם נשמרה למטה-20 ° c במהלך איסוף המדגם במהלך הכנת ההקפאה-SEM כדי למנוע המסת הקרח בתוך התעלות עצה. שיטה זו שימש להתבונן במים ב-עצה כדי להבהיר את הפצת המים תחת שינוי משטר המים11,12,24,25,26, 27,28, הווריאציה העונתית של הפצת מים21,29,30, ההשפעה של מחזורים להפשיר הקפאה17,31, 32, התפלגות המים בעץ רטוב5, שינויים בחלוקת המים במהלך המעבר מ סאפרווד לשמוע20, קורס הזמן העונתי של פעילות הקמשוקה והבידול של כלי33, והתוצאה הנגרמת על ידי מתחים ביוטיים מסוימים23,34. מוליכות הידראולית ופגיעות תעלות כדי קוויטציה גם אומתו באמצעות ההקפאה-SEM35,36. המלון שימש לחקר התפלגות אלמנט על פני השטח של מדגם המכיל מים37, והוא מצויד באנרגיה המדלדת בעזרת הספקטרומטריה.

הקפאת קיבוע של גזע חי אשר מכיל תעלות תחת מתח הידראולי גבוה לעיתים גורם cavitations אשר נצפו על ידי המקפיא-SEM כמו גבישי קרח שבורות לומן של תעלות38,39. במיוחד, מינים ברועלים עם תעלות ארוכות ורחבות יותר פגיעים לחפצים הנובעים ממתח, כגון הפחתת החיתוך של המדגם, גם אם בוצעו מתחת למים3,40. הממצאים החזותיים להיות בולט לאחר הדגימה של עץ הטרנס (כלומר, הדגימה בזמן היום) או בתנאים חמורים בצורת והם יכולים להטעות הערכה יתר של מופע מוגזם3,38, 39. לפיכך, יש לשחרר את המתח העובד בתעלות כדי למנוע את האפשרות הארטיטיבית3,12,39.

טכניקת שבר ההקפאה באמצעות סכין מותקן בחדר דגימה מועסק לעתים קרובות כדי לחשוף את משטח הדגימה עבור התבוננות ההקפאה-SEM. עם זאת, הקפאת שבורה מטוסים של רקמות הצמח וודי, במיוחד בחלקים רוחבי של xylem משני, הם גסים מדי כדי להתבונן בבהירות תכונות אנטומית ומים ברקמה6. היישום של קריוסטט עבור זמירה דגימה מאפשר הכנה מהירה ובאיכות גבוהה של משטחים לדוגמה20,23. המטרה הכוללת של שיטה זו היא מתן ראיות עם הרזולוציה אלקטרון מיקרוסקופ של התפלגות המים בסוגים שונים של תאים עצה באתרו ללא התרחשות של חפצי הדגימה. אנו מציגים את ההליך המעודכן שלנו, אשר כבר השתפר בהתמדה מאז שאימצנו אותו לראשונה, לגבי הדגימה, זמירה וניקוי משטח הדגימה להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה של דגימות מתקן ההקפאה של xylem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: תרשים סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. דגימה: הרפיה מתיחות בתוך עמודת המים של קסיאו-תעלות

הערה: טיפול ההרפיה הבאה מומלץ לפני היישום LN2 כדי להימנע מהקפאה וממתחים-חפצים המושרה בהפצת המים הקפילאם.

  1. הקף ענף ועלים לדיגום עם שקית ניילון שחורה כדי להאביק את הפוטנציאל המים בין עצה ועלים יותר משעתיים לפני הדגימה.
  2. לקבוע את פוטנציאל המים של לפחות שני עלים מן המדגם באמצעות תא לחץ או פסיכרומטר. כאשר פוטנציאל המים גבוה מ-ca.-0.5 MPa (כלומר, אין מתח מועט מאוד), מדגם ניתן לקצור לאחר הקפאת (להתייחס לסעיף 2: הקפאת קיבעון). כאשר פוטנציאל המים נמוך מ-0.5 MPa, יש צורך בטיפול בהרפיה כמתואר להלן.
  3. לתקן את הצווארון מסביב לגבעול כדי להתמלא במים. גביע פלסטיק ללא תחתית יכול לשמש כקולר הניתן לאטימה. יש לנקוט כדי לסגור בחוזקה את החללים בין הגבעול לצווארון באמצעות סרט דביק למניעת דליפת מדיה נוזלית המשמשים לאחר מכן. לקצירת גבעולים גמישים כגון ענפים דקים או זרדים, כיור חלק חיתוך לתוך דלי מלא מים על ידי כיפוף הגבעול. חותכים מתחת למשטח המים בעזרת מזמרה או מסור. העבירו את הדגימה למיכל אחר של מים במהירות האפשרית כדי למזער את חשיפת הקצה לאוויר.
  4. שמור את החלק החתוך. של הדגימה מתחת למים עבור מינים הרחבה, ודא כי האורך מהנקודה שבה מדגם ההקפאה עבור SEM יתקבל לקצה לחתוך של הגבעול שנקטפו הוא ארוך יותר מאשר הדגימות ' אורך כלי מקסימום כדי למנוע מתח-חפצים המושרה בתוך דגימת ההקפאה.
  5. מכסים את המדגם המכיל עלים עם שקית פלסטיק שחור כדי להפחית את דיות. לשמור על קצה לחתוך של המדגם במים ולשמור על מצב זה כ 30 דקות כדי להרגיע את המתח עצה. הימנע מזמן הרפיה ארוך (> 1 h) בשל מילוי מלאכותי אפשרי של מוליכי החמצן12.
  6. למדוד את פוטנציאל המים שוב כדי לאשר את ההרפיה של המתח עצה (כמעט 0 MPa).
    הערה: לפני הדגימה, יש לטפל באורך כלי הקיבול המקסימלי של מינים היעד או לקבוע אותם בדגימות דומות על-ידי שיטת הזרקת האוויר. בעת דגימת עץ גדול, או ענף גדול, קשה לנהל את הליכי ההרפיה המותחים המתוארים לעיל. לכן יש לאסוף דגימות מעצים גדולים במהלך תקופת הזריחה כאשר פוטנציאל המים הניתן גבוה יותר.

2. הקפאת קיבעון עם LN2

  1. חותכים ופותחים צד אחד של קולר עם מספריים או סכין שכלי. חברו בחוזקה את הצווארון סביב הגבעול עם סרט דביק תוך החזקת הצמצם במאוזן.
  2. ללבוש כפפות בידוד/כפפה, אבל הקפד להחזיק את הבקבוק של2 ב בבטחה, ולרוץב 2 לתוך הצווארון כדי למלא אותו ב2. שמור אותו מתמלא בהתמדה להוסיף LN2 כדי להקפיא לחלוטין את המים ב-xylem. הזמן הנדרש להקפאה תלוי בגודל המדגם; 1 דקות לאחר הרתיחה של שפךב 2 הפסיק הוא מספיק עבור ענף קטן או שתיל, בעוד יותר מ 20 דקות יש צורך בגבעול עץ גדול יותר20. הוסף LN2 ברציפות בזמן ההקפאה כפי שהוא מתאדה במהירות בשל הבדלי טמפרטורות גדולות בין LN2 וטמפרטורות הסביבה.
  3. לנתק את הצווארון מן החלק הקפוא של הגבעול לדוגמה כדי להסיר את LN2 אחרי זמן מספיק קפוא. הקפד ללבוש כפפות בידוד כדי למנוע מגע עם פוטנציאל LN2 נשפך הנגרמת על ידי ניתוק הצווארון.
  4. לקצור את המדגם עם יד יפה מסור מיד.
  5. לכסות את המדגם קפוא עם פיסת רדיד אלומיניום או לשים אותו לתוך צינור לדוגמה, שבו כתובים מספרי מזהה לדוגמה. מקום במהירות את המדגם שנקטפו לתוך מיכל מלא ב-LN2 או לארוז לתוך קופסה מבודדת מלא קרח יבש.
  6. אחסן את הדגימות במקפיא עמוק עד להשגחה. טמפרטורת האחסון המועדפת היא-80 ° c על מנת למנוע סובלימציה קרח והדרכה במהלך האחסון.

3. הכנה לדגימה

הערה: כדי להתבונן, יש לגזוז דגימה ומשטח התצפית חייב להיות מהוקצע בטמפ ' תת-אפס כדי לשמור על הפצת המים בתוך מיקומו באתרו. מיקרוטומה ביולוגית עם מערכת קריוסטט (קריוסטט) היא אידיאלית לקיצוץ וחשיפת המשטח של הדגימה בסוג זה של התבוננות על ידי ההקפאה-SEM.

  1. הגדר את הטמפרטורה של חדר הדגימה של הקריוסטט ל-30 ° c, אשר בדרך כלל קר מספיק כדי לשמור את המצוף של רוב הצמחים במצב קפוא.
  2. לקצץ מדגם לתוך חתיכה קטנה (< ca .2 ס"מ גובה ו < ca. 1 ס"מ רוחב או קוטר) כי ניתן לכוונן את המדגם של מתקן-SEM. השתמש בסכין חדה או מסור משובח לקיצוץ כדי למנוע שבירת הקרח במדגם. במקרה של מדגם גדול יותר שלא ניתן לגזור בסכין, במהירות לחתוך מראש עם מסור מקורר בתוך המקפיא.
  3. הצמד את החלק החתוך לצ, מחזיק להקפאה באמצעות הרכבה על מדיום הטבעה של רקמות (g., מתחם OCT) לצורך הקפאת ההקפאה. ואז, חברו את הצ למחזיק. דגימות של הקריוסטט
  4. חתוך את פני השטח על ידי גילוח שוב ושוב עם 5 – 7 יקרומטר סעיפים בעובי. זמירה על ידי גזירה יותר מ 1,000 כדי 2,000 μm, בעומק מוחלט מהמשטח הראשונית באוסף לדוגמה, הוא שימושי לחיסול החלק הפגום של המדגם שנגרם על ידי מראש חיתוך עם סכין או ראיתי כמתואר בשלב 3.2.
  5. לאחר חיתוך בערך משטח של המדגם, להתאים חלק בלתי מנוצל של להב מיקרוטומה מעל פני השטח של הדגימה. אל תאפשר ללהב לגעת במדגם שיעלה על הגדרת העובי.
  6. לפני החתך הראשון של חלק הלהב שלא נעשה בו שימוש, הרחב מעט את המרחק בין המשטח של הדגימה לבין הלהב.
  7. חותכים את פני השטח של הדגימה רק פעם או פעמיים. בנוסף, החלק את הלהב שוב כוונון חלק להב שאינו בשימוש על פני הדגימה.
  8. חזור על שלבים 3.6 ו-3.7 שלוש או ארבע פעמים. זה חשוב על מנת לקבל משטח ברור ללא "סימני סכין" (איור 4).
  9. לאחר החיתוך הסופי, הגדר את מיקום הלהב רחוק מהדוגמה כדי למנוע מאבק לדבוק במדגם.
  10. לנתק את צ'אק מבעל הדגימה ולנתק את הדגימה מן צ ' אק על ידי הסרת מדיום הטבעה קפואה עם סכין חדה. ודא כי הדגימה ממוקם בחדר קריוסטט כדי למנוע את משטח מהוקצע מאבק כפור.
  11. עם מדיום הטבעה של רקמות. בחדר קריוסטט

4. העברה לחדר הדגימה

הערה: על פני השטח-הדגם המוכן להיות מוגן מפני גידול של טמפרטורה או הצטברות של כפור במהלך ההעברה מחדר ההקפאה לשלב התצפית בחדר הדגימות של ההקפאה-סם.

  1. שמרו על טמפרטורת הבמה הקרה בחדר הדגימות של ה-SEM-סם בנמוך מ-120 ° c עם LN2 בהתאם למדריך למשתמש של הציוד.
  2. מניחים את מחזיק הדגימה עם הדגימה מוכן לתוך מכולה בידוד מלא ב-LN2 בחדר קריוסטט.
  3. החזיקו את מחזיק הדגימה עם. מוט החלפהמתחת לחדר השני הימנע מחשיפת מחזיק הדגימה לאוויר כאשר הדבר אפשרי.
  4. הגדר במהירות את מחזיק הדגימה לחדר הפינוי מראש של תא הדגימה של ה-SEM-סם ברגע התחלת פינוי של תא טרום הפינוי. ואז, מניחים את מחזיק הדגימה על הבמה הקר לאחר האוויר מפונה לחלוטין. למרות שמעט הצטברות כפור היא בלתי נמנעת, הליך "הקפאת חריטה" (שלב 6) יכול להסיר אותו.

5. הגדרת SEM

הערה: הגדרה אופיינית להתבוננות מתוארת להלן. חלק מהשינויים נדרשים בהתאם למצב הוואקום או לקרן האלקטרונים.

  1. הגדר את פרמטרי ה-SEM להשגחה כדלקמן:
    מתח תאוצה: 3 – 5 kV
    טמפרטורת הבמה: <-120 ° c
    גלאי: פליטה משנית

6. הקפאת חריטה

הערה: הקפאת-תחריט היא ההליך להדגשת הקצה של קירות התא של המדגם על ידי סובלימציה קלה של גביש קרח. הקפאת חריטה כרוכה גם הסרת dusts כפור פני השטח.

  1. הפעל את מתח ההאצה של הרובה החשמלי בזמן הקפאת החריטה. מוטב לערוך חריטה בהקפאה תוך כדי צפייה בדגימה.
  2. העלו את טמפרטורת הדגימה ל-100 ° c.
  3. המתן מספר דקות עד להסרת אבק פרוסט ורמת פני השטח של הקרח בתאים עצה ירדה מעט בהשוואה לקירות התא.
  4. הנמך את טמפרטורת הדגימה ל-120 ° c.
    הערה: אם אין בקר טמפרטורה מותקן עבור הבמה הדגימה, להחזיק את הדגימה באמצעות מוט החליפין ולנתק אותו משלב הדגימה לכמה דקות. שימו לב לדגימה מספר פעמים במהלך תהליך ההקפאה, כדי לאמת את סטטוס הסובלימציה של הדגימה.

7. ציפוי מתכת (אופציונלי)

הערה: השיפורים האחרונים בכלי SEM ועיבוד התמונה יכולים לספק תמונות באיכות גבוהה של דגימות חשמל ללא ציפוי מתכת. עם זאת, מרכיבים שאינם מוליכי החשמל, כגון חומרים ביולוגיים, לעיתים מגובים; בהירות גבוהה יותר במיקומים ספציפיים של הדגימה בשל הצטברות של אלקטרונים ("טעינה"). חשיפת הדגימה לקורות אלקטרונים למשך פרק זמן ארוך יותר, או להגדלה גבוהה, מגבירה את אפקטי הטעינה. ציפוי המשטח של הדגימה עם חומרי מתכת חשמליים מוליך מונע התרחשות של טעינה. השתמש במערכת ציפוי ואקום אשר מותקן בתוך יחידת ההקפאה כדי למנוע את הטמפרטורה של הדגימה להגדיל במהלך ציפוי.

  1. ודא כי חומר הציפוי מותקן בראש מאייד מיועד של מערכת הציפוי.
  2. שמרו על טמפרטורת השלב הקרה במערכת הציפוי שמתחת ל-170 ° c.
  3. מניחים את מחזיק הדגימה בשלב הקר של מערכת הציפוי לאחר הקפאה מספקת.
  4. פתח מחיצה בין השלב הקר לראש המאייד.
  5. הגדר את הערך הנוכחי ואת ערך המתח של ראש המאייד ב-ca. 30 mA ו-ca .5 V, בהתאמה.
  6. להתנדף חומר ציפוי עבור ca. 30 לחלוק את פני השטח של הדגימה.
  7. הגדר את שני ערכי המתח הנוכחיים של ראש המאייד באפס וסגור את המחיצה.
  8. מניחים את מחזיק הדגימה על השלב הקר של חדר הדגימה להשגחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות מייצגות של משטחי חיתוך רוחבי של עץ מחטניים וברועלים, שנצפתה על ידי המקפיא-SEM, מוצגים באיור 2. בהגדלה הנמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שמהם המים לחלוטין או בחלקו נעלמים, והאזור האפור מצביע על קירות תא מסוימים, ציטופלסמה ומים (איור 2א). בהגדלה גבוהה, ניכר כי המים אינם אבודים לחלוטין מלומינה של שלוש דלקת הקנה, ומציינים את הופעת בועות המאקרו ב-עצה באתרו (איור 2ב'). ביחס למיני-עלים, ניתן להבחין בקלות בתוך כלי קיבול, בעוד שקיום המים קשה להבחנה בתוך סיבים, במיוחד בהגדלה נמוכה (איור 2ג). ציטופלסמה בתאים מסוימים ניתן להבדיל ממים בתוך trahceids או כלי דרך מרקמים קרח רגיל (למשל, איור 2B).

השפעת הטמפרטורה בתהליך ההקפאה מוצגת באיור 3. אבק פרוסט הוא הוסר בהדרגה וממברנות בור הקנה הבין להיות ברור דרך ההתקדמות של סובלימציה עם הגדלת הטמפרטורה. חלקיקי אבק הכפור הנותרים יכולים להיות מסולקים על-ידי הקפאת חריטה נוספת אבל זה יכול להיות בעייתי כפי שלא לצורך מקטין את פני השטח של הקרח בתעלות עצה.

איכות גבוהה של התבוננות מושגת במידה רבה באמצעות הכנה הדגימה מדויקת; חשוב במיוחד הוא להחלקת המשטח עם להב חדה של המיקרוטומה. החלקה מספקת על ידי להב משומש יכול לפעמים לגרום למשטח מחוספס (נקרא "סימני סכין", איור 4) או מופעים רבים של אבק מן החתכים. לאחר תכנון קפדני של משטח הדגימה, העברה מהירה של הדגימה לחדר הדגימה חיונית גם לסילוק זהום הנגרמת על ידי היווצרות פרוסט.

הקפאה לדוגמה ללא הרפיה של לחץ על המים השליליים תגרום לאינדוקציה העובדתית של החפירה ב-עצה (איור 5). גבישי קרח מקובצים באשכולות נצפו בכלי של דגימות שמהן המדגם לא היה נינוח (ראשי חץ באיור 5א), באופן הקונטרסטי, אין גבישי קרח מקובצים באשכולות שנצפו בדגימות שלווה עם פוטנציאל מים דומה ( איור 5 ב). זה נוטה להיות יותר משמעותי ב-עצה של עצים מרועלים ולא בעצי מחטניים (נתונים שלא פורסמו).

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של פרוטוקול זה. זרימת ההליכים מדגימה לתצפיות SEM המתוארת במאמר זה מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לדוגמה מיקרוגרפים של ההקפאה של המשטחים החתוכים לרוחב של אנגיוזרע ומינים של עצי זרע. שטחים אפורים ושחורים בתאים עצה תואמים את המים וחללים בעמודת המים של תאים עצה, בהתאמה. מאז הדגימות היו הקפאה קבוע עם חנקן נוזלי לפני איסוף המדגם, התמונות על ידי ההקפאה-SEM להראות את מצב המים של הצמח ותסחיף יליד ברגע של דגימה. (א) ו-(ב): ענף בן שנתיים של עץ בוגר של קריפטומריה (עץ מחטניים). קוטרו של הענף היה 3 מ"מ, ופוטנציאל המים היה כ-0.39 MPa בקציר מוקדם. (ג): בן שנתיים לירות של קראורן שתיל (מפוזר-נקבובי עץ) נבט (1.4 m בגובה ו 1.1 ס מ בקוטר בסיס). שתיל שנדגם לאחר הליך הרפיה למתח בעקבות הגבלה ממושכת של השקיה במשך ארבעה ימים. הפוטנציאל הימי היה-1.78 MPa לאחר בצורת ממושכת והיה-0.15 MPa לאחר הליך הרפיה במתח. Tr: מזהה קנה, R: ray בנקודת מיון, V: כלי קיבול, F: סיבים, AP: צירית בציר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפשרה וצריבה של התקדמות ההליך על ידי העלאת הטמפרטורה של שלב הדגימה הקר. משטח חיתוך רוחבי של הכלי של מחטניים (עץ). הטמפרטורות היורדות של שלב הדגימה הן (א)-113.0 ° c, (ב)-105.3 ° c, (ג)-101.9 ° צ' ו-(ד)-99.7 ° c. כל תמונה הושגה כ 5 דקות לאחר הטמפרטורה של שלב הדגימה הקר נקבע בערך הטמפרטורה המתאימה. סובלימציה הקרח מתקדמת אם הטמפרטורה של הבמה נשמרת מעל כ-120 ° צ' (עבור הציוד שלנו). Tr: מזהה קנה, B: מספר הבור גובל, Pm: קרום בור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: למשל סימן סכין. משטח חיתוך רוחבי של מיכל של מחטניים (עץ) מראה כביכול סימני סכין. ראשי חץ וקווים מקווקווים מייצגים סימני סכין טיפוסיים. יש להשלים את המשטח של הדגימה באמצעות קריוסטט, על ידי חלק שאינו בשימוש של להב הסכין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמה לאפקט ההרפיה של מתח המים בתעלות. משטח חיתוך רוחבי של גבעול שתיל קרונציאני (מפוזר-נקבובי עץ) נצפתה על ידי ההקפאה-SEM. פוטנציאל המים במהלך היום היה דומה בשני השתילים. הגבעול של שתיל הספינג היה קפוא ללא פגע (א), בעוד הגבעול של שתיל אחר היה קפוא לאחר הרפיה של המתח הידראולי הקיים (ב). הפוטנציאל הגלום במים (ב) בקציר היה כ-0.5 MPa לאחר הליך הרפיה במתח. ראשי חץ בפאנל (א) הם הקפאת ממצאים של גבישי קרח בתוך כלי קיבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות ההתבוננות ב-"קריו-SEM" שהוצגו במסמך זה מעשיות לצורך המחשה מהירה של חלוקת המים בקנה מידה תאי. באמצעות שיטה זו, לחקור את השינויים בחלוקת המים בתוך עצה יכול לעזור להבהיר את המנגנון של מינים העצים סובלנות ללחץ אביוטיים (מחסור במים או הקפאה) או מתחים ביוטי (מחלת עץ).

הצעד המכריע ביותר בשיטה זו הוא שמירה על הפצת המים האופיינית למצב המים הילידים במהלך איסוף המדגם וההכנה לדוגמה הבאה. רקמת מינים מסוג xylem עם תעלות ארוכות (בעיקר כלי האריווד של טבעת, מחוררים עצים) יכולים בקלות לאבד מים במהלך הקציר וההקפאה. קוצ'ארד אל (2000) דנו בהקפאת הממצאים עקב מתח גבוה בעמודת המים לאורך עצה38,41. אוממאבאשי ואח ' (2016) אישר את תוקפו של תצפיות ההקפאה על דגימות מתיחות באמצעות השוואה לתצפיות שאינן הרסניות ל-MRI39. שתי טכניקות התצפית הראו דפוס דומה של הפצת המים. למרות שאנו עדיין צריכים לאמת את החסינות הספציפית למין כנגד הזנת האוויר באמצעות הקפאה תחת מתח הידראולי גבוה, יש לנהל הליכי הרפיה כדי לספק הערכות אמינות של הפצות מים, ובמיוחד עבור צמחים הדגיש מים.

חלקיקי כפור וקרח הם מכשולים משמעותיים להתבוננות מפורטת. כדי למנוע הצטברות כפור, אין לחשוף את הדגימה לאטמוספירה עד שהיא מחוברת לחדר הדגימה של ה-SEM-סם. למרות שחשיפה לאטמוספירה לא יכולה להיות מנועה לחלוטין במהלך העברת הדגימה לחדר הדגימה, יש לשמור על קצר בזמן ההעברה. מיכל העברת בידוד של בעל הדגימה צריך להיות מיובש היטב לאחר הסרת מחזיק הדגימה LN2 כדי למנוע כפור וקרח מקורו עיבוי הטל.

משך הזמן המתאים לחריטה בהקפאה תלוי בביצועי המכשירים שבשימוש. גורמים חשובים בקביעת זה הם רמת ואקום בחדר הדגימה ואת היציבות של בקר הטמפרטורה של הבמה הדגימה. היקף הסובלימציה המתאים לטמפרטורה צריך להיות מוערך בעיקר לפני שימוש רשמי. הקפאה מוגזמת מחליש את נוכחות המים בתוך התעלות ומקשה על הזיהוי, בעיקר בתאים צרים.

זה לוקח צעדים ספציפיים ומאמצים כדי להבטיח כי שיטות הרסניות של דגימה חופשיים מהתרחשות החפץ במהלך ההקפאה, קציר וקיצוץ הליכים. למרות שמשמעות ההתרחשות של הממצאים מצביעה לעתים קרובות, מידת ההתרחשות של ממצאים מוקפאים ב-עצה לא אומתה מספיק38,39. אימות נוסף על ידי שיטות שאינן הרסניות רצוי כדי לאשר את הדיוק של הליך הרפיה המתח ואת הקיבעון הקפאה. מאז סינכרוטרון מבוסס μCT או מערכות MRI לא היו שכיחה מספיק במחקר של יחסי מים הצמח על ידי השוואה אל מערכת ההקפאה, יישום של מערכת μCT מסחרי יכול להתקדם את האימות של התוצאות של ההקפאה-SEM42 .

הידראולי תכונות עץ, כגון שטף הצוף, מוליכות הידראולית של מקטעי גזע, אחוז אובדן של מוליכות (PLC), או הקיבול עצה לספק הערכות של שימוש במים עץ התנגדות לבצורת. השוואה של שימוש במים בקרב מינים נדרש לניבוי הישרדות העצים תחת לחץ מים נגרמת על ידי אנתרופוגניים שינוי האקלים2. התבוננות של ההקפאה-SEM יש יתרונות רבים במתן ידע אנטומי להבהרת הגורם לשינויים בתוך תכונות הידראוליות. השיפורים האחרונים של שיטות הרסניות ושאינן הרסניות של צמחים מחקרים אנטומיים הידראולי יכול יחד להעמיק את ההבנה שלנו של הטבע של השימוש מים עץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מ20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04936, 17H03825, 18H02258)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees - Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision - A test of Scholander's assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees - Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm? Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees - Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species? Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees - Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts? Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees - Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 148 ההקפאה-SEM קריוסטט הקפאת קיבעון הרפיה מתח הפצת מים מוליכי החשמל
התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter