Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.

Abstract

De oxidatieve of luchtwegen burst wordt gebruikt om te beschrijven de snelle consumptie van zuurstof en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) door fagocyten in reactie op verschillende stimuli van immuun. ROS gegenereerd tijdens immuunactivatie oefent krachtige antibacteriële activiteit voornamelijk via het vermogen van ROS schade van DNA en eiwitten, die dood van micro-organismen veroorzaakt. Zijnde kundig voor meten van ROS productie reproducibly en met gemak is noodzakelijk teneinde de bijdrage van de verschillende trajecten en moleculen om dit mechanisme van verdediging van de gastheer. In deze paper, wij tonen het gebruik van fluorescerend sondes en stroom cytometry om te detecteren ROS productie. Hoewel het op grote schaal gebruikt, is fluorescerende meting van ROS notoir problematisch, vooral met betrekking tot de meting van ROS geïnduceerd door specifieke en niet mitogene stimuli. Presenteren we een gedetailleerde methodologie voor het detecteren van ROS gegenereerd naar aanleiding van specifieke FcγR stimulatie beginnen met macrofaag generatie, priming, kleuring, FcγR dwarsbinding en eindigend met flow cytometrische analyse.

Introduction

Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn reactieve moleculen of vrije radicalen die een van aërobe ademhaling bijproduct (herzien in 1). Het gaat hierbij om de superoxide anion, peroxide, waterstofperoxide, hydroxyl radicaal en hydroxyl ionen, onder anderen. In normale fysiologische omstandigheden ROS worden vooral door de mitochondriën en nicotinamide adenine dinucleotide-fosfaat (NADPH) oxidasen geproduceerd en zijn snel door verschillende enzymen en eiwitten zoals superoxide dismutase en glutathion voorkomt. Een overdreven productie van ROS of een defect in de mogelijkheid om te verwijderen van ROS kan resulteren in oxidatieve stress, waarbij reactieve zuurstof soorten bevorderen de schade van eiwitten, lipiden en DNA leidt tot cellulaire stress of dood en pathologische ziekte staten. Echter is het op dit moment gewaardeerd dat ROS ook als signalering moleculen (redox signalering fungeren kan) en ROS-gemedieerde wijziging van verschillende moleculen en traject tussenproducten cellulaire metabolisme, proliferatie, overleving, inflammatoire beïnvloeden kan signalering en veroudering van2. In fagocytische cellen speelt ROS een essentiële rol bij het verstrekken van antimicrobiële activiteit tijdens de zogenaamde "respiratoire burst"1,3,4,5,6. Tijdens de reactie van fagocyten op externe prikkels translocate onderdelen van de NADPH oxidase complexe (p40phox, p47phox, p67phox) van het cytosol aan de phagosomal membraan met de gp91phox en p22phox subeenheden, en samen met de acties van Rac1/2, vormen een volledig functionele NADPH oxidase enzym complex. De geassembleerde NADPH oxidase maakt vervolgens gebruik van NADPH ter vermindering van zuurstof tot een superoxide binnen de phagosomal vacuole. Superoxide anionen kunnen direct schade veroorzaken of worden dismutated in waterstofperoxide. Zowel superoxide en waterstofperoxide kunnen reageren met andere moleculen voor het genereren van zeer reactieve hydroxyl radicalen. Schade is bemiddeld door reactie van deze ROS met ijzer-zwavel clusters op eiwitten of door het veroorzaken van base oxidatie van DNA, uiteindelijk leidde tot beperkte microbiële metabolisme of dood van de microbe5. Het belang van het NADPH oxidase enzym complex en ROS geproduceerd tijdens de respiratoire burst wordt klinisch geïllustreerd in patiënten met chronische granulomateuze ziekte (CGD)7,8,9, 10. personen met CGD bezitten mutaties in gp91phox, wat resulteert in een gebrek aan ROS productie en gevoeligheid voor terugkerende infecties met bacteriën en schimmels die meestal niet een punt van zorg met immunocompetent individuen zijn. Daarom, of studeren oxidatieve stress, redox signalering of host defense, in staat zijn om te meten ROS productie in real time is een nuttig inspanning.

Meerdere testen hebben gebruikt maatregel ROS productie of de resultaten van oxidatieve stress11,12,13. Daaronder is een van de meest gebruikte de fluorescerende sonde 2', 7' dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH2-DA)14. Dit molecuul is kleurloos en lipofiele. Verspreiding van DCFH2-DA tussen de celmembranen kan hij worden opgevolgd door intracellulaire esterasen, die het deacetylates in DCFH2, waardoor zij cel ondoordringbare. De acties van meerdere soorten ROS (waterstofperoxide, peroxynitriet hydroxyl radicalen, stikstofmonoxide en peroxy radicalen) op DCFH2 het oxideren in DCF dat tl is (gerapporteerde Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) en kan worden opgespoord met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een standaard filter instellen voor fluoresceïne (FL1 kanaal). Superoxide niet sterk reageert met DCFH2 maar met een andere sonde dihydroethidium (DHE) opbrengst van de fluorescerende product 2-hydroxyethidium (evenals andere producten van fluorescerende superoxide-onafhankelijke oxidatie)15kan reageren. De fluorescerende producten van DHE oxidatie kunnen worden opgespoord met behulp van een golflengte van de excitatie van 518 nm en een golflengte van de emissie van 605 nm (FL2 kanaal). Hoewel het relatief eenvoudig te gebruiken, vereist gebruik van deze sondes voor detectie van ROS kennis van hun beperkingen en zorgvuldige opneming van kleuring procedures en controles in de specifieke bepaling wordt uitgevoerd om geldige experimentele resultaten en conclusies. Het volgende protocol demonstreert het gebruik van een commercieel beschikbare kit deze 2 sondes voor het meten van ROS ontworpen door stroom cytometry in dienst. We primer beenmerg-afgeleide macrofagen vlek met deze sondes en veroorzaken ROS productie via het FcγR dwarsbinding. Wij presenteren representatieve gegevens verkregen met behulp van dit protocol en wijzen passende voorzorgsmaatregelen die moeten worden ondernomen voor succesvolle experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol voor het verwerken van dieren werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het University of Central Florida.

1. generatie van beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs)

  1. Bereiding van de voedingsbodems
    1. D10F base media bereiden: aan de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM), voeg toe 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 0.05 mM β-mercaptoethanol.
      Opmerking: Hoewel het beste te gebruiken verse D10F media, D10F base media kan bereid worden omhoog tot twee weken van tevoren moet worden gebruikt voor meerdere experimenten binnen een week. Voor een muis is ongeveer 175 mL D10F base media nodig (25 mL voor het spoelen van de botten) en 150 mL macrofaag differentiatie media maken
    2. Bereiden van LADMAC groei media: naar Eagle's Minimum essentiële Medium (EMEM), voeg toe 10% warmte geïnactiveerd FBS en 2 mM L-glutamine. De media-vers, voor te bereiden op de dag dat u van plan bent om te beginnen uw culturen.
      Opmerking: Een liter van LADMAC groei media zal resulteren in ongeveer (19) 50 mL aliquots van LADMAC-geconditioneerd media.
    3. Bereiden van complete DMEM media: DMEM, toevoegen 10% warmte geïnactiveerd FBS en 1 x antibiotica-Antimycotic. De media-vers, voor te bereiden op de dag die bmdms zal worden geoogst.
      Opmerking: Voor een muis, ongeveer 100 mL DMEM volledige media zal worden verlangd. Het gaat hierbij om media die worden gebruikt voor priming de cellen.
  2. Bereiding van LADMAC geconditioneerde medium
    1. LADMAC cellen groeien tot confluentie in een 10 cm schotel met 10 mL van LADMAC groei media (gedefinieerd in 1.1.2). Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2.
    2. Loskoppelen op confluentie, cellen door krachtig toedieningseenheden media over cellen. De cellen van de passage door toevoeging van 1 mL van vrijstaande cellen in T-175 kolven met 100 mL LADMAC groei media. Incubeer de cellen tot volledig confluente bij 37 ° C, 5% CO2 (ongeveer een week). Op deze manier een 10 cm schotel kan opleveren tien T-175 kolven of ongeveer 1 L van geconditioneerde media.
    3. Zodra de cellen klaar zijn, de geconditioneerde media en centrifuge bij 350 x g gedurende 5 min om ongewenste cellen pellet verzamelen. Filtreer de verzamelde supernatant door een 0,2 mm filter en opslaan van 50 mL aliquots bij-80 ° C. Aliquots van LADMAC-geconditioneerd media kunnen worden bewaard bij-80 ° C voor maanden met minimaal verlies van activiteit.
      Opmerking: Als grote experimenten worden verwacht, grote hoeveelheden van LADMAC-geconditioneerd media te bereiden tegelijkertijd te zorgen voor samenhang. Als dit niet mogelijk is, gebruikt u aliquots afgeleid uit dezelfde batch of veel LADMAC-geconditioneerd media voor elk experiment.
  3. Voorbereiding van het beenmerg afgeleid macrofagen
    1. Bereiden op de dag van het experiment, verse macrofaag differentiatie media door 25% van de LADMAC geconditioneerd media in eerder bereid D10F media (1 deel LADMAC geconditioneerd media in 3 delen D10F) toe te voegen. Niet bereiden deze media! Alleen zo veel media zo nodig voor de BMDM-cultuur voor te bereiden.
    2. Dag 1: isoleren van muis beenmergcellen volgens de eerder beschreven protocol16 met een wijziging voor het spoelen van het beenmerg uit dijbeen en zijn verbeend gebruik D10F base media. 2,5 mL van D10F media gebruiken voor het spoelen van de beide uiteinden van de botten (4). Flush beenmergcellen rechtstreeks in een vooraf natte 40 mm cel zeef geplaatst op de top van een tube van 50 mL. De resterende medium (~ 5 mL) kan worden gebruikt om te spoelen uit de cel zeef.
    3. Centrifugeer verzamelde beenmergcellen bij 350 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de cellen in een totaal van 30 mL macrofaag differentiatie media (per muis).
    4. Bereiden en label (6) steriele 10 cm petrischalen. Plaat 5 mL macrofaag differentiatie media in elk in een petrischaal. Aliquot 5 mL geresuspendeerde beenmergcellen in macrofaag differentiatie media in elke petrischaal voor een totaal volume van 10 mL per schotel. Incubeer gedurende 5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
    5. Dag 5: gecombineerd media uit de cellen. Was eens met 1-2 mL PBS en voeg toe 10 mL vers bereide macrofaag differentiatie media. Incubeer gedurende een extra 3 dagen.
    6. Dag 8: Ga verder met het oogsten van BMDMs, zoals hieronder beschreven.

2. oogsten en zaaien priming van BMDMs

  1. Verwijder het supernatant na 7 dagen van de BMDMs in de macrofaag differentiatie media groeien. Wassen aanhangend macrofagen een keer met 1-2 mL PBS. De PBS gecombineerd.
  2. Afzien van 0,25% 1 mL trypsine-EDTA in elke macrofaag plaat en laat ze in de incubator van de 37 ° C gedurende 5-10 minuten met frequente te onttrekken om de cellen los te maken. Trypsinized macrofagen distantiëren door op en neer met behulp van een precisiepipet P1000 pipetteren en verzamelen van macrofagen in 50 mL buisjes met 10-15 mL van volledige DMEM media. Wassen van de plaat met extra 2 mL volledige DMEM media om te oogsten enige resterende macrofagen.
    Let op: Laat niet macrofagen in trypsine voor meer dan 10 min.
  3. Centrifugeer de 50 mL tubes bij 350 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant. Zachtjes distantiëren van de pellet en resuspendeer de cellen in 10 mL van de volledige DMEM media. Graaf macrofagen met behulp van een hemocytometer in de aanwezigheid van een levensvatbaarheid kleurstof zoals trypan blauw als volgt:
    1. Meng bijvoorbeeld 90 µL van Trypan blauw met 10 µL van cellen voor een 1:10 verdunning.
    2. Van dit mengsel 10 µL laden in een hemocytometer en het centrale plein (5 x 5 raster) tellen. De cel Totaal count = count x 104 x verdunningsvolume factor (10) x (10 mL).
  4. Aanpassen van de celsuspensie om 1 miljoen/mL in volledige DMEM media en plaat 4 mL van deze celsuspensie in elk 6 cm schotel.
    Opmerking: Een minimum van 3 platen is vereist per experiment. Een plaat van cellen zullen links ongestimuleerde, een tweede reeks cellen zal worden gestimuleerd via cross-linking van FcγRs en de derde plaat van cellen wordt gebruikt voor al het extra experimentele en stroom cytometrische besturingselementen.
  5. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2.
  6. De volgende dag, gecombineerd het supernatant, wassen cellen een keer met 1-2 mL PBS. Voeg 4 mL volledige media met 100 ng/mL muis IFN-γ aan elke plaat. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2.
  7. Indien gewenst nemen een aliquoot deel van de cellen te beoordelen van passende generatie van BMDMs door stroom cytometry. 1 x 106 cellen per test gebruiken en polystyreen FACs buizen voorbereiden met de volgende voorwaarden: isotype besturingselement, gekleurd met F4/80 (of als alternatief, gekleurd met CD11b).
  8. Bereiden van stroom cytometry kleuring buffer door toevoeging van 0,1% FBS in 1 x PBS. Gebruik alleen deze hoeveelheid FBS dus niet te ontkennen de effecten van de serum-honger in latere stappen.
  9. Aliquot 1 x 106 cellen per buis en centrifugeer bij 750 x g gedurende 5 min.
  10. Wassen eenmaal door decanteren of zuigen supernatant en resuspending cellen in 2 mL zuiver stroom cytometry buffer. Centrifugeer bij 750 x g gedurende 5 min.
  11. Gecombineerd supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van stroom cytometry kleuring van de buffer. Voeg 1 µL van anti-muis CD16/32 Fc blokkerende antilichamen aan elke buis. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
  12. Zonder wassen, 2 µL van FITC-antimuis F4/80 of 1 µL van APC anti-muis CD11b antilichaam toevoegen aan de "gekleurd" buizen en een vergelijkbaar bedrag van de overeenkomstige isotype controle antilichaam aan "isotype" buizen. Incubeer op ijs, in het donker, 30 min.
  13. Wassen cellen door toevoeging van 2 mL PBS rechtstreeks naar de cellen. Centrifugeer bij 750 x g gedurende 5 min.
  14. Gecombineerd supernatant en resuspendeer de cellen in 150 µL van PBS.
  15. Verwerven van de monsters op een cytometer van de stroom met behulp van een stop-voorwaarde van 100 µL of 10.000 gebeurtenissen op de poort van belang en ervoor te zorgen dat FSC, SSC, FL1 (FITC-antimuis F4/80) of FL4 (APC-antimuis CD11b) kanalen zijn geselecteerd voor de parameters te analyseren.
  16. Met behulp van de stroom cytometry software, open een stip perceel voor FSC (op de x-as) vs SSC (op de y-as) en tekenen van een hek rond de cellen van belang zijn, met uitzondering van dode cellen en puin (dode cellen en puin zijn veel kleinere evenementen dan de belangrijkste celpopulatie en verschijnen op de lowe r links van het perceel).
  17. Een histogram plot gating op de cellen van belang, openen met FL1 (FITC-antimuis F4/80) of FL4 (APC-antimuis CD11b) op de x-as.
  18. Voer het "isotype" monster. Genereren van een marker-gate, dus dat de meerderheid van "isotype" monster gebeurtenissen aan de linkerkant van de poort zijn (< 1% positief). Deze sjabloon toepassen op de gekleurde voorbeeldbestand.
  19. Voer het "gekleurd" monster. Succesvolle generatie van BMDMs zal resulteren in > 95% uitdrukking van FITC anti-muis F4/80 of APC-antimuis CD11b (figuur 1A), terwijl de onjuiste kweekomstandigheden kunnen resulteren in suboptimale genereren van macrofagen (figuur 1B).
    Opmerking: Als het genereren van BMDMs van meerdere genotypen, neem nota van de uitdrukking van deze markers voor elke partij BMDM gegenereerd, in het geval dat dit kan een reden voor het uitsluiten van een steekproef uit analyse bij de beoordeling van ROS generatie in reactie op stimulans zijn.

3. reagens en materiaal voorbereiding ROS meting

  1. Het reconstrueren van het gelyofiliseerd oxidatieve stress detectie reagens in 60 µL van watervrij DMF opleveren van een stamoplossing van 5 mM. Voorzichtig mengen vóór gebruik.
    Opmerking: Het staat in de handleiding van de kit ROS-ID dat de houdbaarheidstermijn van het gereconstitueerde reagens ongeveer 1 week bij-20 ° C. is Aliquoting de reagens onmiddellijk na reconstitutie in kleine flesjes van lichtdicht minimaliseert de oxidatie en maximaliseert de houdbaarheid bij-20 ° C.
  2. Het reconstrueren van het gelyofiliseerd superoxide detectie reagens in 60 µL van watervrij DMF opleveren van een stamoplossing van 5 mM. Voorzichtig mengen vóór gebruik.
    Let op: zoals aangegeven in de handleiding van de kit, beide detectie reagentia te behandelen als mogelijk mutageen, elk met zorg, en de afzet van correct werken.
  3. Reconstrueren de inductor ROS (Pyocyanin) in 20 µL van watervrij DMF opleveren van een stamoplossing van 50 mM.
  4. Het reconstrueren van de ROS-remmer (N-acetyl-L-cysteïne) in 123 µL van gedeïoniseerd water zodanig dat deze een voorraad concentratie van 0,5 M.
  5. Label 5 mL ronde polystyreen buizen (stroom cytometry buizen) met de experimentele besturingselementen en voorwaarden. (Zie 4. Assay voorwaarden en controles)
  6. Bereiden van lage serum DMEM (geen fenol-rood) door toevoeging van 0,1% FBS aan fenol rood-vrije DMEM.
  7. Aliquot het antilichaam van de anti-BSA in kleine porties (afhankelijk van het gebruik) en bewaar ze bij-80 ° C.
  8. Stockoplossing van 100 mg/mL BSA in HBSS bereiden (Hanks uitgebalanceerd zoutoplossing) of PBS. ALIQUOT in 100 µL aliquots en winkel bij-20 ° C.
  9. Bereid een 2 x-oplossing van de ROS-sondes (2 x sonde oplossing): voor elke 10 mL lage serum DMEM, Voeg 4 µL van oxidatieve stress detectie reagens (groene kleurstof) en 4 µL van superoxide detectie reagens (oranje kleurstof).
  10. Bereiden van 2 x sonde oplossingen alleen met oxidatieve stress detectie reagens (2 x sonde oplossing, groen alleen), of met alleen superoxide detectie reagens (2 x sonde oplossing, oranje alleen). Alleen de hoeveelheid die nodig is voor het experiment reagens te bereiden en altijd bereid de 2 x oplossing onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken.
    Opmerking: Ter voorbereiding van kleinere volumes van 2 x detectie oplossing, gebruik een intermediaire 1:10 verdunning van zowel groen en oranje detectie reagentia vóór eindverdunning in DMEM. Bijvoorbeeld om te bereiden 1 mL 2 x detectie oplossing, 1 µL van elke sonde in 9 µL van DMEM te verdunnen (1:10 Middenniveau verdunning). 4 µL van dit verdunnen 1:10 verdunning in 1 mL van DMEM intermediair.

4. assay voorwaarden en controles

  1. De volgende experimentele besturingselementen opnemen voor het cytometrische stroomcompensatie voor elk experiment:
    a) onbevlekt en ongestimuleerde cellen.
    b) cellen gekleurd alleen met de oxidatieve stress detectie reagens (groen-reagens) en behandeld met ROS inductor.
    c) cellen gekleurd alleen met het superoxide detectie reagens (oranje-reagens) en behandeld met ROS inductor.
  2. Voor elke muis of biologische repliceren, moet u de volgende 6 voorwaarden bevatten:
    a) onbevlekt en ongestimuleerde cellen
    b) gekleurd en ongestimuleerde cellen
    c) gekleurd cellen behandeld met positieve inductor
    d) gekleurde cellen behandeld met positieve inductor en ROS-remmer
    e) gekleurde cellen geactiveerd door FcγR dwarsbinding
    f) gekleurde cellen geactiveerd door FcγR dwarsbinding en behandeld met ROS-remmer
  3. Bereken de hoeveelheid 2 x sonde oplossing nodig op basis van het aantal muizen en voorwaarden (200 µL van de 2 x sonde oplossing zal worden gebruikt voor elke voorwaarde vereisen kleuring).
    Opmerking: Voor een bepaling met behulp van de 6 muizen, 5 aandoeningen waarvoor kleuring met de sondes nodig per muis. Dit brengt het totale aantal voorwaarden tot en met 30. De totale hoeveelheid 2 x sonde oplossing nodig is dus op zijn minst 6 mL (30 * 200 µL).

5. cel voorbereiding

  1. Na de macrofagen priming's nachts, het supernatant gecombineerd. Wassen van de cellen een keer met PBS.
  2. Serum verhongeren de cellen door de media te vervangen door een gelijk volume laag serum DMEM. Voor elke muis, één plaat zal worden behandeld met anti-BSA IgG1 terwijl het serum verhongeren, terwijl de andere blijft onbehandeld. Voeg alleen lage serum DMEM aan onbehandelde platen. Toevoegen lage serum DMEM met 2,5 µg/mL lymfkliertest anti-BSA IgG1 aan behandelde platen.
    Opmerking: Ene extra onbehandelde plaat is nodig voor elk experiment voor de stroom besturingselementen voor de compensatie van de cytometrische.
  3. Incubeer de platen gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  4. Na serum verhongeren, door de cellen te oogsten door zachte schrapen of met behulp van 0,2 mM EDTA in PBS. Verzamel ze in gelabelde 5 mL ronde onderkant buizen en centrifuge hen bij 750 x g gedurende 5 min. bijhouden van welke cellen werden behandeld met lymfkliertest anti-BSA IgG1.
  5. Wassen cel pellets eenmaal met 2 mL PBS om zich te ontdoen van eventuele resterende anti-BSA van de behandelde cellen.
  6. Resuspendeer de pellet cel in 600 µL van lage serum DMEM.
  7. Van de 600 µL celsuspensie, aliquoot 200 µL in de vooraf gelabelde 5 mL ronde onderkant buizen als volgt:
    1. Neem vanaf de onbehandelde cellen, 200 µL voor buizen geëtiketteerd "ongestimuleerde" 200 µL voor buizen gelabelde "positieve inductor" en 200 µL voor buizen geëtiketteerd "positieve inductor + remmer"
    2. Behandelde cellen, neem vanaf de anti-BSA IgG1 200 µL voor buizen geëtiketteerd "FcγR crosslinking/FcγR XL" en 200 µL voor buizen geëtiketteerd "FcγR XL + remmer"
    3. Neem vanaf de onbehandelde cellen die moeten worden gebruikt voor compensatie besturingselementen, 200 µL voor de buis geëtiketteerd "onbevlekt ongestimuleerde", 200 µL voor de "groene + inductor" controle en 200 µL voor "oranje + inductor" controle.
      Opmerking: Als de cellen van 5.7.1- en 5.7.3-fouten te vermijden zijn afgeleid van de dezelfde muis, de dezelfde "onbevlekt ongestimuleerde" cellen kunnen worden gebruikt voor de controle van experimentele en compensatie. Zoniet, een extra 200 µL van cellen nodig zal zijn voor een "onbevlekt ongestimuleerde" experimentele controle voor een).
  8. Houden de buizen op ijs totdat de kleuring en stimulatie. Tijdens serum honger en binding van IgG1, bereiden de sondes, specifieke prikkels en inductoren zoals hieronder beschreven.
    Opmerking: Als het uitvoeren van de bepaling voor de eerste keer, als er geen sjabloon beschikbaar is, of geen schadeloosstelling van de na-de-feit is beschikbaar op de cytometer van de stroom en de bijbehorende software, stimuleren en vlek compensatie besturingselementen en voert deze op de cytometer van de stroom uit te voeren handmatige compensatie voorafgaand aan toevoeging van stimuli aan experimentele samples.

6. het uitvoeren van de bepaling

  1. 2 x positieve inductor oplossing bereid door verdunning van de 1:100 van de Pyocyanin in de 2 x sonde oplossing (bereid in stap 3.9) om op te halen van een concentratie van 2 x 500 µm van pyocyanin (eindconcentratie zullen 250 µM). Ook, verdund pyocyanin 1:100 in elk van de "groene alleen 2 x sonde de oplossing," en "2 x sonde oplossing, oranje alleen" buizen bereid in 3.10.
    Opmerking: Beide voorwaarden geëtiketteerd met "positieve inductor" en "positief inductor + remmer" zal worden behandeld met de positieve inductor. Plan dienovereenkomstig bij het berekenen van de hoeveelheid 2 x positieve inductor oplossing te bereiden. Bijvoorbeeld: als het uitvoeren van de test met 3 muizen, 6 voorwaarden (3 * 2) zullen worden behandeld met positieve inductor, zo bereiden 6 * 200 µL = 1,2 mL 2 x positieve inductor oplossing.
  2. Een 2 x BSA oplossing bereid door verdunning van de stockoplossing van de BSA in 2 x sonde oplossing voor het verkrijgen van een concentratie van 2 µg/mL (eindconcentratie is 1 µg/mL).
    Opmerking: Beide voorwaarden geëtiketteerd met "FcγR XL" en "FcγR XL + remmer" zal worden behandeld met de 2 x BSA oplossing. Plan dienovereenkomstig bij de berekening van het bedrag van de oplossing te bereiden. Bijvoorbeeld: als het uitvoeren van de bepaling met behulp van 3 muizen, 6 (3 * 2) voorwaarden zullen worden behandeld met BSA oplossing en dus 6 * 200 µL of 1,2 mL 2 x BSA oplossing nodig zullen zijn.
  3. Voordat u begint de specifieke stimulatie (FcγR crosslinking), door ervoor te zorgen dat alle reagentia en cellen klaar zijn. Plaats de buizen op ijs in de volgorde waarin dat ze zullen worden gestimuleerd.
  4. Voor flow cytometers met een autosampler, kennis te nemen van de tijd die de cytometer nodig heeft om te analyseren van één monster en ga naar de volgende, met inbegrip van mengen en sonde wassen stappen (bijvoorbeeld 3,5 min).
    Nota: de Timing is zeer kritisch is voor deze test. Voor elke voorwaarde worden goed gecontroleerd moet, de stimulatie worden uitgevoerd voor de exacte tijd (30 min) voor elke voorwaarde. Stimuleren van de cellen in de volgorde en de vertragingstijd tussen de verwerving van het monster door de stroom cytometer te nemen. Bijvoorbeeld, als de tijd die nodig is voor de cytometer analyseren van één monster en ga naar de volgende 3,5 min is, stimuleert cellen in de volgorde waarin die ze zullen worden geanalyseerd om 3,5 min.
  5. Als u handmatige compensatie op dit punt uitvoert, stimuleren controle buizen worden gebruikt voor compensatie (stap 5.7.3-fouten te vermijden). Voeg 200 µL van "2 x sonde oplossing, groene alleen" die inductor (van 6.1) bevat in de buizen gemarkeerd "groene + inductor" (stap 5.7.3-fouten te vermijden). Voeg 200 µL van "2 x sonde oplossing, oranje alleen" die inductor (stap 6.1) bevat in de buizen gemarkeerd "oranje + inductor" (stap 5.7.3-fouten te vermijden).
  6. Incubeer de cellen voor 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2 in donker.
  7. Met behulp van de stroom cytometry software, genereren en label 3 voorbeeldbestanden voor het besturingselement "onbevlekt, onbehandeld", "groene + inductor", en "oranje + inductor" monsters, ervoor te zorgen om aan te geven de kanalen/parameters te worden geanalyseerd (FSC SSC, FL1, FL2) en gewenste stop voorwaarden (100 µL, 3 min, enz.). Genereren en een soortgelijke set bestanden voor experimentele monsters label.
  8. Voer het "onbevlekt, onbehandelde" monster. Open een stip perceel voor FSC (op de x-as) vs SSC (op de y-as) en tekenen van een hek rond de cellen van belang zijn, met uitzondering van dode cellen en puin (dode cellen en puin zijn veel kleinere evenementen dan de belangrijkste celpopulatie en verschijnen op de linkerbenedenhoek van het perceel).
  9. Open met behulp van deze "cellen"-poort, een ander punt plot van FL1 (x-as) versus FL2 (y-as). Teken een eerste Kwadrant poort. De Kwadrant poorten zo instellen dat de gebeurtenissen worden weergegeven op het lagere linker kwadrant van de FL1 vs FL2 plot.
  10. Voer het "groene + inductor" monster. De kruisspanning zodat de gebeurtenissen worden weergegeven op de onderste links en rechts kwadranten van de FL1 vs FL2 plot. Deze compensatie matrix toepassen op alle 3 voorbeeldbestanden.
  11. Voer het "oranje + inductor" monster. Aanpassen van de spanning zodat de gebeurtenissen worden weergegeven op de bovenste en de onderste links van de kwadranten van de FL1 vs FL2 plot. Deze compensatie matrix toepassen op alle 3 voorbeeldbestanden.
  12. Controleer elk bestand compensatie en ervoor zorgen dat "onbevlekt, onbehandeld" gebeurtenissen worden weergegeven op het lagere linker Kwadrant, "groene + inductor" gebeurtenissen worden weergegeven op de lagere linker en rechter kwadranten, "oranje + inductor" gebeurtenissen worden weergegeven op de bovenste en de onderste links van de kwadranten van de FL1 vs FL2 plot. De matrix van compensatie gelden voor alle van de experimentele voorbeeldbestanden.
    1. Ervoor zorgen dat gepaste compensatie wordt toegepast op alle voorbeeldbestanden van de controle vóór het toepassen van de matrix met compensatie aan alle van de experimentele voorbeeldbestanden. Zie Figuur 2 voor representatieve gegevens tonen niet-gecompenseerde en correct gecompenseerd monsters.
      Opmerking: Vele cytometers aanwijzen FL1 als de standaard FITC/GFP kanaal (opgewonden door de blauwe 488 nm laser, en met een 530/30 filter set ontdekt) en FL2 als de standaard PE channel (opgewonden door de blauwe 488 nm laser, en met een 585/40 filter set ontdekt). We gebruiken dit hetzelfde Verdrag maar let op nieuwe stroom cytometry gebruikers overleg te plegen met hun stroom cytometry kern manager om ervoor te zorgen dat hun cytometer op dezelfde wijze is geconfigureerd en dat de daartoe geëigende kanalen worden gebruikt voor het detecteren van deze sondes. Afhankelijk van het model van de stroom cytometer en de bijbehorende software, is het mogelijk om uit te voeren van compensatie voor of na de monsters zijn verkregen. Als na-de-feit compensatie mogelijk is, kan de compensatie stap worden uitgevoerd nadat alle experimentele monsters hebben overgenomen door de cytometer. Voor cytometers met een dynamisch bereik, waar bet spanning aanpassingen niet nodig zijn, een experiment van de vergoeding kan ook worden uitgevoerd op een aparte dag en de experimentele sjabloon (met inbegrip van de vergoeding-matrix) kan worden opgeslagen om te verminderen de tijd die nodig is om uit te voeren handmatige compensatie.
  13. Zodra handmatige compensatie heeft verricht en een experimentele sjabloon wordt verkregen, beginnen met de behandeling van experimentele monsters. Vóór de behandeling met positieve inductor of FcγR cel stimulatie, markeren welke buizen krijgen ROS-remmer. Deze cellen met de ROS-remmer ten minste 30 min voorafgaand aan positieve inductor of FcγR stimulatie te behandelen.
  14. Als u wilt toevoegen de ROS-remmer, bereiden u een eindconcentratie van 5 mM door toevoeging van 1 µL van de Inhibitor van de omwenteling aan 200 µL geresuspendeerde cellen (zonder anti-BSA IgG1).
  15. De cellen met de stimulans (of positieve inductor) behandelen en laad de cellen met de ROS-sondes als volgt:
    1. Voor ongestimuleerde cellen: toevoegen van 200 µL van 2 x sonde oplossing zonder enige stimulans aan de 200 µL celsuspensie geëtiketteerd "gebeitst, ongestimuleerde".
    2. Voor de positieve controles: toevoegen van 200 µL van 2 x positieve inductor oplossing (bereid in stap 6.1) aan 200 µL celsuspensie geëtiketteerd "positieve inductor" of "positieve inductor + remmer".
    3. Voor cellen gestimuleerd door FcγR cross-linking (specifieke stimulus): 200 µL van 2 x BSA oplossing (bereid in 6.2) toevoegen aan 200 µL celsuspensie geëtiketteerd "Fcγr XL" of "FcγR XL + remmer".
      Nota: Herinner me om op te nemen van de vertragingstijd tussen de analyse van het monster door het toevoegen van stimulans om x min, waarbij x staat voor de vertragingstijd tussen de verwerving van één monster en de volgende.
  16. Incubeer de cellen voor 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2 in donker. Analyseer de monsters in de volgorde waarin die ze werden gestimuleerd met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een autosampler. De analyse-sjablonen gegenereerd tijdens de eerste compensatie stappen gebruiken. Cellen vóór de analyse niet wassen.

7. stroom cytometry data-analyse en verwachte resultaten

  1. Binnen de stroom cytometry software, open het eerder gegenereerde analysebestanden voor de experimentele monsters (sjablonen werden gegenereerd in stappen 6.7-6.12 en monsters werden uitgevoerd in stap 6.16). Zorg ervoor dat de compensatie-matrix van het uitvoeren van handmatige compensatie correct werd toegepast op de experimentele monsters.
    Opmerking: Voor flow cytometers en stroom cytometry software staat na-de-feit compensatie, als de matrix met compensatie niet eerder op de experimentele voorbeeldbestanden toegepast werd, toepassen op dit punt.
  2. Vergelijkbaar met het controleren van de juiste handmatige compensatie, ervoor zorgen dat de besturingselementen binnen de experimentele monsters zich gedragen zoals verwacht.
    1. Ervoor zorgen dat de gebeurtenissen "onbevlekt, onbehandelde" verschijnt op het lagere linker kwadrant van de FL1 vs FL2 plot, dat de "positieve inductor" gebeurtenissen tonen verhoogde fluorescentie in de linker bovenhoek, bovenste rechts, en lagere juiste kwadranten van de FL1 vs FL2 plot, en dat" positieve inductor + ROS-remmer"gebeurtenissen vertonen een vermindering van de fluorescentie in linker bovenhoek, bovenste rechts en rechts kwadranten van de FL1 vs FL2 perceel ten opzichte van de fluorescentie met de"positieve inductor"monster waargenomen te verlagen.
    2. Als de besturingselementen binnen de experimentele monsters vertonen geen verhoogde fluorescentie, controleren dat alle assay stappen zijn uitgevoerd, controleert u of de juiste generatie en priming van beenmerg-afgeleide macrofagen (2.7-2.19), en herhaal het experiment. Als binnen de experimentele monsters controles blijkt dat de verwachte trends, gaat u verder met het analyseren van experimentele monsters gestimuleerd door het FcγR (figuur 3A).
  3. Controleer of de FcγR-specifieke stimulus naar behoren functioneert. De volgende voorbeelden van een C57BL/6J WT muis uitvoeren: "onbevlekt ongestimuleerde", "gekleurd, ongestimuleerde", "gekleurd, gestimuleerd door de FcγR", en "gekleurd, gestimuleerd door de FcγR + ROS remmer". Deze komen overeen met monsters 4.2a, 4.2b, 4.2e en 4.2f in sectie 4, respectievelijk.
    1. Zorgen dat de gebeurtenissen "onbevlekt, ongestimuleerde" op het lagere linker kwadrant van de FL1 vs FL2 plot, verschijnt dat "gekleurd, ongestimuleerde" gebeurtenissen ook op het lagere linker kwadrant van de FL1 vs FL2 plot weergegeven wordt, dat "gekleurd, gestimuleerd door de FcγR" evenementen Toon meer fluorescentie in de linker bovenhoek, bovenste rechts, en lagere juiste kwadranten van de FL1 vs FL2 plot, en dat "gekleurd, gestimuleerd door de FcγR + ROS remmer" gebeurtenissen zal tonen daalde van fluorescentie in de linker bovenhoek, rechts bovenin en rechtsonder kwadranten van de FL1 vs FL2 plot in vergelijking met het "gebeitst, gestimuleerd door de FcγR" monster (figuur 3A).
    2. Indien niet aan deze verwachtingen wordt voldaan, bijvoorbeeld het "gebeitst, gestimuleerd door de FcγR" ziet u minimale of geen verhoogde fluorescentie in vergelijking met het "gebeitst, ongestimuleerde" monster, of het "gebeitst, ongestimuleerde" monster al toont duidelijk verhoogde niveaus van fluorescentie in vergelijking met het "onbevlekt, ongestimuleerde" monster, controleren dat alle assay stappen correct zijn uitgevoerd, controleert u of de juiste generatie, priming, en behandeling van BMDMs (2.7-2.19), en herhaal het experiment. Indien deze verwachtingen voldaan, gaat u verder met de analyse van de rest van de experimentele monsters.
      Opmerking: Cellen produceren ROS die met de groene-sonde (waterstofperoxide peroxynitriet, hydroxyl radicalen, stikstofmonoxide, peroxy radicalen, etc. reageren) zal verschijnen in de bovenste rechts en lagere juiste kwadranten van een logboek FL1 (x-as) ten opzichte van een logboek FL2 (y-as) stip plot. Cellen produceren ROS die met de oranje-sonde (hoofdzakelijk maar niet uitsluitend superoxide reageren) verschijnt in de twee bovenste kwadranten van een logboek FL1 (x-as) ten opzichte van een logboek FL2 (y-as) stip plot.
  4. Genereer afzonderlijke histogrammen, gated op de cellen van belang, voor de analyse van de FL1 en FL2 fluorescentie. Met behulp van de "onbevlekt, ongestimuleerde" monsters, genereren een histogram marker zodanig dat alle "onbevlekt, ongestimuleerde" gebeurtenissen worden weergegeven aan de linkerkant van deze markering. Dit perceel toepast met de markering op de rest van de experimentele monsters (figuur 3B).
  5. Presenteren de resultaten van het experiment als het percentage van de positieve cellen voor elk van de ROS-sondes of door aan te tonen van de fluorescentie van de gemiddelde intensiteit (MFI's) van de gestimuleerd monsters versus controle (Figuur 3 c).

8. celoppervlak kleuring in combinatie met flow cytometrische analyse van ROS productie (optioneel)

Opmerking: Deze stap biedt een protocol voor macrofagen kleuring met een marker celoppervlak voorafgaand aan de stimulatie van de FcγR en ROS meting. Dit kan zinvol zijn bij de beoordeling van ROS productie in gemengde cel populaties. Het is belangrijk om te kiezen van een antilichaam voor macrophage oppervlakte marker geconjugeerd met een passende fluor die niet met de fluorescentie van de oxidatieve stress of superoxide detectie reagentia interfereert. In dit protocol, wordt een antilichaam voor muis die F4/80 geconjugeerd met Alexa fluor 647 gebruikt.

  1. Genereren van BMDMs, oogst en prime hen zoals eerder beschreven (afdelingen 1 en 2).
    Opmerking: Een minimum van drie 6 cm platen nodig zijn om uit te voeren van alle experimentele besturingselementen en voorwaarden zoals hieronder beschreven. Ene plaat zal worden behandeld met anti-BSA IgG1 terwijl serum honger terwijl de andere twee platen blijft onbehandeld.
    1. 4 experimentele besturingselementen die zal worden gebruikt voor cytometrische stroomcompensatie (per experiment) bevatten:
      a) onbevlekt en ongestimuleerde cellen.
      b) cellen behandeld met de oxidatieve stress detectie reagens (groen-reagens) en ROS inductor.
      c) cellen behandeld met de superoxide detectie reagens (oranje-reagens) en ROS inductor.
      d) cellen gekleurd alleen met anti-muis die F4/80 geconjugeerd met Alexa 647.
    2. Voor elke muis of biologische repliceren, omvat de volgende 3 voorwaarden:
      a) gekleurd met F4/80 en links ongestimuleerde
      b) gekleurd met F4/80 en geactiveerd door de FcγR
      c) gekleurd met F4/80 en geactiveerd door de FcγR en behandeld met ROS-remmer
  2. Na de macrofagen priming's nachts, het supernatant gecombineerd. Wassen van de cellen een keer met 1-2 mL PBS. Serum verhongeren de cellen door de media te vervangen door een gelijk volume laag serum DMEM. Voor elke muis, één plaat zal worden behandeld met anti-BSA IgG1 terwijl het serum verhongeren, terwijl de andere twee platen zal worden onbehandeld. Incubeer de platen gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  3. Na serum verhongeren, door de cellen te oogsten door zachte schrapen of met behulp van 0,2 mM EDTA in PBS. Verzamelen van elke plaat in gelabelde 5 mL ronde onderkant buizen en centrifuge hen bij 750 x g gedurende 5 min. bijhouden van welke cellen werden behandeld met lymfkliertest anti-BSA IgG1.
  4. Wassen cel pellets een keer met 1-2 mL PBS om zich te ontdoen van eventuele resterende anti-BSA van de behandelde cellen.
  5. Resuspendeer één van de pellets van de cel van de plaat die kreeg niet anti-BSA IgG1 in 600 µL van lage serum DMEM. Deze cellen zal niet onderworpen aan het oppervlak vlekken van cel. Gebruik deze voor compensatie besturingselementen. Aliquot 200 µL van deze celsuspensie in (3) 5 mL ronde onderkant buizen gelabelde a) onbevlekt, ongestimuleerde b) groene oxidatieve stress reagens ROS inductor, c) oranje superoxide detectie reagens + ROS inductor.
  6. 1, in 300 µL van stroom cytometry kleuring buffer resuspendeer één van de cel van de plaat die kreeg niet anti-BSA pellets IgG (PBS + 0,1% FBS). Aliquot 100 µL van deze celsuspensie in (2) 5 mL ronde onderkant buizen voor de kleuring met Alexa 647-antimuis F4/80.
  7. Resuspendeer de pellets van de cel van de plaat die anti-BSA IgG1 in 300 µL van stroom cytometry kleuring buffer ontvangen. Aliquot 100 µL van deze celsuspensie in (2) 5 mL ronde onderkant buizen voor de kleuring met Alexa 647-antimuis F4/80.
  8. Vlek van de cellen, die aliquoted in 8.6 en 8.7, met 5 µL van Alexa 647-antimuis F4/80 voor 30 minuten op het ijs, in het donker werden.
  9. Na kleuring, wassen cellen door toevoeging van 2 mL PBS en centrifuge aan 750 x g, gecombineerd het supernatant en resuspendeer elke buis in 200 µL van lage serum DMEM zonder fenol rood. Braaklegging een onbehandelde buis om te dienen als afzonderlijk gebeitst FL4 controle. Bereiden sondes, inductor, FcγR stimulans en ROS-remmers zoals aangegeven in de secties 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 en 6.14.
    1. Voor cellen niet ontvangen anti-BSA IgG1, buizen met het volgende label: een) geen stimulans of b) ROS inductor.
    2. Voor cellen die anti-BSA ontvangen IgG1, met het volgende label: een) Fc XL of b) Fc XL + remmer.
  10. Het stimuleren van de monsters moet worden gebruikt voor vergoeding volgens hun respectievelijke behandelingen zoals aangegeven in 6,5-6,6, in de volgorde waarin ze op de stroom cytometer, waarin de vertragingstijd tussen de verwerving van één monster en het volgende zal worden gelezen.
  11. Incubeer de cellen voor 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2 in donker. Analyseer de monsters in de volgorde waarin die ze werden gestimuleerd met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een autosampler.
  12. Handmatige compensatie als beschreven in 6,7-6.12 en data analyse zoals beschreven in sectie 7 uit te voeren.
  13. Met behulp van de stroom cytometry software, genereren en 4 voorbeeldbestanden voor het besturingselement label "onbevlekt, onbehandeld", "groen + inductor", "oranje + inductor" en "F4/80 gekleurd" monsters, ervoor te zorgen om aan te geven de kanalen/parameters om te worden geanalyseerd (FSC SSC, FL1, FL2, FL4) en voorwaarden van de gewenste stop (100 µL, 3 min, enz.).
  14. Uitvoeren van de monsters en genereren van dot percelen voor het uitvoeren van handmatige compensatie.
    1. Voor de cel-oppervlakte kleuring, het genereren van twee bijkomende waarnemingspunten: FL1 (x-as) versus FL4 (y-as) en FL2 (x-as) versus FL4 (y-as). Pas de spanningen om ervoor te zorgen dat passende compensatie wordt toegepast, zoals wordt weergegeven in figuur 7A. Zodra alle vergoedingen correct is uitgevoerd, gelden de matrix met compensatie voor alle van de experimentele voorbeeldbestanden.
  15. Zodra handmatige compensatie heeft verricht en een experimentele sjabloon wordt verkregen, beginnen met de behandeling van experimentele monsters zoals aangegeven in 6.13-6.15.3 en verwerven van de monsters op een stroom cytometer zoals beschreven in 6.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van het protocol beschreven binnen, presenteren we representatieve gegevens aan stroom cytometrische detectie van ROS productie als gevolg van stimulering van WT C57BL/6J BMDMs door de FcγR te tonen. Zoals verwacht, we waarnemen minimale wijzigingen in FL1 of FL2 fluorescentie boven het niveau van de achtergrond in ongestimuleerde cellen (figuur 3A, vergelijk "gebeitst, ongestimuleerde" vs "onbevlekt, ongestimuleerde" dot percelen). We constateren een aanzienlijke toename in FL1 en FL2 fluorescentie wanneer cellen worden gestimuleerd met FcγR dwarsbinding agent (figuur 3A, vergelijk "gekleurd en gestimuleerd via Fc dwarsbinding" monsters vs "gebeitst, ongestimuleerde" dot percelen). Ten slotte wanneer cellen werden behandeld met ROS-remmer voorafgaand aan FcγR dwarsbinding, deze verhoogde fluorescentie is teruggebracht tot een basaal niveau (figuur 3A, vergelijk "gekleurd en behandeld met ROS-remmer en gestimuleerd via Fc dwarsbinding" vs "gekleurd en gestimuleerd via Fc dwarsbinding"dot percelen). Dit is ook duidelijk wanneer gegevens worden gepresenteerd als een histogram voor elk kanaal (figuur 3B) of wanneer de gegevens worden gepresenteerd als een percentage van cellen positief voor beide de groene of oranje ROS sondes (Figuur 3 c). Een soortgelijke trend is ook duidelijk wanneer gegevens worden gepresenteerd als MFI, hoewel de afname van de oranje fluorescentie met voorbehandeling met ROS-remmer niet zo goed gevangen is wanneer gepresenteerd als MFI versus in procenten (afbeelding 3 c). Ook presenteren we de resultaten van 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd op verschillende dagen (Figuur 3, Experiment 1, 2 en 3). De gemiddelde waarden en bijbehorende standaardfout van het gemiddelde worden in de grafieken (Figuur 3 c) aangegeven.

Ook presenteren we mislukte experimenten, waar suboptimale ROS productie als gevolg van de stimulatie van de FcγR werd waargenomen (Figuur 4). Een minimale toename van de FL1 en FL2 fluorescentie werd ontdekt bij het vergelijken van "gekleurd en gestimuleerd via Fc dwarsbinding" monsters vs "gebeitst, ongestimuleerde" monsters (figuur 4A, B, C). Dit wordt gepresenteerd naast een succesvolle experiment om te wijzen op de grote verschillen tussen de verwachte percentages of verhogingen van de MFI's en de waargenomen waarden in de mislukte experiment.

Het huidige protocol maakt gebruik van een 24u priming stap. Bij het vergelijken van een 24u versus een 48u priming tijd, zien we geen duidelijk verschil in het percentage cellen positief voor de groene, oxidatieve stress-reagens (figuur 5A, top histogrammen en figuur 5B groene sonde, % positief). Maar verhoging steeds meer priming tot 48 h heb van het percentage cellen positief voor de oranje fluorescentie (figuur 5A, lagere histogrammen en figuur 5B oranje sonde, % positief). Dit kwam ook tot uiting wanneer gegevens werd gepresenteerd als MFI. Dit suggereert dat voor de optimale detectie van alle soorten van de ROS, tegelijk priming 48u kan meer ideaal.

Gezien het feit dat, als gevolg van de kosten of de tijd die nodig is voor experimenteren, gebruik van een kit voor het uitvoeren van deze test niet mogelijk een optie. Om deze reden we ook soortgelijke onderdelen die in de kit getest en deze van standaard leveranciers (Thermofisher, EMD Millipore, Cayman) gekocht. Wij vinden dat onderdelen en hetzelfde experimentele protocol voor cel laden met behulp van afzonderlijk aangeschaft en FcγR stimulatie, kunnen we veel van de dezelfde bevindingen die we waargenomen met behulp van de kit (figuur 6A, B) recapituleren. Echter, hoewel er stijgingen van de fluorescentie blijkt met stimulatie waren, een hoger niveau van ROS productie werd waargenomen met behulp van de kit. Dit kan erop duiden dat gebruik van individueel verkregen onderdelen mogelijk, maar zou moeten verder worden geoptimaliseerd voor deze specifieke assay.

Tot slot, wij laten zien dat het ook mogelijk om te combineren met het celoppervlak kleuring met deze sondes ROS. We gebruiken een bekende macrofaag marker, F4/80, geconjugeerd met Alexa 647 en celoppervlak kleuring voorafgaand aan de behandeling met ROS-remmer, ROS inductor of specifieke stimuli voor het opwekken van ROS productie uit te voeren. We laten zien in figuur 7B , die macrofagen reageren zoals verwacht wanneer behandeld met FcγR crosslinking agent en FcγR crosslinking agent + ROS-remmer (figuur 7B, oranje vs groene stip percelen). Anderzijds kunnen we zien meer oranje of groene fluorescentie specifiek gegenereerd door de F4/80 het label cellen op een behandeling met FcγR crosslinking agent en verminderd met de voorbehandeling met ROS-remmer (Figuur 7B, F4/80-vs groen en F4/80 vs oranje stip percelen).

Figure 1
Figuur 1: Flow cytometrische beoordeling van passende generatie BMDMs. Wild type BMDMs werden gegenereerd en bleven onbevlekt of gekleurd met FITC anti-muis F4/80 of Alexa 647 anti-muis CD11b. FSC (x-as) vs SSC (y-as) percelen werden gegenereerd en macrofagen (BMDMs) werden gated om dode cellen en puin te sluiten. Met behulp van een perceel van FSC-H(x-axis) vs FSC-A (y-as), werd een singlet-gate gegenereerd. Gating op Onderhemden, histogrammen werden gegenereerd om aan te tonen van cellen gekleurd met beide FITC F4/80 of APC CD11b in vergelijking met de isotype gebeitst controle. A) juiste BMDM differentiatie met meer dan 95% van de cellen positieve kleuring voor CD11b of F4/80. B) onjuiste BMDM differentiatie waar minder dan 95% van de cellen zijn positieve kleuring voor F4/80 en 2 pieken zijn aanwezig voor CD11b. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Uitvoeren van compensatie wanneer met behulp van groene en oranje ROS sondes. Compensatie vergt onbevlekt onbehandelde cellen, cellen gekleurd met groene ROS sonde en behandeld met ROS inductor en cellen gekleurd met oranje ROS sonde en behandeld met ROS inductor. Dot plots voor onbevlekt onbehandelde cellen worden gebruikt om te bepalen van Kwadrant poorten. Gegevens voor cellen afzonderlijk gekleurd met beide sonde ROS groene of oranje ROS sonde en behandeld met ROS inductor worden weergegeven vóór en na, compensatie werd toegepast. De matrix met compensatie wordt vervolgens toegepast op alle volgende experimentele monsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Meting van ROS in antwoord op specifieke FcγR stimulatie met groene en oranje ROS sondes en beoordelingvan assay reproduceerbaarheid. Wild-type beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) werden gegenereerd, primer, en bleven onbevlekt of gekleurd met een cocktail van groen en oranje ROS sondes. Gekleurd BMDMs bleven of onbehandeld, gestimuleerd door middel van hun FcγRs met behulp van lymfkliertest anti-BSA IgG1 + BSA voor 30 min, of behandelde met ROS-remmer voorafgaand aan stimulatie via FcγR dwarsbinding. A) Dot percelen, tonen een verhoging in de percentages van de cellen in de linksboven, rechtsboven, en lagere juiste kwadranten op specifieke FcγR stimulatie, die in het bijzijn van ROS-remmer wordt verminderd. B) histogrammen van elk kanaal van de fluorescentie, waaruit blijkt dat de poort van de marker om te bepalen van cellen positief voor elke sonde. C) presentatie van de gegevens als een percentage van cellen positief voor elke sonde of als een toename van de MFI. Drie onafhankelijke, representatieve experimenten worden gepresenteerd. Het gemiddelde voor de 3 experimenten en standaardfouten van de gemiddelde worden weergegeven als lijnen binnen de grafieken. FC XL, Fc dwarsbinding; NAC, N-acetyl-L-cysteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Voorbeelden van succesvolle en suboptimaal FcγR stimulatie. Wild-type beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) werden gegenereerd, primer, en bleven onbevlekt of gekleurd met een cocktail van groen en oranje ROS sondes. Gekleurd BMDMs bleven of onbehandeld, gestimuleerd door middel van hun FcγRs met behulp van lymfkliertest anti-BSA IgG1 + BSA voor 30 min, of behandelde met ROS-remmer voorafgaand aan stimulatie via FcγR dwarsbinding. Representatieve resultaten voor succesvolle en suboptimaal stimulatie worden weergegeven als A) stip percelen, histogrammen B) of C) het percentage cellen positief voor elke sonde of als een toename van de MFI. Succesvolle stimulatie toont verhoogd fluorescentie in de linker bovenhoek, bovenste rechts en lagere juiste kwadranten van de FL1 vs FL2 plot en verhoogd MFI en percentage positieve cellen gekleurd met elke sonde bij stimulatie van de FcγR. Minimale stijging vertoont suboptimaal stimulatie in MFI of percentage positieve cellen. FC XL, Fc dwarsbinding; NAC, N-acetyl-L-cysteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Effect van priming tijd op ROS generatie op FcγR stimulatie. BMDMs werden gegenereerd, primer voor 24 of 48 h, en bleven onbevlekt of gekleurd met een cocktail van groen en oranje ROS sondes. Gekleurd BMDMs bleven of onbehandeld, gestimuleerd door middel van hun FcγRs met behulp van lymfkliertest anti-BSA IgG1 + BSA voor 30 min, of behandelde met ROS-remmer voorafgaand aan stimulatie via FcγR dwarsbinding. A) histogrammen voor de fluorescentie geïnduceerd door elke sonde bij stimulatie van de macrofagen primer voor 24 of 48 h. B) Percentage cellen positief voor elke sonde bij stimulatie van de macrofagen primer voor 24 of 48 h. Priming macrofagen voor 48u resulteerden in een stijging in percentage van cellen positief voor Oranje fluorescentie (of een toename van de MFI voor het kanaal FL2) t.o.v. priming de macrofagen gedurende 24 uur. Het gemiddelde voor de 3 experimenten en standaardfouten van de gemiddelde worden weergegeven als lijnen binnen de grafieken. FC XL, Fc dwarsbinding; NAC, N-acetyl-L-cysteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Cytometrische ROS meting op FcγR dwarsbinding stromen met behulp van reagentia van verschillende leveranciers. BMDMs werden gegenereerd, primer voor 24u, en bleven onbevlekt of gekleurd met een cocktail van oxidatieve stress en superoxide detectie sondes. Gekleurd BMDMs waren beide links onbehandeld, gestimuleerd met ROS inductor, gestimuleerd door hun FcγRs met behulp van lymfkliertest anti-BSA IgG1 + BSA voor 30 min, of behandeld met ROS-remmer voorafgaand aan stimulatie via FcγR dwarsbinding. Sondes, ROS inductor en ROS-remmer waren ofwel uit de kit gebruikt of werden apart aangekocht van verschillende leveranciers en gebruikt op een soortgelijke concentratie. A) Dot percelen weergegeven: een side-by-side vergelijking van de resultaten verkregen met behulp van de kit en niet-kit onderdelen. B) histogrammen tonen een side-by-side vergelijking van de resultaten verkregen met behulp van de kit en niet-kit onderdelen. FC XL, Fc dwarsbinding; NAC, N-acetyl-L-cysteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7. Combineren celoppervlak kleuring met stroommeting cytometrische van ROS productie op FcγR dwarsbinding. A) Dot plots voor de verschillende TL kanalen met onbevlekt of afzonderlijk gebeitst compensatie besturingselementen. Wild-type BMDMs werden gegenereerd, primer voor 24u, en bleven onbevlekt, gekleurd met Alexa 647-antimuis F4/80 alleen gekleurd met groene ROS sonde alleen en behandeld met ROS inductor of gekleurd met oranje ROS sonde alleen en behandeld met ROS inductor. Dot plots voor onbevlekt onbehandelde cellen worden gebruikt om te bepalen van Kwadrant poorten. Percelen tonen verwachte resultaten als kanalen correct worden gecompenseerd. De matrix met compensatie werd vervolgens toegepast op alle latere experimentele monsters. B) Wild-type BMDMs werden gegenereerd, primer voor 24u en gekleurd met Alexa 647-antimuis F4/80. Daarna, waren BMDMs ofwel links ongestimuleerde, gestimuleerd door hun FcγRs met behulp van lymfkliertest anti-BSA IgG1 + BSA voor 30 min, of behandeld met ROS-remmer voorafgaand aan stimulatie via FcγR dwarsbinding. Dot plots aantonen dat groen of oranje fluorescentie speciaal geproduceerd door F4/80 cellen kan worden gedetecteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DCFH2-DA- en DHE gebaseerde detectie van ROS is een veel gebruikte techniek14,15. Gebruiksgemak en het aanpassingsvermogen van deze ROS sondes voor kinetische microplate formaten, fluorescentie microscopie of stroom cytometrische analyse heeft bijgedragen tot hun populariteit. Echter in onze studies FcγR-gemedieerde macrofaag functies lijkt er niet te worden een standaardprotocol voor het uitvoeren van deze test voor flow cytometrische analyse FcγR kruislings gekoppelde cellen. Gezien de reactieve aard van de analyten wordt beoordeeld, hebben we gevonden dat timing van cruciaal belang is om ervoor te zorgen dat de reproduceerbaarheid wordt bereikt. Hoewel we hebben ook kinetische microplate testen uitgevoerd, kan er een grote variabiliteit in de intensiteit van de fluorescentie van experiment naar experiment, waardoor het moeilijk is om de totale biologische repliceert voor statistische analyse. Stroom cytometrische gebruik van deze sondes voorziet kwantificering van "ROS positieve" cellen die sommige van deze kwesties worden opgelost, maar is niet zonder complicaties. Dit geldt met name bij het gebruik van een cytometer van de stroom voorzien van een autosampler. Analyse van een groot aantal monsters zal in dit geval invloed op de hoeveelheid tijd die de cellen worden blootgesteld aan verschillende prikkels. Om te verhelpen dit, hebben we de vertragingstijd tussen monster analyse opgenomen in het protocol om ervoor te zorgen dat de analyse wordt uitgevoerd op de cellen gestimuleerd voor een vergelijkbare hoeveelheid tijd.

Een andere belangrijke factor in flow cytometrische ROS analyse is de integratie van passende controles. Het kan niet worden overschat dat elk experiment (ten minste) alle de experimentele moeten en compensatie besturingselementen maken een wij van dit protocol lijst. Deze zijn belangrijk om ervoor te zorgen de geldigheid van elk experiment evenals holdingsvolumes kunnen terecht uitsluiten monsters indien nodig. Enkele voorbeelden hiervan zijn als macrofagen niet onderscheiden / op passende wijze rijpen deed en veel lagere ROS productie zelfs met inductor behandeling tentoongesteld. Een ander geval zou ongepast activering van macrofagen zelfs vóór FcγR dwarsbinding, wat resulteert in een hoge basale ROS signaal. Gebruik van ROS-remmers in combinatie met specifieke FcγR cross-linking weergegeven: verdwijning van fluorescerende signalen is een ander belangrijk besturingselement die we hebben vaak gevonden ontbreekt in andere studies soortgelijk tests uitvoeren. De ROS-remmer gebruikt in deze studie, N-acetyl-L-cysteïne, wordt beschouwd als een universele ROS-remmer. Echter als men is geïnteresseerd in ROS geproduceerd door specifieke enzymen, kunnen andere specifieke ROS-remmers worden opgenomen in de bepaling eveneens. Enkele voorbeelden zijn mefanamic zuur (cyclooxygenase-afhankelijke ROS remmer), apocynin (NADPH oxidase-afhankelijke ROS remmer) of allopurinol (een xanthine oxidase-afhankelijke ROS-remmer).

Het is bovendien belangrijk om te begrijpen wat eigenlijk wordt gemeten in deze uitlezing. Zoals eerder vermeld, DCFH2-DA meet meerdere ROS-soorten, en dus, fluorescentie die voortvloeien uit de groene sonde kan niet worden gebruikt om te discrimineren één ROS soort van een andere14. Ook kan de oranje sonde (waarschijnlijk DHE), hoewel vaak aangehaald als superoxide specifieke producten voortbrengen beide superoxide-specifieke en superoxide-onafhankelijke oxidatie, die niet kunnen worden onderscheiden zonder gebruik te maken van aanvullende technieken zoals HPLC 15. voor de toepassing van het meten van de "totale ROS" of "geïnduceerde ROS" tijdens de Ademhalings-burst, gebruik van deze sondes naast de juiste besturingselementen, kan wel aanvaardbaar. Veel nieuwe TL gebaseerde ROS sensoren naar voren zijn gekomen of zijn ontwikkelde11,,13. Sommigen, zoals de redox-sensitive fluorescente proteïnen, hebben het voordeel van een dynamische meting van ROS productie als gevolg van hun omkeerbare oxidatie. Dit zou echter genetische manipulatie van cellen, die wellicht niet altijd mogelijk of gewenst. In veel gevallen, fluorescente sonde gebaseerde ROS detectie is nog steeds een geldig en nuttig hulpmiddel, zolang het experiment gestandaardiseerde, goed gecontroleerde is, en de conclusies afgeleid van dergelijke experimenten niet worden overschat.

De voordelen voor het gebruik van deze verkrijgbare ROS-kit is dat alle benodigde reagentia zoals ROS inductoren aaseters en milliliters gestelde sondes worden opgenomen en "ready-to-use". Als de periode van experimenten naar verwachting kort te houden (voltooid binnen een week), kan deze kit bieden een meer kosteneffectieve methode voor het uitvoeren van stroom cytometry gebaseerde ROS detectie zonder de noodzaak om te kopen of elke specifieke component individueel te optimaliseren. Wij bovendien aantonen met behulp van deze kit met een specifieke agonist (FcγR stimulatie) en demonstreren van reproduceerbaarheid over experimenten; We beoordelen van de effecten van priming tijden op de generatie van de ROS; We vergelijken met soortgelijke sondes, remmers en inductoren van verschillende bedrijven; We bieden voorbeelden van mislukte experimenten; en tot slot, we combineren celoppervlak kleuring met gebruik van deze sondes ROS. Dit zou mogelijk maakt voor simultane detectie van ROS van verschillende celtypes binnen een gemengde bevolking, waarbij minder monster en reagentia. Bijvoorbeeld, zou dit bijzonder nuttig wanneer differentiëren tussen de macrofaag en neutrofiele afkomstige ROS, de belangrijkste celtypen in staat is te reageren op FcγR afbinding. Voor meerdere experimenten die moeten worden uitgevoerd met lange tussenliggende periodes tussendoor, gebruik van een kit mogelijk niet zo ideaal. Meerdere aliquots van de sondes zijn niet geleverd en zodra gereconstitueerd, alleen de fabrikant aanbeveelt dat de reagentia worden gebruikt binnen een week (zoals ROS sondes zijn zeer reactief). Als verwacht wordt dat deze periode niet compatibel met experimenteren is, raden we dat individuele reagentia in plaats van een kit worden apart hebt gekocht en gereconstitueerd alleen tijdens de dag van experimenten. Zoals we hier laten zien, kan verdere optimalisatie van de afzonderlijk aangeschafte onderdelen bovendien nodig zijn voorafgaand aan de test. Over het geheel genomen, wij hopen dat dit werk een nuttige bron voor onderzoekers met behulp van stroom cytometry biedt om reproducibly maatregel ROS generatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

De auteurs bedank andere leden van de Tigno-Aranjuez Lab waaronder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy en Roopin Singh voor hun hulp bij het laboratorium onderhoud en muis onderhoud van de kolonie. Steun voor dit onderzoek werd voorzien door grant R00 HL122365 en Start-up middelen naar J.T.T-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Tags

Immunologie en infecties probleem 145 reactieve zuurstof soorten (ROS) stroom cytometry met Fc gamma receptor (FcγR) Fc receptoren macrofagen respiratoire burst
Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter