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극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59154
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Department of Plant Ecology, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 2Kansai Research Center, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 3Department of Wood Properties and Processing, Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI), 4Faculty of Agriculture, Kyushu University, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 6Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University

Summary

xylem 내의 물 분포를 관찰하면 우디 식물의 물 흐름 역학에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이 연구에서는 시료 준비 중 물 상태의 실제 적 변화를 제거하는 저온 유지 및 저온 SEM을 사용하여 현장에서 자일렘 물 분포를 관찰하는 실용적인 접근 법을 보여줍니다.

Abstract

스캐닝 전자 현미경 설치 저온 장치(cryo-SEM)는 영하의 온도에서 시편 관찰을 가능하게 하며 액체 질소(LN)를 이용한 동결 고정 기술과 함께 식물 조직의 물 분포를 탐색하는 데 사용되어 왔습니다. 2). 우디 종의 경우, xylem 가로 절단 표면을 관찰하기위한 준비는 나무 섬유의 배향으로 인해 몇 가지 어려움을 수반한다. 또한, 자일렘 도관의 물 기둥의 높은 장력은 특히 샘플 고정 및 수집 중에 물 분포에 예술적 변화를 일으킬 수 있습니다. 본 연구에서, 우리는 저온 극저온 및 저온 -SEM을 사용하여 현장에서 우디 식물의 자일렘 내에서 물 분포를 관찰하는 효율적인 절차를 입증한다. 처음에, 샘플 수집 하는 동안, 자일렘 물 전위를 측정 하는 높은 장력이 자일렘 도관에 존재 여부를 결정 한다. 자일렘 물 전위가 낮을 때(ca. -0.5 MPa), 시료 동결 고정 중에 자일렘 도관에서 물 상태를 더 잘 보존하기 위해 장력 완화 절차가 필요합니다. 다음으로, 나무 줄기 주위에 방수 칼라가 부착되고 자일렘의 물 상태의 동결 고정을 위해 LN 2로 채워져 있습니다. 수확 후, 관찰을위한 샘플 준비 절차를 완료하는 동안 샘플이 동결 보존되도록주의를 기울여야합니다. 실렘 가로 절단 표면을 명확하게 노출시키기 위해 저온 극저온이 사용됩니다. 저온-SEM 관측에서, 동결 에칭을 위한 시간 조정은 서리 먼지를 제거하고 보기 표면에 세포벽의 가장자리를 강조하기 위하여 요구됩니다. 우리의 결과는 세포 및 세포 이하 수준에서 자일렘 내의 물 분포의 관찰을 위한 저온-SEM 기술의 적용성을 보여줍니다. 극저온-SEM과 비파괴적 관측 기법의 조합은 우디 식물의 물 흐름 역학의 탐사를 심오하게 향상시킬 것입니다.

Introduction

수자원의 가용성 (즉, 강수량, 토양 수분 함량)은 토양에서 물을 흡수하고 광합성 생산을 위해 잎으로 운반해야하기 때문에 식물 종의 사망률과 지리적 분포를 엄격하게 결정합니다. 플랜트는 변동하는 물 공급 하에서 물 수송 시스템을 유지해야 합니다. 특히, 우디 식물은 증발 스트림을 따라 자신의 도관에 높은 장력을 생성, 어떤 경우에는, 그들은 지상 ~ 100m 이상 자신의 크라운을 개최해야합니다. 이러한 높은 음압 하에서 물 기둥을 유지하기 위해 자일렘 도관은 단단하고 소수성 결찰 된 세포벽1을가진 관형 세포의 연속체로 구성됩니다. 각 종에서 자일렘 도관의 자일렘 기능 장애에 대한 취약성은 변동하는 물 공급 하에서종 생존의 좋은 결정자이다 2. 또한, 자일렘 도관의 물 상태를 연구하는 것은 비생물성 또는 생체 학적 응력을 받는 개별 나무의 건강 상태를 평가하는 데 중요합니다. 수액 유량 또는 물 전위를 측정하면 자일렘 도관의 통합 유압 기능으로 인해 우디 플랜트의 물 상태를 추정할 수 있습니다. 또한, 자일렘 셀에서 물의 분포를 시각화하면 자일렘 유압 시스템의 개별 구성 요소의 상태를 명확히 할 수 있습니다.

자일렘 도관의 물 상태를 시각화하기위한 몇 가지 기술이 존재3. 우디 조직에서 물 통로를 관찰하기위한 고전적이고 유용한 방법은 염색에 절단 가지의 끝을 침지하거나 서있는 나무 줄기에 염료를 주입하여 물 기둥을 염색하는 것을 포함한다4. 소프트 엑스레이 사진은 또한 xylem5,6의수분의 차동 X 선 흡수 강도로 인해 슬라이스 된 나무 디스크의 물 분포를 시각화 할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 물의 움직임만을 제공하거나 물의 거시적 분포를 보여줍니다. 최근에는 마이크로 포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 7,8,9,10및 자기 공명 영상(MRI)11과 같은 비파괴 관찰 기술 도12는, 그대로 의 묘목 내에서 자일렘 도관에서 물의 관찰을 허용하도록 크게 개선되었다. 이러한 비파괴적 방법은 인공 절단 효과 없이 자일렘의 수상태를 관찰할 수 있고, 순차적 이미징 또는 조영제(10)를 도입하여 물 흐름 역학을 추적할 수 있다는 점에서 큰 장점이 있다. 그러나, 우리는 세포 수준 수분 함량을 확인할 수 있는 심상을 얻기 위하여 식물 화상 진찰을 위한 주문을 받아서 만들어진 MRI 또는 싱크로트론 기지를 둔 μCT를 위한 전문화한 시설을 사용할 필요가 있습니다. 또한, 싱크로트론 기반 μCT 시스템은 광 현미경 7,8,9에필적하는 높은 공간 해상도로 미세한 이미지를 얻을 수 있지만, 살아있는 세포는 고에너지 X 선13,14의방사선 . 저온 단위가 설치되는 주사 전자 현미경 (cryo-SEM)을 사용하는 것은 관찰을 위해 샘플을 파괴적으로 수확해야하지만 세포 수준에서 자일렘에서 물을 정확하게 찾는 데 매우 유용한 방법입니다. 자일렘 도관에 물을 고정하기 위해, 줄기의 일부 (즉, 나뭇 가지, 가지 또는 줄기)는 액체 질소 (LN 2)에 의해 그 자체로 동결된다. 저온-SEM에 의해 트리밍, 냉동 표본의 표면의 관측은 우리가 얼음으로 자일렘 도관에서 물을 식별 할 수있는 자일렘 구조의 고도로 확대 된 이미지를 제공합니다. 이 방법의 현저한 한계는 동일한 샘플 내에서 물 이동성의 순차적 관찰이 불가능하다는 것입니다. 그러나, 이러한 기기는 휴대용이 아니기 때문에 필드에 살고있는 나무의 순차적 관찰을위한 μCT 또는 MRI의 적용은 매우 도전적이다. 대조적으로, cryo-SEM은 세포 수준뿐만 아니라 더 미세한 구조 수준(예: 혈관 간 구덩이15,물)에서 수분 함량을 명확하게 시각화하기 위해 현장 실험에서 큰 나무에 이 기술을 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포간 공간16,또는 물 열(17)의거품.

저온-SEM에 의한 자일렘물을 관찰하는 많은 연구가 5,12,18,19,20,21,23으로보고되었다. Utsumi et al. (1996)은 처음에 LN 2를 스템(21)에 설정된 용기에 채우는 것을 통해 살아있는 트렁크의 동결 고정에 의해 소자렘의 관찰을 위한 프로토콜을 확립하였다. 시료의 온도는 자일렘 도관 내에서 얼음이 녹는 것을 피하기 위해 시료 수집 및 냉동-SEM 준비 동안 -20°C 이하로 유지되었다. 이 방법은 변화하는 물 정권11,12,24,25,26,변화 하의 물 분포를 명확히하기 위해 실렘에서 물을 관찰하는 데사용되었습니다. 27,28,물 분포의 계절 변화21,29,30,동결 해동 주기의 효과17,31, 32,젖은 나무5에있는 물의 분포, 수액에서 하트우드(20)로의 전환 시 물 분포의 변화, 암비 활동및 선박의 분화의 계절적 시간과정(33) 및 특정 생체 스트레스에 의해 유도 된 캐비테이션23,34. 캐비테이션에 대한 유압 전도도 및 도관 취약성도 저온-SEM35,36을사용하여 검증되었습니다. 에너지 분산X선분광법(EDX 또는 EDS)을 구비한 극저온-SEM은 물(37)을 함유하는 시편의표면에 대한 원소 분포를 연구하는데 사용되어 왔다.

높은 유압 장력 하에서 도관을 포함하는 살아있는 트렁크의 동결 고정은 때때로 도관38,39의내강에서 골절 된 얼음 결정으로 극저온 -SEM에 의해 관찰되는 인공 캐비테이션을 유발합니다. 특히, 더 길고 넓은 도관을 가진 광엽종은 수중에서실시하더라도 시료 절단에 의한 캐비테이션과 같은 장력 유발 아티팩트에 취약하다. 캐비테이션 아티팩트는 발생하는 나무 (즉, 낮 동안 샘플링) 또는 심한 가뭄 조건에서 샘플링 한 후 눈에 띄게되며 캐비테이션 발생 3,38의과대 평가로 이어질 수 있습니다. 39. 따라서, 도관에서 작동하는 장력은 예술적 캐비테이션3,12,39를피하기 위해 방출되어야한다.

시편 챔버에 설치된 칼을 사용하는 동결 파괴 기술은 종종 저온 -SEM 관찰을위해 시편 표면을 노출하는 데 사용됩니다. 그러나, 우디 식물 조직의 동결 골절 평면, 특히 보조 자일렘의 횡절편은 조직 내의 해부학적 특징과물을 명확하게 관찰하기에는 너무 거칠다 6. 시편을 다듬기위한 저온 극저온의 응용 프로그램은 샘플 표면(20,23)의신속하고 고품질의 준비를 할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 샘플링 아티팩트의 발생없이 현장에서 다양한 종류의 자일렘 세포에서 물 분포의 전자 현미경 해상도를 제공하는 것입니다. 우리는 자일렘의 고품질 전자 현미경 을 얻기 위한 표본 표면의 샘플링, 트리밍 및 세척과 관련하여 처음 채택된 이래로 꾸준히 개선된 업데이트된 절차를 소개합니다.

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Protocol

참고: 이 프로토콜의 회로도 차트는 그림1에 나와 있습니다.

1. 샘플링 : 자일렘 도관의 물 기둥 내에서 긴장 완화

참고: 다음 장력 이완 처리는 LN2 적용 전에 실렘 물 분포에서 동결 및 장력 유도 아티팩트를 모두 피하기 위해 권장됩니다.

  1. 분기를 동봉하고 자일렘과 샘플링 하기 전에 2 시간 이상 잎 사이의 물 잠재력을 평형 검은 비닐 봉지와 샘플링 을 위해 잎.
  2. 압력 챔버 또는 사이크롬터를 사용하여 샘플로부터 적어도 2개의 잎의 물 전위를 결정한다. 물 전위가 ca. -0.5 MPa(즉, 없음 또는 매우 낮은 장력이 존재함)보다 높을 때, 시료는 동결 후 수확될 수 있다(섹션 2: 동결 고정참조). 물 전위가 -0.5 MPa보다 낮으면 아래에 설명된 대로 이완을 위한 치료가 필요합니다.
  3. 물로 채워지려면 줄기 주위에 방수 칼라를 고정하십시오. 바닥이없는 플라스틱 컵은 방수 칼라역할을 할 수 있습니다. 이후에 사용되는 액체 매체의 누출을 방지하기 위해 끈적끈적한 테이프를 사용하여 스템과 칼라 사이의 공간을 단단히 밀봉하는 데 주의를 기울여야 합니다. 얇은 가지 나뭇 가지 또는 나뭇 가지와 같은 유연한 줄기를 수확하기 위해 줄기를 구부려 물이 채워진 양동이에 절단 부분을 싱크하십시오. 전정 가위 또는 톱을 사용하여 물 표면 에서 잘라. 절단 된 끝이 공기에 노출되는 것을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 다른 물 용기에 샘플을 옮김.
  4. 샘플의 절단 된 끝을 물 아래에 보관하십시오. 광엽 종의 경우, SEM용 저온 샘플이 수확된 줄기의 절단 가장자리까지 얻어질 스팟의 길이가 극저온 시료 내의 장력 유발 아티팩트를 방지하기 위해 시료의 최대 용기 길이보다 길어야 합니다.
  5. 잎이 들어있는 샘플을 검은 색 비닐 봉지로 덮어 증발을 줄입니다. 시료의 절단 단부는 물에 보관하고 자일렘 장력을 완화하기 위해 약 30 분 동안이 상태를 유지하십시오. 캐비테이션 도관12의인공 리필 가능성으로 인해 더 긴 휴식 시간 (>1 h)을 피하십시오.
  6. 자일렘 장력의 이완을 확인하기 위해 다시 물 전위를 측정합니다 (거의 0 MPa).
    참고: 샘플링전에 는 공기 주입 방법에 따라 유사한 시료로 대상 종의 최대 용기 길이를 조사하거나 결정해야 합니다. 큰 나무, 또는 큰 가지를 샘플링 할 때, 위에서 설명한 장력 완화 절차를 수행하기가 어렵습니다. 따라서, 큰 나무에서 샘플은 자일렘 물 전위가 높은 새벽 기간 동안 수집해야합니다.

2. LN 2로 고정 고정

  1. 가위 또는 유틸리티 나이프로 방수 칼라의 한쪽면을 자르고 엽니다. 조리개를 수평으로 유지하면서 스템 주위의 칼라를 접착 테이프로 단단히 부착하십시오.
  2. 절연 장갑 /장갑을 착용하지만 LN 2의 병을 안전하게 잡고 LN2를 칼라에 실행하여 LN2로채웁니다. LN 2를 꾸준히 추가하여 자일렘의 물을 완전히 얼린 상태로 유지하십시오. 동결에 필요한 시간은 샘플 크기에 따라 다릅니다. LN 2를 부은 후 1분은 작은 나뭇가지 또는 묘목을 위해 충분하며, 20분 이상은 더 큰나무(20)의줄기에 필요하다. LN2와 주변 온도 사이의 큰 온도 차이로 인해 빠르게 증발하기 때문에 냉동 중에 LN2를 지속적으로 추가하십시오.
  3. 충분한 동결 시간 후에 LN 2를 제거하기 위해 샘플 스템의 냉동 부분에서 칼라를 분리합니다. 칼라를 분리하여 발생할 수 있는 LN2 유출과의 접촉을 피하기 위해 절연 장갑을 착용하십시오.
  4. 즉시 미세 한 손으로 샘플을 수확.
  5. 냉동 된 샘플을 알루미늄 호일로 덮거나 샘플 ID 번호가 기록된 샘플 튜브에 넣습니다. 수확한 시료를 LN 2로 채워진 용기에 빠르게 넣거나 드라이 아이스로 채워진 절연 상자에 포장하십시오.
  6. 관찰될 때까지 샘플을 깊은 냉동실에 보관합니다. 바람직한 저장 온도는 저장하는 동안 얼음 승화 및 재결정화를 방지하기 위해 -80 °C입니다.

3. 표본 준비

참고: 관찰을 위해 시료를 다듬어야 하며, 물 분포를 현장에서 자일렘에 보관하려면 관찰을 위해 표면을 영하의 온도로 계획해야 합니다. 저온 유지 시스템(cryostat)을 가진 생물학적 마이크로토임은 저온-SEM에 의한 이러한 유형의 관찰에서 시편의 표면을 트리밍하고 노출하는 데 이상적입니다.

  1. 냉동 상태의 시편 챔버의 온도를 -30 °C로 설정하며, 이는 일반적으로 대부분의 식물의 실렘 수액을 동결 상태로 유지할 만큼 충분히 차가운 것입니다.
  2. 샘플을 극저온-SEM의 시편 홀더에 맞게 조정할 수 있는 작은 조각(높이 2cm 및 폭 또는 직경 1cm)으로 다듬어 시편의 얼음이 깨지는 것을 방지하기 위해 날카로운 칼이나 미세 톱을 사용하여 트리밍합니다. 칼로 절단 할 수없는 큰 샘플의 경우, 신속하게 냉동고 상자에 냉각 톱으로 미리 잘라.
  3. 트리밍된 조각을 극저온 절편을 위해 조직 동결 포함 매체(예: OCT 화합물)에 장착하여 저온 극저온을 위한 홀더인 척에 부착합니다. 그런 다음 척을 저온 유지의 마이크로토메의 시편 홀더에 부착합니다.
  4. 두께가 5-7 μm 섹션으로 반복적으로 면도하여 표면을 다듬습니다. 샘플 수집시 초기 표면으로부터 1,000 μm 이상에서 2,000 μm 이상을 절단하여 트리밍하는 것은 3.2단계에서 설명한 바와 같이 칼로 사전 절단또는 톱으로 인한 시료의 손상된 부분을 제거하는 데 유용하다.
  5. 시료의 표면을 대략 다듬은 후, 시편 표면 위의 마이크로톤 블레이드의 사용되지 않는 부분을 조정합니다. 블레이드가 두께 설정을 초과하는 샘플에 닿지 않도록 하십시오.
  6. 사용하지 않은 블레이드 부분에 의해 첫 번째 절단하기 전에, 시편과 블레이드의 표면 사이의 거리를 약간 넓어.
  7. 시료 표면을 한두 번만 자른다. 또한 블레이드를 다시 밀어 시편 표면에 사용하지 않은 블레이드 부분을 조정합니다.
  8. 3.6단계와 3.7번 3.7번 을 반복합니다. 이것은 "칼 자국"없이 명확한 표면을 얻기위해 중요합니다 (그림 4).
  9. 최종 절단 후, 샘플에서 멀리 떨어진 블레이드의 위치를 설정하여 먼지가 시료에 달라붙지 않도록 합니다.
  10. 시편 홀더에서 척을 분리하고 날카로운 칼로 냉동 임베딩 매체를 제거하여 척에서 시편을 분리합니다. 서리 먼지에서 계획 된 표면을 방지하기 위해 시편이 저온 챔버에 배치되어 있는지 확인하십시오.
  11. 저온 막힘 챔버에 조직 동결 매질을 가진 저온 SEM 견본 홀더에 견본을 붙입니다.

4. 저온-SEM 표본 챔버로 전송

참고: 표면 제조 시편은 저온 극저온 챔버에서 극저온-SEM 시편 챔버의 관찰 단계로 이송되는 동안 온도 또는 서리축적의 증가로부터 보호되어야 합니다.

  1. 장비의 사용 설명서에 따라 LN 2를 사용하여 -120 °C 보다 낮은 저온-SEM 시편 챔버의 냉기 온도를 유지합니다.
  2. 준비된 시편이 있는 시편 홀더를 저온 유지 챔버에 LN 2로 채워진 절연 용기에 넣습니다.
  3. LN2아래에 시편 교환 막대가 있는 시편 홀더를 잡습니다. 가능하면 시편 홀더를 공기에 노출하지 마십시오.
  4. 시편 홀더를 극저온-SEM 시편 챔버의 사전 피난 챔버로 신속하게 설정하여 사전 피난 챔버의 피난을 시작하자마자. 그런 다음 공기가 완전히 배출된 후 시편 홀더를 차가운 단계에 놓습니다. 약간의 서리 축적이 불가피하지만 "동결 에칭"절차 (6 단계)는 이를 제거 할 수 있습니다.

5. SEM에서 설정

참고: 관찰에 대한 일반적인 설정은 아래에 설명되어 있습니다. 진공 상태 또는 전자 빔에 따라 일부 수정이 필요합니다.

  1. 관찰을 위한 SEM 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.
    가속 전압: 3-5 kV
    시편 단계의 온도: < -120 °C
    검출기: 이차 방출

6. 동결 에칭

참고 : 동결 에칭은 약간의 얼음 결정 승화에 의해 샘플의 세포벽의 가장자리를 강조하는 절차입니다. 동결 에칭은 또한 표면 서리 먼지를 제거하는 것을 포함한다.

  1. 동결 식각 중에 전기 건의 가속 전압을 켭니다. 시편을 관찰하는 동안 동결 식각을 수행하는 것이 좋습니다.
  2. 시편 단계의 온도를 -100 °C로 올립니다.
  3. 서리 먼지가 제거되고 자일렘 세포의 얼음 표면 수준이 세포벽에 비해 약간 감소 할 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
  4. 시편 단계의 온도를 -120 °C로 낮춥시됩니다.
    참고 : 시편 단계에 설치된 온도 컨트롤러가없는 경우 교환 막대를 사용하여 시편을 잡고 몇 분 동안 시편 단계에서 분리하십시오. 이 동결 식각 공정 중에 시편을 여러 번 관찰하여 시편의 승화 상태를 확인합니다.

7. 금속 코팅 (선택 사항)

참고: SEM 계측기 및 이미지 처리의 최근 개선은 금속 코팅없이 전기 절연 시편의 고품질 이미지를 제공 할 수 있습니다. 그러나 생물학적 물질과 같은 비전도성 표본은 때때로 전하의 대상이 됩니다. 전자의 축적으로 인해 시편의 특정 위치에서 더 높은 밝기 ("충전"). 시편을 전자 빔에 더 오랜 시간 동안 또는 높은 배율을 위해 노출하면 충전 효과가 증가합니다. 전도성 금속 재료로 시편의 표면을 코팅하면 충전이 발생하지 않습니다. 코팅 중에 시편의 온도가 상승하지 않도록 하기 위해 저온-SEM 장치에 설치된 진공 코팅 시스템을 사용합니다.

  1. 코팅 재료가 코팅 시스템의 지정된 증발기 헤드에 설치되어 있는지 확인하십시오.
  2. -170 °C 이하의 코팅 시스템에서 냉기의 온도를 유지합니다.
  3. 충분한 동결 식각 후 도료 시스템의 차가운 단계에 시편 홀더를 놓습니다.
  4. 차가운 스테이지와 증발기 헤드 사이의 파티션을 엽니다.
  5. 증발기 헤드의 전류 값과 전압 값을 각각 30mA 및 ca. 5V로 설정합니다.
  6. 시편의 표면을 코팅하기 위해 30s의 용 코팅 물질을 증발시.
  7. 증발기 헤드의 전류 및 전압 값을 모두 0으로 설정하고 파티션을 닫습니다.
  8. 관찰을 위해 시편 홀더를 시편 챔버의 차가운 단계에 놓습니다.

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Representative Results

극저온-SEM에 의해 관찰된 응비및 활엽수 자일렘의 가로 절단 표면의 대표적인 이미지는 그림2에 나와 있다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다(그림2A). 높은 배율에서, 물은 3개의 기관지의 루미나로부터 완전히 손실되지 않는 것이 명백하며, 이는 현장에서 자일렘 수액에서 매크로 기포의 발생을 나타낸다(그림2B). 광엽 종에 대하여, 캐비테이션 발생은 혈관 내에서 쉽게 검출되는 반면, 물의 존재는 섬유 내에서 구별하기 어려운 반면, 특히 낮은 배율에서 (그림2C). 실치마 세포에서의 세포질은 얼음 평야 질감을 통해 트라시드 또는 용기 내의 물과 구별될 수 있다(예를 들어, 도 2B).

동결 식각 공정에 대한 온도의 영향은 그림3에 나와 있습니다. 서리 먼지는 점차적으로 제거되고 온도가 증가함에 따라 승화의 진행을 통해 체내 구덩이 멤브레인이 명확해집니다. 남은 큰 서리 먼지 입자는 추가 동결 에칭에 의해 제거 될 수 있지만, 그것은 불필요하게 자일렘 도관에 얼음의 표면 수준을 감소로문제가 될 수 있습니다.

관찰의 높은 품질은 크게 정확한 표본 준비를 통해 달성된다; 특히 중요한 마이크로 토메의 날카로운 블레이드로 표면을 부드럽게하는 것입니다. 사용된 블레이드에 의한 스무딩이 부족하면 거친 표면("나이프 마크", 그림4)이라고 불리우거나 상처로 인한 수많은 먼지가 발생할 수 있습니다. 시편 표면을 신중하게 계획한 후, 시편 챔버로 시편을 빠르게 이송하는 것도 서리 형성으로 인한 오염을 제거하는 데 중요합니다.

음수 기둥 압력의 이완없이 시료 동결은 자일렘 도관에서 캐비테이션의실제 유도를 일으킬 것입니다 (그림 5). 클러스터된 얼음 결정은 샘플이 이완되지 않은 표본의 혈관에서 관찰되었다(그림 5A의 화살촉), 대조적으로, 유사한 물 전위를 가진 이완된 샘플 표본에서 클러스터된 얼음 결정이 관찰되지 않았다( 그림 5 B). 이것은 엽엽수(게시되지 않은 데이터)보다 넓은 잎이 많은 나무의 실렘에서 더 중요한 경향이 있습니다.

Figure 1
그림 1: 이 프로토콜의 회로도 차트입니다. 이 백서에 설명된 샘플링에서 SEM 관측값으로의 절차 흐름이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 혈관정자 및 체육관 나무 종의 가로 절단 표면의 예시 저온-SEM 현미경. 자일렘 세포의 회색 및 검정 영역은 각각 자일렘 세포의 물 기둥내의 물과 구멍에 해당한다. 샘플은 샘플 수집 전에 액체 질소로 동결 고정되었기 때문에, 냉동-SEM에 의한 이미지는 샘플링 순간에 식물의 물 상태와 기본 색전증을 보여줍니다. (A) 및 (B): 크립토 메리아 자포니카 (잠엽수 나무)의 성인 나무의 두 살 나뭇 가지. 나뭇가지의 직경은 3mm였고, 물 잠재력은 새벽 수확시 -0.39 MPa였습니다. (C): 카르피누스 tschonoskii (확산 다공성 나무) 모종의 두 살 촬영 (높이 1.4 m와 기초 직경 1.1 cm). 모종은 4 일 동안 관개의 장기간 제한에 따라 긴장 완화 절차 후 샘플링되었다. 물 전위는 장기간 가뭄 후 -1.78 MPa였고 긴장 완화 절차 후 -0.15 MPa였습니다. Tr: 기관, R: 광선 실치마, V: 용기, F: 섬유, AP: 축 실치마. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 차가운 시편 단계의 온도를 상승시킴으로써 해동 및 에칭 절차가 진행된다. 크립토 메리아 자포니카 나뭇 가지 (경미한 나무)의 자일렘의 횡절단 표면. 시편 단계의 감소 온도는 (A) -113.0 °C, (B) -105.3 °C, (C) -101.9 °C 및 (D) -99.7 °C입니다. 각 이미지는 차가운 시편 단계의 온도를 각각의 온도 값으로 설정한 후 약 5분 후에 얻어졌다. 스테이지의 온도가 약 -120 °C 이상으로 유지되면 얼음 승화가 진행됩니다(장비의 경우). Tr: 기관, B: 경계 구덩이 쌍, Pm: 피트 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 나이프 마크 예. 크립토 메리아 자포니카 나뭇 가지 (경엽수 나무)의 자일렘의 횡절단 표면은 소위 칼 자국을 보여주는. 화살촉과 파선은 전형적인 나이프 마크를 나타냅니다. 저온 극저온에 의해 시편의 표면을 지우는 것은 칼날의 사용되지 않는 부분에 의해 완료되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 도관에서 물 기둥 장력의 이완 효과의 예. 극저온-SEM에 의해 관찰된 카르피누스 초노스키이 모종(확산 다공성 목재)의 줄기의 횡절단 표면. 낮 동안물 잠재력은 두 모종에서 유사했다. 발생하는 묘목의 줄기는 그대로 동결(A)되었고, 다른 묘목의 줄기는 기존의 유압장력(B)의 이완 후 동결되었다. 수확시 (B)의 물 전위는 긴장-이완 절차 후 -0.5 MPa였다. 패널(A)의 화살촉은 용기 내에서 얼음 결정의 유물을 동결시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 백서에 소개된 극저온-SEM 관찰 방법은 세포 규모의 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 실용적입니다. 이 방법을 통해 자일렘 내의 물 분포의 변화를 탐구하는 것은 잠재적으로 비생물적 스트레스 (물 부족 또는 동결) 또는 생물학적 스트레스 (나무 질병)에 대한 수종 내성의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 가장 중요한 단계는 샘플 수집 및 후속 샘플 준비 중에 기본 물 상태의 물 분포 특성을 보존하는 것입니다. 긴 도관 (특히 고리 다공성 나무의 초기 목재 용기)가있는 종의 자일렘 조직은 수확 및 동결 중에 물을 쉽게 잃을 수 있습니다. Cochard et al. (2000)는 자일렘 도관38,41을따라 물 기둥의 높은 장력으로 인해 동결 유물을 논의하였다. 우메바야시 외(2016)는 비파괴 MRI 관측값39와비교하여 장력 완화 샘플의 저온-SEM 관측의 유효성을 확인하였다. 두 관찰 기법 모두 물 분포의 유사한 패턴을 보였다. 우리는 여전히 높은 유압 장력하에서 동결에 의해 유도 공기 항목에 대한 종 별 견고성을 확인해야하지만, 이완 절차는 물 분포의 신뢰할 수있는 추정을 제공하기 위해 실시되어야, 특히 물 스트레스 식물.

서리와 얼음 입자는 상세한 관찰에 중요한 장애물입니다. 서리 축적을 방지하기 위해, 시편은 저온-SEM 시편 챔버에 부착될 때까지 대기에 노출되어서는 안 된다. 시료를 시편 챔버로 이송하는 동안 대기에 대한 노출을 완전히 방지할 수는 없지만, 이송 시간은 짧아야 한다. 시편 홀더의 절연 이송 용기는 이슬 응결로에서 유래된 서리와 얼음을 방지하기 위해 시편 홀더와 LN 2를 제거한 후 잘 건조되어야 한다.

동결 식각에 대한 적절한 시간 길이는 사용되는 계측기의 성능에 따라 달라집니다. 이를 결정하는 중요한 요소는 시편 챔버내의 진공 수준과 시편 스테이지의 온도 제어기의 안정성입니다. 온도에 해당하는 승화의 정도는 주로 공식적인 사용 전에 평가되어야한다. 과도한 동결 에칭은 자일렘 도관에 있는 물의 존재를 감쇠시키고 특히 좁은 세포의 루미나에서 식별하기 어렵게 만듭니다.

동결, 수확 및 트리밍 절차 중에 파괴적인 샘플링 방법이 아티팩트 발생이 없도록 하기 위한 구체적인 단계와 노력이 필요합니다. 아티팩트의 발생의 중요성은 자주 지적되지만, 자일렘 도관에서 동결 아티팩트의 발생 정도는 충분히 검증되지 않은38,39. 비파괴 방법에 의한 추가 검증은 장력-이완 절차 및 동결-고정의 정확성을 확인하는 것이 바람직하다. 싱크로트론 기반 μCT 또는 MRI 시스템은 저온-SEM 시스템과 비교하여 식물-물 관계 연구에 충분히 널리 퍼지지 않았기 때문에, 상용 μCT 시스템의 적용은 아마도 저온-SEM 결과 42의 검증을 진행할 수있다. .

수액 플럭스, 줄기 세그먼트의 유압 전도도, 전도도 의 백분율 손실 (PLC) 또는 xylem 정전 용량과 같은 유압 나무 특성은 나무 물 사용 및 가뭄에 대한 저항의 추정을 제공합니다. 인위적 기후 변화로 인한 수분 스트레스 하에서 나무 생존을 예측하기위해서는 종 간의 물 사용 비교가 필요하다 2. Cryo-SEM 관측은 유압 기능 내에서 변화의 원인을 명확히하기 위한 해부학 적 지식을 제공하는 데 많은 장점이 있습니다. 식물 해부학 및 유압 연구의 파괴적 및 비파괴적 방법의 최근 개선은 함께 나무 물 사용의 본질에 대한 우리의 이해를 심화 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 JSPS KAKENHI (아니. 2012009, 20120010, 19780129, 2529210, 23780190, 237848022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H2025)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

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환경 과학 문제 148 저온 - SEM 저온 고정 정지 고정 긴장 완화 물 분배 자일렘 도관
극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포
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Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda,… More

Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

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