Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

وتوضح هذه الدراسة استخدام التدفق الخلوي للكشف عن إنتاج الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية الناجمة عن تفعيل FcγR. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم التغييرات في مضادات الميكروبات والأكسدة والاختزال مما يشير إلى وظيفة البالعات ردا على مجمعات محصنة، والكائنات المجهرية أوبسونيزيد، أو العابرة للربط FcγR مباشرة.

Abstract

انفجر الجهاز التنفسي أو الأكسدة المستخدمة في وصف الاستهلاك السريع للأوكسجين، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) البالعات في الاستجابة للمحفزات المناعية المختلفة. روس التي تم إنشاؤها أثناء عملية التنشيط المناعي تمارس نشاط مضادات الميكروبات القوية أساسا من خلال قدرة روس على إتلاف الحمض النووي والبروتينات، مما تسبب في وفاة من الكائنات الحية الدقيقة. أن تكون قادرة على قياس إنتاج روس تكاثر ومع سهولة ضروري من أجل تقييم إسهام مختلف المسارات والجزيئات إلى هذه الآلية للدفاع المضيف. في هذه الورقة، ونحن تثبت استخدام المسابير الفلورسنت والتدفق الخلوي للكشف عن إنتاج روس. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، قياس الفلورسنت من روس المعروف إشكالية، لا سيما فيما يتعلق بقياس روس الناجم عن حوافز محددة ولا ميتوجينيك. نقدم منهجية مفصلة للكشف عن روس المتولدة نتيجة تنشيط FcγR محددة بدءاً من جيل بلعم فتيلة وتلطيخ، FcγR العابرة للربط، وتنتهي مع تحليل تدفق سيتوميتريك.

Introduction

الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) هي جزيئات التفاعل أو الجذور الحرة التي هي الآثار الجانبية للتنفس الهوائي (استعرض في 1). وتشمل هذه انيون دسموتاز، بيروكسيد، بيروكسيد الهيدروجين، هيدروكسيل متطرفة، وأيونات الهيدروكسيل، بين أمور أخرى. الظروف الفسيولوجية العادية، تنتج أساسا من الميتوكوندريا ونيكوتيناميد الأدنين dinucleotide الفوسفات (NADPH) أوكسيداسيس روس وهي سرعة سميته بمختلف الإنزيمات والبروتينات مثل الفاءق دسموتاز والجلوتاثيون. يمكن أن يؤدي إنتاج مبالغ فيها من روس أو خلل في القدرة على إزالة روس الأكسدة، حيث تشجع الأنواع الأكسجين التفاعلية الضرر من البروتينات والدهون والحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد الخلوية أو الموت والمرض المرضية الدول. ومع ذلك، فإنه حاليا يقدر أن روس ويمكن أيضا بمثابة إشارات الجزيئات (إشارة الأكسدة والاختزال)، ويمكن أن تؤثر بوساطة روس تعديل مختلف الجزيئات والمواد الوسيطة المسار الأيض الخلوي، والانتشار، البقاء على قيد الحياة، التهاب إشارات، والشيخوخة2. روس في خلايا متجولة، دوراً أساسيا في توفير نشاط مضادات الميكروبات أثناء ما يسمى "انفجر الجهاز التنفسي"1،3،4،،من56. خلال استجابة البالعات للمنبهات الخارجية، ترانسلوكاتي مكونات أوكسيديز نادف المعقدة (p40phox, p47 بطاقات مجانيةphox، p67phox) من سيتوسول للغشاء فاجوسومال الذي يحتوي على gp91phox و p22phox الوحدات الفرعية، وجنبا إلى جنب مع إجراءات Rac1/2، تشكل إنزيم أوكسيديز نادف تعمل بكامل طاقتها معقدة. ثم يستخدم أوكسيديز نادف المجمعة نادف لتقليل الأكسجين إلى فائق أكسيد داخل المنقبضة فاجوسومال. فائق أكسيد الأنيونات مباشرة يمكن أن يسبب ضررا أو أن ديسموتاتيد إلى فوق أكسيد الهيدروجين. فائق أكسيد وفوق أكسيد الهيدروجين يمكن أن تتفاعل مع الجزيئات الأخرى لتوليد جذور الهيدروكسيل عالي التفاعل. هو وساطة الأضرار برد فعل هذه روس مع كتل الحديد-الكبريت في البروتينات أو بالتسبب في قاعدة أكسدة الحمض النووي، ويؤدي في النهاية إلى الأيض الميكروبي مقيد أو الموت ل ميكروب5. وتتجلى أهمية إنزيم أوكسيديز نادف المعقدة وروس أنتجت خلال انفجار الجهاز التنفسي سريرياً في المرضى الذين يعانون من المرض الحبيبي المزمن (رودمان)7،،من89، 10-تملك الأفراد مع رودمان الطفرات في gp91phox، أسفر عن نقص في إنتاج روس والقابلية للالتهابات المتكررة مع البكتيريا والفطريات التي ليست عادة اهتمام بالأفراد الأشخاص. ولذلك، ما إذا كانت دراسة يجري عنصر مؤكسد الإجهاد أو إشارة الأكسدة والاختزال أو الدفاع المضيف، قادرة على قياس إنتاج روس في الوقت الحقيقي مسعى مفيدة.

وقد استخدمت فحوصات متعددة لقياس إنتاج روس أو نتائج الأكسدة11،،من1213. ومن بين هذه، واحدة من الأكثر استخداماً هو مسبار فلورسنت 2 '، 7' ديتشلوروديهيدروفلوريسسين اسيتات (دكفه2-دا)14. هذا الجزيء عديم اللون ومحبتين. نشر دكفه2-دا عبر غشاء الخلية يسمح لها بأن تبت esterases داخل الخلايا، التي ديسيتيلاتيس إلى دكفه2، جعلها الخلية غير منفذة. الأعمال التي تقوم بها أنواع متعددة من روس (فوق أكسيد الهيدروجين، بيروكسينيتريتي وجذور الهيدروكسيل، وأكسيد النيتريك وأكسي الجذور) في دكفه2 أكسدة أنه في منتدى التعاون الإنمائي هو الفلورسنت (المبلغ عنها سابقا/م: 485-500 نانومتر/515-530 نانومتر) ويمكن الكشف عنها باستخدام تدفق سيتوميتير مجهزة بعامل تصفية قياسية المحددة ل fluorescein (قناة FL1). فائق أكسيد لا تتفاعل بشدة مع دكفه2 ولكن يمكن أن تتفاعل مع آخر مسبار ديهيدروثيديوم (DHE) أن تسفر عن المنتج فلورسنت 2-هيدروكسيثيديوم (فضلا عن سائر المنتجات الفلورسنت مستقلة عن فائق أكسيد الأكسدة)15. منتجات أكسدة DHE الفلورسنت يمكن الكشف عنها باستخدام الطول موجي إثارة 518 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 605 نانومتر (قناة FL2). على الرغم من أن بسيطة نسبيا لاستخدام والاستفادة من هذه التحقيقات للكشف عن روس يتطلب المعرفة بقصورها وإدماج حذراً من تلطيخ الإجراءات والضوابط في المقايسة محددة يجري تنفيذها لصالح التجريبية والنتائج والاستنتاجات. البروتوكول التالي يوضح استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً توظيف هذه المسابر 2 مصممة لقياس روس بالتدفق الخلوي. نحن وصمة عار معبي الضامة المشتقة من نخاع العظام بهذه التحقيقات والحث على إنتاج روس عن طريق FcγR العابرة للربط. يقدم الممثل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول، ونؤكد الاحتياطات الملائمة التي يتعين اتخاذها لإجراء التجارب الناجحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر البروتوكول للتعامل مع الحيوانات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة وسط فلوريدا.

1-جيل نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)

  1. إعداد وسائط الثقافة
    1. تحضير الوسائط الأساسية D10F: إضافة إلى تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو)، إبطال الحرارة 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وبيروفات صوديوم 1 مم، 10 مم 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك حامض (حبيس)، 0.05 مم β-ميركابتوثانول.
      ملاحظة: رغم أنه من الأفضل لاستخدام وسائط الإعلام D10F جديدة، D10F قاعدة وسائل الإعلام يمكن إعداد تصل إلى أسبوعين مقدما التي ستستخدم لإجراء تجارب متعددة في غضون أسبوع. للماوس واحد، هو حوالي 175 مل من D10F قاعدة الوسائط اللازمة (25 مل لمسح العظام) و 150 مل بلعم التمايز وسائل الإعلام
    2. إعداد وسائط النمو لادماك: إضافة الحد الأدنى الأساسية المتوسطة "إلى النسر" (اللور)، الحرارة 10% إبطال FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين. إعداد وسائط الإعلام الجديدة، في اليوم الذي كنت تخطط للبدء في الثقافات الخاصة بك.
      ملاحظة: سيؤدي إلى لتر واحد من وسائط النمو لادماك في حوالي الساعة (19) مختبرين 50 مل مكيفة لادماك وسائل الإعلام.
    3. تحضير الوسائط دميم كاملة: إضافة إلى دميم، الحرارة 10% إبطال FBS و 1 × مضاد حيوي فطري. إعداد وسائط الإعلام الجديدة، واليوم سوف تحصد بمدمس.
      ملاحظة: للماوس واحد، سوف تكون حوالي 100 مل من دميم الإعلامية الكاملة المطلوبة. وهذا يشمل الوسائط المستخدمة فتيلة الخلايا.
  2. إعداد لادماك مكيفة المتوسطة
    1. تنمو خلايا لادماك إلى كونفلوينسي في صحن 10 سم باستخدام 10 مل وسائط النمو لادماك (المعرفة في 1.1.2). احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2-
    2. في كونفلوينسي، فصل خلايا بقوة الاستغناء عن وسائل الإعلام عبر الخلايا. مرور الخلايا بإضافة 1 مل خلايا منفصلة في قوارير T-175 التي تحتوي على 100 مل وسائط النمو لادماك. احتضان الخلايا حتى المتلاقية تماما عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 (حوالي أسبوع واحد). وبهذه الطريقة، يمكن أن تسفر عن صحن واحد 10 سم T-175 عشر قوارير أو تقريبا 1 لتر من وسائل الإعلام مكيفة.
    3. بمجرد الخلايا على استعداد، جمع مكيفة وسائل الإعلام وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا غير المرغوب فيها. تصفية سوبيرناتانتس التي تم جمعها من خلال عامل تصفية 0.2 مم وتخزين 50 مل مختبرين في-80 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ مختبرين مكيفة لادماك وسائل الإعلام في-80 درجة مئوية لمدة أشهر مع فقدان الحد الأدنى من النشاط.
      ملاحظة: إذا كان يتوقع تجارب كبيرة، إعداد دفعات كبيرة من وسائل الإعلام لادماك مكيفة لضمان الاتساق في الوقت نفسه. إذا لم يكن هذا ممكناً، استخدام مختبرين مستمدة من نفس الدفعة أو الكثير من وسائل الإعلام لادماك مكيفة لكل تجربة.
  3. إعداد نخاع العظام المستمدة الضامة
    1. في يوم التجربة، تحضير الوسائط التمايز بلعم جديدة بإضافة 25 في المائة من وسائل الإعلام لادماك مكيفة في المعدة مسبقاً D10F وسائل الإعلام (الإعلام جزء لادماك مكيفة 1 إلى 3 أجزاء D10F). لم تعد هذه الوسائط مسبقاً! فقط تحضير الوسائط قدر حسب الحاجة لثقافة بمدم.
    2. يوم 1: عزل خلايا نخاع العظام الماوس وفقا للبروتوكول هو موضح سابقا16 مع تعديل تدفق نخاع العظام من قصبة وتيبياس باستخدام D10F قاعدة الوسائط. استخدام 2.5 مل من وسائل الإعلام D10F لمسح كل نهاية من العظام (4). مسح خلايا النخاع العظمى مباشرة في مصفاة خلية رطب قبل 40 ملم وضعت على رأس أنبوب 50 مل. يمكن استخدام وسائل الإعلام المتبقية (~ 5 مل) لغسل مصفاة الخلية.
    3. الطرد المركزي خلايا نخاع العظم التي تم جمعها في 350 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في ما مجموعة 30 مل بلعم التمايز وسائط (للماوس).
    4. إعداد وتسمية أطباق بتري معقمة 10 سم (6). لوحة 5 مل من بلعم التمايز الوسائط في كل منها إلى طبق بيتري. الكوة 5 مل من خلايا نخاع العظام حراكه في بلعم التمايز الوسائط داخل كل طبق بيتري لإجمالي حجم 10 مل كل طبق. احتضان لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية، 5% CO2-
    5. يوم 5: نضح وسائل الإعلام من الخلايا. أغسل مرة واحدة مع مل 1-2 من برنامج تلفزيوني وإضافة 10 مل الإعلام التمايز بلعم الطازجة. احتضان لمدة 3 أيام.
    6. يوم 8: متابعة لحصاد بمدمس كما هو موضح أدناه.

2-حصاد والبذر وفتيلة من بمدمس

  1. بعد 7 أيام من زراعة بمدمس في وسائل الإعلام التمايز بلعم، إزالة المادة طافية. أغسل الضامة ملتصقة مرة واحدة مع مل 1-2 من برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني.
  2. الاستغناء عن 1 مل من 0.25% التربسين-أدتا إلى بلعم كل لوحة وتركهم في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق مع التنصت المتكررة لفصل الخلايا. ننأى الضامة تريبسينيزيد من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام ماصة P1000 وجمع الضامة في أنابيب 50 مل تحتوي على 10-15 مل من وسائط الإعلام دميم كاملة. أغسل اللوحة مع 2 مل إضافية كاملة دميم وسائل الإعلام لحصاد أي الضامة المتبقية.
    تنبيه: لا تترك الضامة في التربسين لأكثر من 10 دقيقة.
  3. الطرد المركزي أنابيب 50 مل في 350 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية. بلطف ننأى ببيليه وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من وسائط الإعلام دميم كاملة. الضامة العد باستخدام هيموسيتوميتير حضور صلاحية صبغ مثل تريبان الأزرق على النحو التالي:
    1. على سبيل المثال، مزيج ميليلتر 90 من تريبان الأزرق مع 10 ميليلتر من الخلايا 01:10 إضعاف.
    2. هذا الخليط، تحميل 10 ميليلتر في هيموسيتوميتير والتعويل الساحة المركزية (شبكة 5 × 5). عدد الخلايا الإجمالي = عدد x 104 × إضعاف عامل x (10) الحجم (10 مل).
  4. ضبط تعليق خلية لتكون 1 مليون/مل في وسائط الإعلام دميم كاملة ولوحة 4 مل من هذا تعليق خلية في كل طبق 6 سم.
    ملاحظة: مطلوب الحد أدنى من 3 لوحات كل تجربة. سوف تكون لوحة واحدة من الخلايا أونستيمولاتيد اليسار وسوف تحفز مجموعة ثانية من الخلايا عن طريق العابرة للربط من FcγRs واللوحة الثالثة للخلايا وسوف يتم استخدامه لكافة الإضافي التجريبية وتدفق سيتوميتريك عناصر التحكم.
  5. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  6. وفي اليوم التالي نضح المادة طافية، يغسل خلايا مرة واحدة مع مل 1-2 من برنامج تلفزيوني. إضافة مل 4 كاملة الوسائط التي تحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر الماوس IFN-γ لكل لوحة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  7. إذا رغبت في ذلك، تأخذ قاسمة للخلايا لتقييم الجيل المناسب من بمدمس بالتدفق الخلوي. استخدم 1 × 106 خلايا كل اختبار وإعداد البوليستيرين نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب للشروط التالية: مراقبة ايستب، ملطخة F4/80 (أو الملون بدلاً من ذلك، مع CD11b).
  8. إعداد التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت عن طريق إضافة 0.1% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x. استخدام هذا المبلغ فقط من FBS حتى لا يؤدي إلى إبطال آثار المجاعة المصل في خطوات لاحقة.
  9. الكوة 1 × 106 خلايا كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 750 x ز لمدة 5 دقائق.
  10. أغسل مرة واحدة بالصب أو يسفط المادة طافية وريسوسبيندينج الخلايا في 2 مل من التدفق الخلوي المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ز لمدة 5 دقائق.
  11. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت. أضف 1 ميليلتر من الماوس المضادة "نادي" CD16/32 حظر جسم لكل أنبوبة. تبني على الجليد لمدة 5 دقائق.
  12. دون الغسيل، إضافة 2 ميليلتر من فيتك المضادة الماوس F4/80 أو 1 ميليلتر من جسم CD11b الماوس المضادة آسيا والمحيط الهادئ للأنابيب "الملون"، ومبلغ مماثل لجسم ايستب المقابلة على السيطرة على أنابيب "ايستب". تبني على الجليد، في الظلام، لمدة 30 دقيقة.
  13. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني مباشرة إلى الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ز لمدة 5 دقائق.
  14. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  15. الحصول على عينات في cytometer تدفق استخدام شرط توقف 100 ميليلتر أو أحداث 10,000 على باب الفائدة وضمان أن FL1 منتدى التعاون الأمني، التعاون بين بلدان الجنوب، (فيتك المضادة الماوس F4/80) أو FL4 (آسيا والمحيط الهادئ لمكافحة الماوس CD11b) القنوات المحددة للمعلمات ليتم تحليلها.
  16. استخدام برنامج التدفق الخلوي، فتح مؤامرة دوت لمنتدى التعاون الأمني (على المحور السيني) مقابل التعاون بين بلدان الجنوب (على المحور الصادي) ورسم بوابة حول الخلايا ذات الاهتمام، باستثناء الخلايا الميتة والحطام (الخلايا الميتة والحطام الأحداث أصغر بكثير من السكان الرئيسية الخلية وتظهر في لوي r ترك الأرض.)
  17. النابضة في الخلايا ذات الاهتمام، وفتح الرسم بياني مؤامرة مع FL1 (فيتك المضادة الماوس F4/80) أو FL4 (آسيا والمحيط الهادئ لمكافحة الماوس CD11b) على المحور س.
  18. تشغيل نموذج "ايستب". إنشاء بوابة علامة ذلك أن الغالبية العظمى من الأحداث نموذج "ايستب" إلى يسار البوابة (< 1% إيجابية). تطبيق هذا القالب على ملف عينة الملون.
  19. تشغيل العينة "الملون". سوف تسفر عن توليد ناجحة من بمدمس > التعبير 95% من فيتك المضادة F4/80 أو آسيا والمحيط الهادئ لمكافحة الماوس CD11b (الشكل 1A)، بينما قد تؤدي ظروف ثقافة غير صحيحة في جيل دون المستوى الأمثل من الضامة (الشكل 1B).
    ملاحظة: إذا كان توليد بمدمس من الأنماط الجينية متعددة، الإحاطة علما بالتعبير عن هذه العلامات لكل دفعة من بمدم المتولدة في هذه القضية أن هذه قد تكون أسباب استبعاد عينة من التحليل عند تقييم الجيل روس في الاستجابة للحوافز.

3-كاشف ومواد التحضير لقياس روس

  1. إعادة تشكيل الكاشف الكشف عن الأكسدة المجففة بالتبريد في 60 ميليلتر من DMF اللامائى تسفر عن حل أسهم 5 ملم. المزيج بلطف قبل الاستخدام.
    ملاحظة: يرد في دليل أدوات روس-معرف أن العمر الافتراضي للكاشف المعاد تشكيلها حوالي 1 أسبوع في-20 درجة مئوية. اليقوتينج كاشف فورا بعد إعادة تشكيل في قارورة صغيرة من واقية من الضوء يقلل من الأكسدة، ويزيد من مدة الصلاحية عند-20 درجة مئوية.
  2. إعادة تشكيل الكاشف الكشف عن فائق أكسيد المجففة بالتبريد في 60 ميليلتر من DMF اللامائى تسفر عن حل أسهم 5 ملم. المزيج بلطف قبل الاستخدام.
    تنبيه: كما ورد في دليل كيت، علاج كلا الكواشف الكشف والمطفرات ممكن، والتعامل مع كل الرعاية، والتصرف فيها بشكل صحيح.
  3. إعادة تشكيل محفز روس (بيوسيانين) في 20 ميليلتر من DMF اللامائى تسفر عن حل أسهم 50 مم.
  4. إعادة تشكيل "المانع روس" (ن-أسيتيل-L-سيستين) في 123 ميليلتر من المياه تؤتي بتركيز 0.5 م أسهم.
  5. قم بتسمية 5 مل جولة البوليستيرين الأنابيب (أنابيب التدفق الخلوي) مع عناصر تجريبية والظروف. (انظر 4. فحص الشروط والضوابط)
  6. يعد المصل منخفضة دميم (لا أحمر الفينول) عن طريق إضافة 0.1% FBS دميم خالية من الفينول الحمراء.
  7. قاسمة الأجسام المضادة-جيش صرب البوسنة إلى مختبرين صغيرة (حسب الاستخدام) وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  8. إعداد حل الأسهم 100 مغ/مل جيش صرب البوسنة في حبس (هانكس متوازنة الحل الملح) أو برنامج تلفزيوني. قاسمة إلى 100 ميليلتر مختبرين ومخزن في-20 درجة مئوية.
  9. تعد حلاً 2 x من المسابر روس (2 × الحل مسبار): لكل 10 مل من المصل منخفضة دميم، إضافة 4 ميليلتر للأكسدة الكشف عن الكاشف (الصبغة الخضراء) و 4 ميليلتر من أكسيد فائق الكشف عن الكاشف (صبغ برتقالي).
  10. إعداد 2 × حلول التحقيق تتضمن فقط الأكسدة الكشف عن الكاشف (2 × الحل المسبار، الأخضر فقط)، أو التي تحتوي على فقط فائق أكسيد الكشف عن الكاشف (2 × الحل المسبار، أورانج فقط). إعداد فقط مقدار كاشف اللازمة للتجربة وإعداد دائماً الحل 2 x مباشرة قبل استخدامها.
    ملاحظة: لإعداد كميات أصغر من 2 × الكشف عن الحل، استخدام وسيطة 01:10 إضعاف الكواشف كشف الأخضر والبرتقالي قبل النهائي تمييع في دميم. على سبيل المثال، إعداد 1 مل 2 × الكشف عن الحل، تمييع 1 ميليلتر من كل مسبار إلى 9 ميليلتر من دميم (01:10 إضعاف المتوسط). تمييع 4 ميليلتر من هذا المتوسط 01:10 إضعاف إلى 1 مل من دميم.

4-الاعتداء على الشروط والضوابط

  1. تتضمن عناصر التحكم التالية التجريبية لتدفق سيتوميتريك التعويض لكل تجربة:
    أ) الخلايا أونستينيد وأونستيمولاتيد.
    ب) الخلايا الملون فقط مع الكاشف الكشف عن الأكسدة (كاشف الأخضر) وتعامل مع روس محفز.
    ج) خلايا الملون فقط مع فائق أكسيد الكشف عن الكاشف (كاشف البرتقالي) وتعامل مع روس محفز.
  2. لكل الماوس أو تكرار البيولوجية، وتشمل 6 الشروط التالية:
    أ) الخلايا أونستينيد وأونستيمولاتيد
    ب) خلايا الملون وأونستيمولاتيد
    ج) الملون الخلايا تعامل مع محفز إيجابي
    د) الملون الخلايا تعامل مع محفز إيجابي ومثبط روس
    ه) خلايا الملون تفعيلها من خلال FcγR العابرة للربط
    و) الخلايا الملون تفعيلها من خلال FcγR العابرة للربط والتعامل مع مثبط روس
  3. حساب مقدار 2 × الحل التحقيق اللازمة استناداً إلى العدد من الفئران والشروط (ستستخدم ميليلتر 200 2 × مسبار الحل لكل حالة تتطلب تلطيخ).
    ملاحظة: لفحص استخدام الفئران 6، سيلزم 5 الظروف التي تتطلب تلطيخ إجراء تحقيقات في الماوس. وبذلك يرتفع العدد الإجمالي للظروف إلى 30. وبالتالي، من مبلغ إجمالي قدرة 2 x مسبار الحل اللازم على الأقل 6 مل (30 * 200 ميليلتر).

5. إعداد الخلية

  1. بعد فتيلة الضامة بين عشية وضحاها، ونضح المادة طافية. تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  2. مصل تجويع الخلايا بالاستعاضة عن وسائل الإعلام بنفس الحجم من المصل منخفضة دميم. لكل الماوس، لوحة واحدة سوف يعامل مع مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1 بينما المصل يتضورون جوعاً، بينما الأخرى سيتم ترك دون علاج. إضافة فقط انخفاض مصل دميم للوحات غير المعالجة. إضافة المصل منخفضة دميم تحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل من مفتش مكافحة-جيش صرب البوسنة مورين1 إلى ألواح المعالجة.
    ملاحظة: مطلوب لوحة غير المعالجة إضافية واحدة لكل تجربة لتعويض سيتوميتريك تدفق عناصر التحكم.
  3. احتضان لوحات لح 4 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  4. بعد المصل يتضورون جوعاً، حصاد الخلايا بإلغاء لطيف أو بواسطة استخدام 0.2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني. جمع لهم في المسمى 5 مل جولة أسفل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لهم في 750 x ز 5 كحد أدنى للاحتفاظ بتعقب من الخلايا التي كانت تعامل مع مورين مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1.
  5. تغسل الكريات الخلية مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني للتخلص من أي بقايا مكافحة-جيش صرب البوسنة من الخلايا المعالجة.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 600 ميليلتر من المصل منخفضة دميم.
  7. من تعليق خلية 600 ميليلتر، الكوة ميليلتر 200 إلى 5 مل المسمى قبل الجولة أنابيب أسفل كما يلي:
    1. من الخلايا غير المعالجة، وتأخذ 200 ميليلتر لأنابيب المسمى "أونستيمولاتيد"، 200 ميليلتر لأنابيب المسمى "محفز إيجابي" و 200 ميليلتر لأنابيب المسمى "محفز إيجابي + المانع"
    2. من مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1 الخلايا المعالجة، تأخذ 200 ميليلتر لأنابيب المسمى "FcγR كروسلينكينج/FcγR XL" و 200 ميليلتر لأنابيب المسمى "FcγR XL + المانع"
    3. من الخلايا غير المعالجة التي ستستخدم لضوابط التعويض، تأخذ 200 ميليلتر للأنبوب المسمى "أونستينيد أونستيمولاتيد"، 200 ميليلتر لل "الأخضر + محفز" التحكم في عنصر التحكم و 200 ميليلتر "أورانج + محفز".
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا من 5.7.1 و 5.7.3 مستمدة من الماوس نفسها، يمكن استخدام الخلايا نفسه "أونستينيد أونستيمولاتيد" لعنصر التحكم التجريبية والتعويض. أن لم يكن ذلك، ستكون هناك حاجة ميليلتر 200 إضافية من الخلايا لعنصر تحكم تجريبية "أونستينيد أونستيمولاتيد").
  8. إبقاء هذه الأنابيب على الجليد حتى تلطيخ والتحفيز. أثناء المجاعة المصل والملزمة لمفتش1، إعداد تحقيقات وحوافز محددة، والحمام كما هو مبين أدناه.
    ملاحظة: إذا كان إجراء الفحص للمرة الأولى، إذا لم يتوفر أي قالب، أو أي تعويض بعد حقيقة متوفرة على تدفق سيتوميتير والبرامج المناظرة، تحفيز ووصمة عار ضوابط التعويض وتشغيل هذه على سيتوميتير تدفق لأداء دليل التعويض قبل الإضافة من المحفزات للعينات التجريبية.

6-القيام الفحص

  1. إعداد 2 × حل إيجابي محفز بتمييع بيوسيانين 1: 100 في 2 × الحل مسبار (إعدادها في الخطوة 3، 9) للحصول على تركيز 2 x من 500 ميكرون من بيوسيانين (التركيز النهائي سيكون 250 ميكرومتر). أيضا، يؤدي إلى تمييع بيوسيانين 1: 100 في كل من 2 × الحل المسبار، الخضراء فقط "وأنابيب" x 2 مسبار الحل، أورانج فقط "أعد في 3.10.
    ملاحظة: سيتم معاملة كل الشروط المسمى مع "محفز إيجابي" و "محفز إيجابي + المانع" مع محفز إيجابي. خطة تبعاً لذلك عند حساب مبلغ حل محفز إيجابي x 2 لإعداد. فعلى سبيل المثال: إذا كان أداء الفحص مع الفئران 3، 6 شروط (3 * 2) سوف تعامل مع محفز إيجابي، حتى إعداد ميليلتر 6 * 200 = 1.2 مل 2 × حل إيجابي محفز.
  2. إعداد 2 × حل جيش صرب البوسنة بتمييع الحل الأسهم جيش صرب البوسنة في 2 × الحل مسبار للحصول على تركيز 2 ميكروغرام/مل (التركيز النهائي سيكون 1 ميكروغرام/مل).
    ملاحظة: سيتم معاملة كل الشروط المسمى مع "FcγR XL" و "FcγR XL + المانع" مع 2 x حل جيش صرب البوسنة. خطة تبعاً لذلك عند حساب مبلغ الحل للتحضير. فعلى سبيل المثال: إذا كان إجراء الفحص استخدام الفئران 3، 6 (3 * 2) سيتم التعامل مع الظروف بحل جيش صرب البوسنة، وحتى 6 * 200 ميليلتر أو سيلزم 1.2 مل 2 × حل جيش صرب البوسنة.
  3. قبل البدء في حفز محددة (FcγR كروسلينكينج)، تأكد من أن كافة الكواشف والخلايا على استعداد. وضع الأنابيب على الجليد في النظام سوف تكون حفز.
  4. لتدفق سيتوميتيرس مع أوتوسامبلير، أن تحيط علما بالوقت الذي تستغرقه سيتوميتير لتحليل عينة واحدة والانتقال إلى المرحلة التالية، بما في ذلك أي خلط ومسبار الغسيل الخطوات (على سبيل المثال 3.5 دقيقة).
    ملاحظة: توقيت حرج للغاية لهذا التحليل. ولكل حالة التحكم بشكل جيد، يحتاج التحفيز أن ينفذ في الوقت المحدد (30 دقيقة) لكل حالة. تنشيط الخلايا في ترتيب وإدراج الوقت الفارق بين نموذج اكتساب cytometer تدفق. على سبيل المثال، إذا كان الوقت اللازم سيتوميتير لتحليل عينة واحدة والانتقال إلى التالي 3.5 دقيقة، تحفز الخلايا في النظام سيتم تحليل كل 3.5 دقيقة.
  5. إذا كان أداء التعويض اليدوية عند هذه النقطة، حفز أنابيب التحكم تستخدم للتعويض (الخطوة 5.7.3). إضافة 200 ميليلتر من 2 × الحل المسبار، الخضراء فقط "يحتوي على محفز (من 6.1) في الأنابيب تم وضع علامة" الأخضر + محفز "(الخطوة 5.7.3). إضافة 200 ميليلتر من "2 × الحل المسبار، أورانج فقط" يحتوي على محفز (الخطوة 6.1) في الأنابيب تم وضع علامة "أورانج + محفز" (الخطوة 5.7.3).
  6. احتضان الخلايا 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2 في الظلام.
  7. استخدام البرمجيات التدفق الخلوي، إنشاء وتسمية 3 ملفات العينة عنصر التحكم "أونستينيد، دون علاج"، "الخضراء + محفز"، و "أورانج + محفز" عينات، مع التأكد من تشير إلى القنوات/المعلمات ليتم تحليلها (منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، FL1، FL2) والمطلوب وقف الشروط (100 ميليلتر، 3 دقيقة، إلخ.). إنشاء وتسمية مجموعة مماثلة من الملفات للعينات التجريبية.
  8. تشغيل نموذج "أونستينيد، غير المعالجة". فتح مؤامرة دوت لمنتدى التعاون الأمني (على المحور السيني) مقابل التعاون بين بلدان الجنوب (على المحور الصادي) ورسم بوابة حول الخلايا ذات الاهتمام، باستثناء الخلايا الميتة والحطام (الخلايا الميتة والحطام الأحداث أصغر بكثير من السكان الرئيسية الخلية وتظهر في الزاوية اليسرى السفلي من الأرض).
  9. باستخدام هذه البوابة "خلايا"، افتح آخر قطعة دوت FL1 المحور (س) مقابل FL2 المحور (ص). رسم بوابة رباعي أولية. ضبط بوابات رباعي، حيث تظهر الأحداث في الربع الأيسر السفلي من الأرض مقابل FL2 FL1.
  10. تشغيل العينة "الأخضر + محفز". ضبط الجهد كي تظهر الأحداث في الأرباع اليمنى واليسرى السفلي من الأرض مقابل FL2 FL1. تنطبق هذه المصفوفة التعويض لجميع ملفات عينة 3.
  11. تشغيل العينة "أورانج + محفز". ضبط الجهد كي تظهر الأحداث في الطبقتين العليا والسفلي تركت الأرباع الأرض مقابل FL2 FL1. تنطبق هذه المصفوفة التعويض لجميع ملفات عينة 3.
  12. التحقق من كل ملف التعويضات، وضمان أن تظهر الأحداث "أونستاينيد، دون علاج" في الربع الأيسر السفلي، تظهر الأحداث "الأخضر + محفز" في الأرباع السفلي الأيسر والأيمن، وتظهر الأحداث "أورانج + محفز" العلوي والسفلي تركت الأرباع مقابل FL1 FL2 الأرض. تطبيق مصفوفة التعويض لكافة ملفات العينة التجريبية.
    1. ضمان تطبيق تعويض مناسب لجميع ملفات العينة التحكم قبل تطبيق مصفوفة التعويض لكل من ملفات العينة التجريبية. الرجوع إلى الرقم 2 لبيانات تمثيلية توضح دون تعويض وعينات تعوض بشكل صحيح.
      ملاحظة: تعيين العديد من سيتوميتيرس FL1 كقناة فيتك/التجارة والنقل (متحمس بالليزر 488 نانومتر الأزرق، والكشف عن مجموعة تصفية 530/30) القياسية و FL2 كقناة PE القياسية (متحمس بالليزر 488 نانومتر الأزرق، والكشف عن مجموعة تصفية 585/40). نحن نستخدم هذه الاتفاقية نفسها لكن تنبيه جديد التدفق الخلوي المستخدمين للتشاور مع مديرهم الأساسية التدفق الخلوي لضمان أن يتم تكوين سيتوميتير المثل وأن يتم استخدام القنوات المناسبة للكشف عن هذه التحقيقات. اعتماداً على نموذج التدفق سيتوميتير والمصاحبة للبرنامج، قد يكون من الممكن القيام بالتعويض قبل أو بعد أن تم الحصول عليها من عينات. إذا كان التعويض بعد حقيقة الممكن، يمكن إجراء الخطوة التعويض بعد قد اكتسبت جميع العينات التجريبية قبل سيتوميتير. سيتوميتيرس مع مجموعة ديناميكية، حيث PMT الجهد التعديلات غير مطلوبة، ويمكن أيضا إجراء تجربة تعويض في يوم منفصل ويمكن حفظ القالب التجريبية (بما في ذلك مصفوفة التعويض) لتقليل الوقت اللازم لإجراء دليل التعويض.
  13. مرة واحدة تم أداؤه التعويض اليدوي ويتم الحصول على نموذج تجريبي، بدء العلاج للعينات التجريبية. قبل التعامل مع محفز إيجابي أو تنشيط الخلية FcγR، مارك الأنابيب التي تحصل على المانع روس. علاج هذه الخلايا مع مين مثبط على الأقل 30 روس قبل محفز إيجابي أو التحفيز FcγR.
  14. لإضافة مثبطات روس، إعداد تركيز نهائي من 5 ملم بإضافة 1 ميليلتر للمانع إلى 200 ميليلتر من حراكه الخلايا (بدون مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1).
  15. علاج الخلايا مع التحفيز (أو محفز إيجابي)، وتحميل الخلايا مع تحقيقات روس كما يلي:
    1. للخلايا أونستيمولاتيد: إضافة 200 ميليلتر من 2 × الحل التحقيق دون أي حافز إلى 200 ميليلتر من تعليق خلية المسمى "الملون، أونستيمولاتيد".
    2. لعناصر إيجابية: إضافة 200 ميليلتر من 2 × حل إيجابي محفز (إعدادها في الخطوة 6، 1) إلى 200 ميليلتر من تعليق خلية المسمى "محفز إيجابي" أو "محفز إيجابي + المانع".
    3. للخلايا التي تحفزها FcγR العابرة للربط (محددة التحفيز): إضافة 200 ميليلتر من 2 × حل جيش صرب البوسنة (أعدت في 6-2) إلى 200 ميليلتر من تعليق خلية المسمى "Fcγr XL" أو "FcγR XL + المانع".
      ملاحظة: تذكر لإدراج الوقت الفاصل بين تحليل العينة بإضافة حافز كل دقيقة x حيث x هو الوقت الفاصل بين الحصول على عينة واحدة والتي تليها.
  16. احتضان الخلايا 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2 في الظلام. تحليل العينات في النظام كانوا حفز استخدام cytometer تدفق مجهزة أوتوسامبلير. استخدام تحليل القوالب التي تم إنشاؤها أثناء الخطوات الأولى التعويض. عدم غسل الخلايا قبل التحليل.

7-التدفق الخلوي تحليل البيانات والنتائج المتوقعة

  1. داخل البرنامج التدفق الخلوي، بفتح الملفات التي تم إنشاؤها مسبقاً تحليل للعينات التجريبية (قوالب تم إنشاؤها في الخطوات 6.7 6.12 وعينات تم تشغيلها في خطوة 6.16). ضمان أن مصفوفة التعويض من أداء التعويض اليدوي تم تطبيقها بشكل صحيح على العينات التجريبية.
    ملاحظة: لتدفق سيتوميتيرس والتدفق الخلوي برمجيات قادرة على تعويض بعد حقيقة، إذا لم يطبق مصفوفة التعويض مسبقاً على ملفات العينة التجريبية، تطبيقه في هذه المرحلة.
  2. مشابهة للتحقق من تعويض الدليل الصحيح، التأكد من أن عناصر التحكم داخل العينات التجريبية التي تتصرف كما هو متوقع.
    1. التأكد من أن الأحداث "أونستينيد، وغير المعالجة" ستظهر في الربع الأيسر السفلي FL1 مقابل FL2 الأرض، أن أحداث "محفز إيجابي" إظهار fluorescence زيادة في أعلى اليسار، الأعلى الحق، وأقل الأرباع حق الأرض FL2 مقابل FL1، وأن " محفز إيجابي + مثبط روس "الأحداث تشير إلى انخفاض في الأسفار في أعلى اليسار، الأعلى الحق، وأدنى الأرباع الحق مقابل FL1 FL2 الأرض مقارنة بالأسفار لوحظت مع العينة" محفز إيجابي ".
    2. إذا لا تظهر عناصر التحكم داخل العينات التجريبية أي زيادة الأسفار، تحقق من أنه تم تنفيذ كافة الخطوات الفحص والتحقق منها الجيل المناسب وفتيلة المشتقة من نخاع العظم الضامة (2.7-2.19)، وتكرار التجربة. إذا كانت عناصر التحكم داخل العينات التجريبية التي تبين الاتجاهات المتوقعة، المضي قدما إلى تحليل العينات التجريبية حفز من خلال FcγR (الشكل 3A).
  3. تحقق من أن حافز FcγR محددة تعمل على نحو ملائم. تشغيل نماذج التالية من ماوس WT C57BL/6J: "أونستينيد، أونستيمولاتيد"، "الملون، أونستيمولاتيد"، "الملون، حفز من خلال FcγR"، و "الملون، وتحفيز من خلال FcγR + روس المانع". وهذه تناظر عينات 4.2 a، 4.2 b، 4.2e، و 4.2f في القسم 4، على التوالي.
    1. التأكد من أن الأحداث "أونستينيد، أونستيمولاتيد" التي ستظهر في الربع الأيسر السفلي من الأرض مقابل FL2 FL1، أن الأحداث "الملون، أونستيمولاتيد" ستظهر أيضا في الربع الأيسر السفلي من الأرض مقابل FL2 FL1، أن الأحداث "الملون، وتحفيز من خلال FcγR" إظهار fluorescence زيادة في أعلى اليسار، الأعلى الحق، وأدنى الأرباع حق الأرض مقابل FL2 FL1، وأن "الملون، وتحفيز من خلال FcγR + روس المانع" سوف تظهر الأحداث انخفض fluorescence في أعلى اليسار، أعلى اليمين وأسفل اليمين أرباع الدائرة الأرض FL2 مقابل FL1 مقارنة بالعينة "الملون، وحفز من خلال FcγR" (الشكل 3A).
    2. إذا لم يتم الوفاء بهذه التوقعات، على سبيل المثال، يبين نموذج "الملون، وتحفز من خلال FcγR" الحد الأدنى أو لا الأسفار زيادة بالمقارنة مع العينة "الملون، أونستيمولاتيد" أو نموذج "الملون، أونستيمولاتيد" الفعل يظهر ملحوظا زيادة مستويات fluorescence مقارنة بالعينة "أونستينيد، أونستيمولاتيد"، تحقق من أنه تم تنفيذ كافة المقايسة الخطوات بشكل صحيح والتحقق منها الجيل المناسب، فتيلة، والتعامل مع بمدمس (2.7-2.19)، وتكرار التجربة. إذا تم الوفاء بهذه التوقعات، المضي قدما في تحليل بقية العينات التجريبية.
      ملاحظة: سوف تظهر في الجزء العلوي من حق خلايا إنتاج روس التي تتفاعل مع التحقيق الأخضر (فوق أكسيد الهيدروجين، بيروكسينيتريتي، وجذور الهيدروكسيل، وأكسيد النيتريك، الجذور أكسي، إلخ) وأقل الأرباع الحق من سجل FL1 المحور (س) مقابل سجل FL2 مؤامرة نقطة المحور (ص). خلايا إنتاج روس التي تتفاعل مع المسبار البرتقالي (إلى حد كبير ولكن ليس على سبيل الحصر فائق أكسيد) سوف تظهر في الأرباع العلوي اثنين من سجل FL1 المحور (س) مقابل سجل FL2 مؤامرة نقطة المحور (ص).
  4. إنشاء رسوم بيانية فردية، عن طريق بوابة على الخلايا ذات الاهتمام، بتحليل للأسفار FL1 و FL2. باستخدام عينات "أونستينيد، أونستيمولاتيد"، إنشاء علامة الرسم بياني أن تظهر كافة الأحداث "أونستينيد، أونستيمولاتيد" إلى يمين هذه العلامة. تنطبق هذه المؤامرة مع العلامة على بقية العينات التجريبية (الشكل 3B).
  5. تقديم نتائج التجربة بالنسبة المئوية للخلايا إيجابية لكل من المسابر روس أو بإظهار كثافة fluorescence يعني (MFI) من العينات التي حفزت مقابل السيطرة (الشكل 3).

8-خلية تلطيخ السطحية في تركيبة مع تحليل سيتوميتريك تدفق الإنتاج روس (اختياري)

ملاحظة: هذه الخطوة يوفر بروتوكول لتلطيخ الضامة مع علامة سطح الخلية قبل التحفيز لقياس FcγR وروس. قد يكون هذا مفيداً في تقييم إنتاج روس في الخلايا المختلطة السكان. من المهم أن تختار جسم مضاد لعلامة بلعم سطحي مترافق فلور مناسبة التي لا تتداخل مع الأسفار من الكواشف الكشف عن عنصر مؤكسد الإجهاد أو أكسيد فائق. في هذا البروتوكول، ويتم استخدام جسم مضاد للماوس مترافق F4/80 إلى أليكسا فلور 647.

  1. إنشاء بمدمس والحصاد ورئيس الوزراء لهم كما هو موضح سابقا (المادتان 1 و 2).
    ملاحظة: هناك حاجة على الأقل ثلاثة سم 6 لوحات من أجل تنفيذ جميع عناصر تجريبية والشروط كما هو موضح أدناه. سوف يعامل لوحة واحدة مع مكافحة-جيش صرب البوسنة مفتش1 بينما المصل يتضورون جوعاً بينما لوحات اثنين آخرين سيتم ترك دون علاج.
    1. 4 ضوابط التجريبية التي سيتم استخدامها لتدفق سيتوميتريك التعويض (كل تجربة) تشمل ما يلي:
      أ) الخلايا أونستينيد وأونستيمولاتيد.
      ب) الخلايا تعامل مع الأكسدة الكشف عن الكاشف (كاشف الأخضر) ومحفِّز روس.
      ج) الخلايا تعامل مع فائق أكسيد الكشف عن الكاشف (كاشف البرتقالي) ومحفِّز روس.
      د) الخلايا الملون فقط مع الماوس المضادة مترافق F4/80 إلى 647 أليكسا.
    2. لكل الماوس أو تكرار البيولوجية، تشمل 3 الشروط التالية:
      أ) الملون مع F4/80 واليسار أونستيمولاتيد
      ب) الملون مع F4/80 وتفعيلها من خلال FcγR
      ج) الملون مع F4/80 وتفعيلها من خلال FcγR وتعامل مع مثبط روس
  2. بعد فتيلة الضامة بين عشية وضحاها، ونضح المادة طافية. تغسل الخلايا مرة واحدة مع مل 1-2 من برنامج تلفزيوني. مصل تجويع الخلايا عن طريق استبدال وسائط الإعلام بنفس الحجم من المصل منخفضة دميم. لكل الماوس، سيتم التعامل مع لوحة واحدة مع مكافحة-جيش صرب البوسنة مفتش1 بينما المصل يتضورون جوعاً، بينما الآخران اللوحات سوف يكون تركت دون علاج. احتضان لوحات لح 4 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  3. بعد المصل يتضورون جوعاً، حصاد الخلايا بإلغاء لطيف أو بواسطة استخدام 0.2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني. جمع كل لوحة في المسمى 5 مل جولة أسفل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لهم في 750 x ز 5 كحد أدنى للاحتفاظ بتعقب من الخلايا التي كانت تعامل مع مورين مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1.
  4. تغسل الكريات الخلية مرة واحدة مع مل 1-2 من برنامج تلفزيوني للتخلص من أي بقايا مكافحة-جيش صرب البوسنة من الخلايا المعالجة.
  5. ريسوسبيند واحد من الكريات الخلية من اللوحة التي لم تحصل على مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1 في 600 ميليلتر من المصل منخفضة دميم. هذه الخلايا سوف لا يتعرض لتلطيخ الخلايا السطحية. استخدم هذه لضوابط التعويض. الكوة 200 ميليلتر من هذا تعليق خلية في (3) 5 مل الجولة أسفل الأنابيب المسماة أ) أونستينيد، أونستيمولاتيد الأكسدة ب) الأخضر كاشف + محفز روس، دِيسمُوتاز ج) البرتقالي الكشف عن كاشف + محفز روس.
  6. ريسوسبيند واحد من الخلية الكريات من اللوحة التي لم تحصل على مكافحة-جيش صرب البوسنة مفتش1، في 300 ميليلتر من التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.1% FBS). الكوة ميليلتر 100 من هذا تعليق خلية في (2) 5 مل الجولة أسفل أنابيب لتلطيخ مع الماوس المضادة 647 أليكسا F4/80.
  7. ريسوسبيند الكريات الخلية من اللوحة التي تلقت مفتش مكافحة جيش صرب البوسنة1 في 300 ميليلتر من التدفق الخلوي المصبوغة المخزن المؤقت. الكوة ميليلتر 100 من هذا تعليق خلية في (2) 5 مل الجولة أسفل أنابيب لتلطيخ مع الماوس المضادة 647 أليكسا F4/80.
  8. وصمة عار في الخلايا، والتي كانت الكوتيد في 8.6 و 8.7، مع 5 ميليلتر من الماوس F4/80 647 أليكسا المضادة مدة 30 دقيقة على الجليد، وفي الظلام.
  9. بعد تلطيخ، غسل الخلايا بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 750 س ز، نضح المادة طافية، وريسوسبيند كل أنبوبة في 200 ميليلتر من المصل منخفضة دميم دون الأحمر الفينول. جانبا أنبوب علاج واحد ليكون بمثابة منفردة ملطخة FL4 التحكم. إعداد تحقيقات ومحفِّز والتحفيز FcγR ومثبطات روس كما هو مبين في أقسام 3.9 3، 10، 6، 1، 6.2, و 6.14.
    1. للخلايا التي لا تلقي المضادة-جيش صرب البوسنة مفتش1، قم بتسمية أنابيب بما يلي:) لا يوجد حافز أو محفز ب) روس.
    2. تسمية للخلايا التي تلقت المضادة-جيش صرب البوسنة مفتش1، بما يلي:) Fc XL أو XL ب) نادي + مثبط.
  10. حفز العينات التي ستستخدم للتعويض وفقا لتلك العلاجات الخاصة بكل منها كما هو مبين في 6، 5-6-6، بالترتيب الذي سوف يقرأون في سيتوميتير التدفق، إدماج الفارق الزمني بين الحصول على عينة واحدة والقادم.
  11. احتضان الخلايا 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2 في الظلام. تحليل العينات في النظام كانوا حفز استخدام cytometer تدفق مجهزة أوتوسامبلير.
  12. أداء التعويض يدوياً كما هو موضح في 6.7-6.12 وتحليل البيانات كما هو موضح في القسم 7.
  13. استخدام برنامج التدفق الخلوي، إنشاء وتسمية ملفات العينة 4 لعنصر التحكم "أونستينيد، دون علاج"، "الأخضر + محفز"، "أورانج + محفز" و "F4/80 الملون" عينات، التأكد للإشارة إلى القنوات/المعلمات ليتم تحليلها (منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، FL1، FL2، FL4) والشروط المطلوب إيقاف (100 ميليلتر، 3 دقيقة، إلخ.).
  14. تشغيل العينات وتوليد المؤامرات دوت لأداء التعويضات اليدوي.
    1. لتلوين سطح الخلية، تولد قطعتي إضافية: FL1 (س) مقابل FL4 المحور (ص) و FL2 (س) مقابل FL4 المحور (ص). ضبط الفولتية ضمان تطبيق التعويض المناسب كما هو موضح في الشكل 7 ألف. مرة واحدة وقد أجريت جميع التعويضات بشكل صحيح، تطبيق مصفوفة التعويض لكافة ملفات العينة التجريبية.
  15. مرة واحدة تم أداؤه التعويض اليدوي ويتم الحصول على نموذج تجريبي، بدء علاج عينات التجريبية كما هو مبين في 6.13 6.15.3 والحصول على عينات في سيتوميتير تدفق كما هو موضح في 6.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام البروتوكول الواردة ضمن، نقدم بيانات تمثيلية مما يدل على تدفق سيتوميتريك الكشف عن إنتاج روس الناتجة عن تحفيز WT C57BL/6J بمدمس من خلال FcγR. كما هو متوقع، نلاحظ تغيرات طفيفة في الأسفار FL1 أو FL2 فوق مستويات الخلفية في الخلايا أونستيمولاتيد (الشكل 3 ألف، مقارنة مقابل "الملون، أونستيمولاتيد" مؤامرات دوت "أونستينيد، أونستيمولاتيد"). ونلاحظ زيادة ملحوظة في الأسفار FL1 و FL2 عندما يتم تحفيز الخلايا مع FcγR العابرة للربط عامل (الشكل 3A، قارن "الملون وحفز عبر نادي العابرة للربط" عينات مقابل مؤامرات دوت "الملون، أونستيمولاتيد"). وأخيراً، عندما كانت تعامل الخلايا مع مثبط روس قبل العابرة للربط FcγR، هذه الأسفار زيادة هو إعادته إلى المستويات القاعدية (الشكل 3 ألف، قارن "الملون وتعامل مع روس المانع وحفز عبر نادي العابرة للربط" مقابل "الملون و دوت تحفز عن طريق نادي العابرة للربط "المؤامرات). وهذا واضح أيضا عند عرض البيانات كرسم بياني لكل قناة (الشكل 3) أو عندما يتم عرض البيانات كنسبة مئوية من الخلايا إيجابية بالنسبة أما الأخضر أو البرتقالي روس المسابر (الشكل 3). اتجاه مماثل واضح أيضا عندما يتم تقديم البيانات كمؤسسة مونتانيار، على الرغم من أن لم يتم التقاط الانخفاض في الأسفار البرتقال مع ما قبل المعالجة بمثبطات روس عندما قدم كمؤسسة مونتانيار مقابل كنسبة مئوية (الشكل 3)، وكذلك. ونقدم أيضا نتائج التجارب المستقلة 3 المنجز في أيام مختلفة (الشكل 3، تجربة 1 و 2 و 3). متوسط القيم والأخطاء المعيارية المقابلة يعني مبينة في الرسوم البيانية (الشكل 3).

ونقدم أيضا التجارب غير الناجحة، حيث لوحظ دون المستوى الأمثل من إنتاج روس نتيجة تنشيط FcγR (الشكل 4). تم الكشف عن زيادة بنسبة ضئيلة في الأسفار FL1 و FL2 عند مقارنة "الملون وحفز عبر نادي العابرة للربط" عينات مقابل "الملون، أونستيمولاتيد" عينات (الشكل 4 أ، ب، ج). ويرد هذا جنبا إلى جنب مع تجربة ناجحة لتسليط الضوء على الاختلافات الكبيرة بين النسب المئوية المتوقعة أو زيادات مؤسسة مونتانيار والقيم التي لوحظت في التجربة غير الناجحة.

ويستخدم البروتوكول الحالي خطوة فتيلة ح 24. عند مقارنة ح 24 مقابل وقت فتيلة ح 48، لاحظنا أي اختلاف ملحوظ في النسبة المئوية للخلايا إيجابية للكاشف الخضراء، وعنصر مؤكسد الإجهاد (الشكل 5A، أعلى رسوم بيانية و الشكل 5B الأخضر المسبار، % إيجابية). ومع ذلك، زيادة وقت فتيلة ح 48 زيادة النسبة المئوية للخلايا إيجابية للأسفار البرتقالي (الشكل 5Aوانخفاض رسوم بيانية ومسبار الشكل 5B البرتقال، % إيجابية). وانعكس هذا المثل عندما تم تقديم البيانات كمؤسسة مونتانيار. وهذا يوحي أن وقت فتيلة ح 48 الأمثل من الكشف عن جميع الأنواع روس، قد تكون أكثر مثالية.

نظراً لأن سبب التكلفة أو الوقت اللازم للتجريب، استخدام مجموعة أدوات القيام بهذا التحليل قد لا يكون خياراً. لهذا السبب، نحن أيضا اختبار مكونات مماثلة لتلك المنصوص عليها في هذه المجموعة والتي تم شراؤها من البائعين القياسية (ثيرموفيشير، EMD Millipore، كايمان). أننا نجد أن على حدة باستخدام شراء المكونات ونفس البروتوكول التجريبي لتحميل الخلية والتحفيز FcγR، ونحن يمكن أن الخص العديد من النتائج التي توصل إليها نفس لاحظنا استخدام كيت (الشكل 6 أ، ب). ولكن، على الرغم من الزيادات في الأسفار كانت واضحة مع التحفيز، مستوى أعلى من إنتاج روس لوحظ استخدام عدة. قد يشير هذا إلى أن استخدام مكونات التي تم شراؤها على حدة قد يكون ممكناً ولكن تحتاج إلى مزيد تحسينه لهذا الفحص المحددة.

أخيرا، نحن تبين أن من الممكن أيضا الجمع بين سطح الخلية تلطيخ مع هذه المسابر روس. ونحن نستخدم علامة بلعم معروفة، F4/80، يضاف إلى 647 أليكسا وأداء سطح الخلية تلطيخ قبل المعالجة بمثبطات روس أو محفز روس أو حوافز معينة للحث على إنتاج روس. نبدي في الشكل 7B الضامة تستجيب كما هو متوقع عند التعامل مع FcγR كروسلينكينج عامل وعامل كروسلينكينج FcγR + روس المانع (7B الشكل، مقابل البرتقال يرسم النقطة الخضراء). وعلاوة على ذلك، يمكن أن نلاحظ زيادة اللون البرتقالي أو الفلورية الخضراء على وجه التحديد المتولدة عن F4/80 المسمى الخلايا عند المعاملة مع FcγR كروسلينكينج عامل وخفضت مع ما قبل المعالجة بمثبطات روس (الشكل 7ب، مقابل F4/80 الأخضر و F4/80 مقابل مؤامرات دوت البرتقالي).

Figure 1
رقم 1: تدفق تقييم سيتوميتريك جيل المناسبة من بمدمس- بمدمس نوع البرية تم إنشاؤها وتركت أما أونستينيد أو الملون مع فيتك الماوس المضادة F4/80 أو 647 أليكسا الماوس لمكافحة CD11b-منتدى التعاون الأمني محور (س) مقابل قطع SSC المحور (ص) تم إنشاؤها وكانت بوابات الضامة (بمدمس) لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. باستخدام قطعة FSC-H(x-axis) مقابل منتدى التعاون الأمني-أ (المحور الصادي)، تم إنشاء بوابة القميص. النابضة في نوع، رسوم بيانية تم إنشاؤها لإظهار الخلايا الملون مع أما فيتك F4/80 أو الملون CD11b APC بالمقارنة مع ايستب عنصر التحكم. A) التمايز "بمدم الصحيح" مع أكثر من 95% من الخلايا تلطيخ إيجابية ل CD11b أو F4/80. التفريق ب) بمدم غير صحيحة حيث يتم تلطيخ أقل من 95% خلايا إيجابية ل F4/80 وقمم 2 موجودة على CD11b. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. أداء التعويض عند استخدام روس الأخضر والبرتقالي يسبر. سيتطلب تعويض الخلايا غير المعالجة أونستينيد، والخلايا ملطخة بروس الأخضر التحقيق وتعامل مع روس محفز، والخلايا ملطخة بروس البرتقال التحقيق وتعامل مع روس محفز. قطع دوت أونستينيد الخلايا غير المعالجة تستخدم لتحديد بوابات رباعي. ترد البيانات لخلايا منفردة ملطخة أما المسبار روس الأخضر أو البرتقالي روس التحقيق والتعامل مع روس محفز قبل وبعد، تم تطبيق التعويض. ثم يتم تطبيق مصفوفة التعويض لجميع العينات التجريبية اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. قياس روس ردا على التحفيز FcγR محددة باستخدام المسابر روس وتقييم لإمكانية تكرار نتائج الفحص الأخضر والبرتقالي. البرية من نوع المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) تم إنشاؤها، جاهزة للانفجار، وتركت أما أونستينيد أو الملون مع مزيج أخضر ويَسْبِر روس البرتقالي. وتركت بمدمس الملون أما غير المعالجة أو المعالجة بمثبطات روس قبل التحفيز حفز من خلال FcγRs استخدام IgG المضادة-جيش صرب البوسنة مورين1 + جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة عن طريق FcγR العابرة للربط. يرسم النقطة A)، تظهر زيادة في النسب المئوية للخلايا في أعلى اليسار، أعلى اليمين، وأقل الأرباع الصحيح عند محددة FcγR التحفيز، والذي يتم تقليل حضور روس المانع. ب) رسوم بيانية لكل قناة الأسفار، عرض بوابة علامة لتحديد الخلايا إيجابية بالنسبة لكل التحقيقات. ج) عرض البيانات كنسبة مئوية من الخلايا إيجابية بالنسبة لكل تحقيق أو كزيادة في مؤسسات التمويل الأصغر. يتم عرض ثلاث تجارب مستقلة، والممثل. يعني 3 تجارب وأخطاء قياسية يعني تظهر كخطوط حدود الرسوم البيانية. نادي XL، نادي العابرة للربط؛ بريدًا، ن-أسيتيل-L-سيستين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. أمثلة ناجحة ودون المستوى الأمثل من التحفيز FcγR. البرية من نوع المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) تم إنشاؤها، جاهزة للانفجار، وتركت أما أونستينيد أو الملون مع مزيج أخضر ويَسْبِر روس البرتقالي. وتركت بمدمس الملون أما غير المعالجة أو المعالجة بمثبطات روس قبل التحفيز حفز من خلال FcγRs استخدام IgG المضادة-جيش صرب البوسنة مورين1 + جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة عن طريق FcγR العابرة للربط. يتم إظهار النتائج ممثلة لتحفيز الناجح والأمثل كما يرسم A) نقطة، وب) رسوم بيانية، أو ج) النسبة المئوية للخلايا إيجابية لكل مسبار أو كزيادة في مؤسسة مونتانيار. يظهر التحفيز الناجحة زيادة الأسفار في أعلى اليسار، أعلى اليمين وأقل الأرباع حق الأرض FL2 مقابل FL1 وزيادة مؤسسة مونتانيار والنسبة المئوية للخلايا إيجابية ملطخة بكل مسبار على التحفيز FcγR. التحفيز الأمثل يبين زيادة ضئيلة في مؤسسة مونتانيار أو النسبة المئوية للخلايا إيجابية. نادي XL، نادي العابرة للربط؛ بريدًا، ن-أسيتيل-L-سيستين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. تأثير الوقت فتيلة على توليد روس على التحفيز FcγR. بمدمس تم إنشاؤها، أعدادا ح 24 أو 48، وتركت أما أونستينيد أو الملون مع مزيج أخضر ويَسْبِر روس البرتقالي. وتركت بمدمس الملون أما غير المعالجة أو المعالجة بمثبطات روس قبل التحفيز حفز من خلال FcγRs استخدام IgG المضادة-جيش صرب البوسنة مورين1 + جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة عن طريق FcγR العابرة للربط. رسوم بيانية A) للأسفار الناجمة عن كل مسبار على حفز الضامة أعدادا ل h. أما 24 أو 48 ب) النسبة المئوية للخلايا إيجابية بالنسبة لكل مسبار على حفز الضامة أعدادا الضامة فتيلة h. أما 24 أو 48 عن 48 ساعة أسفرت عن زيادة في الخلايا إيجابية للأسفار البرتقالي (أو زيادة في مؤسسة مونتانيار للقناة FL2) مقارنة فتيلة الضامة ح 24 بالمئة. يعني 3 تجارب وأخطاء قياسية يعني تظهر كخطوط حدود الرسوم البيانية. نادي XL، نادي العابرة للربط؛ بريدًا، ن-أسيتيل-L-سيستين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. تدفق سيتوميتريك روس القياس عند العابرة للربط FcγR باستخدام الكواشف من مختلف البائعين. بمدمس تم إنشاؤها، أعدادا ح 24، وتركت أما أونستينيد أو الملون مع مزيج من عنصر مؤكسد الإجهاد وفائق أكسيد المسابير الكشف. ملون بمدمس كانت أما الأيسر غير المعالجة، وحفز مع روس محفز، وحفز من خلال FcγRs استخدام IgG المضادة-جيش صرب البوسنة مورين1 + جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة، أو تعامل مع مثبط روس قبل التحفيز عن طريق FcγR العابرة للربط. كانت تحقيقات ومحفِّز روس وروس المانع المستخدمة أما من المجموعة أو تم شراؤها بشكل منفصل من مختلف البائعين وتستخدم بتركيز مماثل. دوت A) يرسم عرض مقارنة بين النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مكونات عدة وغير طقم جنبا بجنب. ب) رسوم بيانية تبين مقارنة بين النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مكونات عدة وغير طقم جنبا بجنب. نادي XL، نادي العابرة للربط؛ بريدًا، ن-أسيتيل-L-سيستين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7. الجمع بين سطح الخلية تلطيخ مع تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس عند FcγR العابرة للربط- نقطة A) مؤامرات لمختلف قنوات الفلورسنت باستخدام أونستاينيد أو ضوابط التعويض الملون منفردة. البرية من نوع بمدمس تم إنشاؤها، أعدادا ح 24، وتركت أما أونستينيد أو الملون مع الماوس المضادة 647 أليكسا F4/80 فقط، ملطخة بمسبار روس الأخضر فقط، وتعامل مع روس محفز أو الملون باللون البرتقالي روس التحقيق فقط، وتعامل مع روس محفز. قطع دوت أونستينيد الخلايا غير المعالجة تستخدم لتحديد بوابات رباعي. قطع تبين النتائج المتوقعة إذا القنوات يتم التعويض عنها بشكل صحيح. ثم تم تطبيق مصفوفة التعويض لجميع العينات التجريبية اللاحقة. بمدمس البرية من نوع ب) التي تم إنشاؤها، أعدادا ح 24 وملطخة بالماوس المضادة 647 أليكسا F4/80. بعد ذلك، كان بمدمس أما unstimulated اليسار، وحفز من خلال FcγRs استخدام IgG المضادة-جيش صرب البوسنة مورين1 + جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة، أو تعامل مع مثبط روس قبل التحفيز عن طريق FcγR العابرة للربط. قطع نقطة تثبت أنه يمكن اكتشاف الأسفار الأخضر أو البرتقالي على وجه التحديد التي تنتجها الخلايا F4/80. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دكفه2-دا والكشف على أساس DHE من روس هو14،تقنية المستخدمة على نطاق واسع15. سهولة الاستخدام وتكيف هذه المسابر روس للأشكال الميكروسكوبية الحركية، ساهم التحليل سيتوميتريك المجهري أو تدفق الأسفار شعبيتها. ومع ذلك، في دراساتنا لوظائف FcγR بوساطة بلعم، هناك لا يبدو بروتوكول قياسي لإجراء هذا التحليل لتحليل تدفق سيتوميتريك الخلايا FcγR cross-linked. ونظرا لطبيعة رد الفعل لتحليلها ويجري تقييم، وجدنا أن توقيت يكتسي أهمية حاسمة في التأكد من تحقق إمكانية تكرار نتائج. على الرغم من أننا أيضا إجراء فحوصات الميكروسكوبية الحركية، يمكن أن يكون هناك تباين واسع في شدة الأسفار من تجربة لتجربة، وجعله من الصعب على البيولوجية الإجمالية وإنشاء نسخ متماثلة للتحليل الإحصائي. تدفق سيتوميتريك استخدام هذه المجسات يسمح للتقدير الكمي للخلايا "روس الإيجابي" الذي يعمل على حل بعض هذه المسائل ولكن ليس بدون مضاعفات. وهذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام cytometer تدفق مجهزة أوتوسامبلير. في هذه الحالة، وتحليل عدد كبير من العينات سيؤثر مقدار الوقت تتعرض الخلايا للمنبهات المختلفة. للتخفيف من ذلك، ادخلنا الفارق الزمني بين تحليل العينات في البروتوكول للتأكد من أن يتم إجراء التحليل على خلايا حفز لكمية مماثلة من الزمن.

هناك عامل هام آخر في تحليل تدفق سيتوميتريك روس هو إدراج عناصر التحكم المناسبة. لا يمكن المبالغة أن كل تجربة يجب أن يكون لديك كافة (على الأقل) التجريبية وضوابط التعويض نحن قائمة في هذا البروتوكول. هذه مهمة التأكد من صحة كل تجربة، وكذلك ما يمكن أن يبرر استبعاد العينات إذا لزم الأمر. وتشمل بعض الأمثلة على ذلك إذا الضامة لا تفرق/تنضج على نحو مناسب ومعارضها كثير انخفاض إنتاج روس حتى مع العلاج محفز. يمكن أن تكون حالة أخرى غير مناسبة تفعيل الضامة حتى قبل FcγR العابرة للربط، أسفر عن إشارة روس القاعدية عالية. استخدام مثبطات روس بالاقتران مع FcγR محددة العابرة للربط تظهر اختفاء إشارات الفلورسنت هي عنصر تحكم هام آخر كثيرا ما وجدنا تفتقر في دراسات أخرى إجراء فحوصات مماثلة. مثبط روس المستخدمة في هذه الدراسة، ن-أسيتيل-L-سيستين، يعتبر مثبط روس الجميع. ومع ذلك، إذا واحدة مهتمة بروس التي تنتجها الإنزيمات المحددة، مثبطات روس محددة أخرى يمكن تضمينها في المقايسة، وكذلك. وتشمل بعض الأمثلة على حمض ميفاناميك (مثبطات السيكلواوكسيجيناز-تعتمد على روس)، أبوسينين (نادف أوكسيديز-تعتمد على روس المانع) أو الوبيورينول (زانتيني أوكسيديز-تعتمد على روس مثبط).

من المهم بالإضافة إلى ذلك فهم ما يجري قياسه فعلا في هذا قراءات. كما ذكر سابقا، دكفه2-دا تدابير متعددة الأنواع روس، ومن ذلك، لا يمكن استخدام fluorescence الناجمة عن التحقيق الأخضر لتميز الأنواع روس واحدة من آخر14. وبالمثل، المسبار البرتقالي (المحتمل DHE)، على الرغم من أن كثيرا ما يستشهد كأكسيد فائق محددة، يمكن أن تنتج منتجات أكسدة أكسيد فائق محددة ومستقلة عن فائق أكسيد كلا، التي لا يمكن تمييزها دون استخدام تقنيات إضافية مثل [هبلك] 15. ومع ذلك، لأغراض قياس "مجموع روس" أو "الناجم عن روس" أثناء انفجار الجهاز التنفسي، استخدم هذه التحقيقات جنبا إلى جنب مع عناصر التحكم المناسبة، قد يكون مقبولاً. العديد من الفلورسنت استناداً إلى روس أجهزة استشعار جديدة ظهرت أو يجري نمواً11،13. بعضها، مثل البروتينات الفلورية المراعية للأكسدة، تتميز بقياس دينامية الإنتاج روس بسبب الأكسدة عكسها. ومع ذلك، هذه تتطلب التحوير الوراثي للخلايا، والتي قد لا تكون دائماً ممكنة أو المرجوة. في كثير من الحالات، فلوري الكشف روس على أساس التحقيق لا تزال أداة صالحة ومفيدة، وما دامت هذه التجربة الموحدة، التي تسيطر عليها جيدا، والاستنتاجات المستمدة من هذه التجارب وهي لم تبالغ في تقدير.

الفوائد التي تعود على استخدام هذه المجموعة روس المتاحة تجارياً أن ترد جميع الكواشف اللازمة بما في ذلك مستحثات روس، وجمع القمامة، والمسابير معاير و "جاهزة للاستخدام". هذه المجموعة إذا كانت فترة التجريب يتوقع أن تكون قصيرة (أنجز في غضون أسبوع واحد)، يمكن أن توفر وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة لإجراء الكشف روس الخلوي على أساس تدفق دون الحاجة إلى شراء أو تحسين كل مكون من مكونات محددة على حدة. ونحن بالإضافة إلى ذلك عرض باستخدام هذه المجموعة مع مؤثر معينة (تحفيز FcγR) وإثبات إمكانية تكرار نتائج عبر التجارب؛ نحن تقييم آثار مرات فتيلة على توليد روس؛ نحن مقارنة باستخدام المسابر مماثلة ومثبطات مستحثات من شركات مختلفة؛ نحن نقدم أمثلة لتجارب غير ناجحة؛ وأخيراً، أن نجمع بين سطح الخلية تلطيخ مع استخدام هذه المسابر روس. يحتمل أن هذا سيسمح للكشف المتزامن لروس من أنواع الخلايا المختلفة داخل سكان مختلطة، التي تتطلب أقل العينة والكواشف. على سبيل المثال، قد يكون هذا مفيداً بشكل خاص عند التفريق بين بلعم والمستمدة من العَدلات روس، أنواع الخلايا الرئيسية قادرة على الاستجابة لربط FcγR. للتجارب المتعددة التي قد تتم مع الفترات الطويلة الفاصلة بين، قد لا يكون استخدام مجموعة النحو المثالي. لا يتم توفير مختبرين متعددة التحقيقات بمجرد تشكيلها، الشركة المصنعة إلا توصي باستخدام الكواشف في غضون أسبوع (وكذلك شدة رد الفعل المسابير روس). إذا كان من المتوقع أن هذه الفترة غير متوافق مع التجريب، نوصي بأن الكواشف الفردية بدلاً من مجموعة يمكن شراؤها بشكل منفصل وتشكيلها إلا خلال النهار للتجريب. كما نبدي هنا، كذلك الأمثل للمكونات التي تم شراؤها على حدة بالإضافة إلى ذلك يلزم قبل المقايسة. وعموما، نأمل أن هذا العمل يوفر مرجعاً مفيداً للباحثين باستخدام التدفق الخلوي لقياس تكاثر جيل روس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر الأعضاء الآخرين في "المختبر" تينو ارانخويث بمن فيهم مادلين H. ميلر وعمر كاردونا، جودي أنجي وروبين سينغ لمساعدتهم في مختبر الماوس وصيانتها صيانة مستعمرة. وقدم الدعم لهذا البحث بمنحه R00 HL122365 وأموال بدء التشغيل إلى J.T.T-أ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 145، أنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، التدفق الخلوي، نادي مستقبلات غاما (FcγR)، ومستقبلات Fc، الضامة، انفجر الجهاز التنفسي
تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter