Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

Denne studien demonstrerer bruken av flowcytometri å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) produksjon skyldes aktivering av FcγR. Denne metoden kan brukes til å vurdere endringer i antimikrobielle og redoks signalnettverk funksjon av phagocytes immun komplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.

Abstract

Oksidativt eller respirasjonssykdommer utbrudd brukes til å beskrive raske forbruket av oksygen og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS) av phagocytes svar på ulike immun stimuli. ROS genereres under immun aktivisering utøver potente antimikrobielle aktivitet primært gjennom evne til ROS å skade DNA og proteiner, forårsaker død av mikroorganismer. Å kunne måle ROS produksjon reproduserbar og Peterkirken er nødvendig for å vurdere bidrag av ulike veier og molekyler til denne mekanismen av vert forsvar. I dette papiret, vi demonstrerer bruken av fluorescerende sonder og flow cytometri for å oppdage ROS produksjon. Selv om mye brukt, er fluorescerende måling av ROS svært problematisk, særlig med hensyn til måling av ROS av bestemt og ikke mitogenic stimuli. Vi presenterer en detaljert metodikk for å oppdage ROS generert spesiell FcγR stimulering med macrophage generasjon grunning, flekker, FcγR cross-linking og slutter med flyt cytometric analyse.

Introduction

Reaktive oksygen arter (ROS) er reaktive molekyler eller frie radikaler som er biprodukter i aerobic åndedrett (omtalt i 1). Disse inkluderer den superoxide anion peroxide, hydrogen peroxide, hydroksyl radikale og hydroksyl ioner, blant andre. Under normale fysiologiske, ROS produseres hovedsakelig av mitokondrier og nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH) oxidases og er raskt detoxified av ulike enzymer og proteiner som superoxide dismutase og glutation. En overdreven produksjon av ROS eller feil kan fjerne ROS kan føre oksidativt stress, der frie radikaler fremme skade av proteiner og lipider DNA som fører til mobilnettet stress eller død og patologisk sykdomstilstander. Men er det for tiden verdsatt at ROS kan også fungere som signalnettverk molekyler (redoks signalisering), og ROS-mediert endring av ulike molekyler og veien mellomprodukter kan påvirke cellenes stoffskifte, spredning, overlevelse, inflammatorisk signalisering og aldring2. Phagocytic cellene: ROS spiller en viktig rolle i å gi antimikrobielle aktivitet under såkalte "åndedretts brast"1,3,4,5,6. Under responsen av phagocytes på eksterne stimuli translocate komponenter i den NADPH oksidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra stoffer til phagosomal membranen som inneholder gp91phox og p22phox tenkes, og sammen med handlinger Rac1/2, en fullt funksjonell NADPH oksidase enzym komplekse. Den sammensatte NADPH oksidase benytter deretter NADPH for å redusere oksygen til superoxide innen den phagosomal vacuole. Superoxide anioner kan direkte forårsake skade eller bli dismutated i hydrogenperoksid. Både superoxide og hydrogen peroxide kan reagere med andre molekyler å generere svært reaktive hydroksylradikaler. Skade er formidlet av reaksjonen av disse ROS med jern-svovel klynger på proteiner eller forårsaker base oksidasjon av DNA, slutt fører til begrenset mikrobiell metabolisme eller død av mikrobe5. Betydningen av NADPH oksidase enzym komplekse og ROS produsert under respiratory utbrudd illustreres klinisk hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD har mutasjoner i gp91phox, noe som resulterer i mangel på ROS produksjon og mottakelighet for tilbakevendende infeksjoner med bakterier og sopp som ikke vanligvis er et problem med immunkompetente personer. Derfor om studere oksidativt stress, redox signalering eller vert forsvar, å kunne måle er ROS produksjon i sanntid en nyttig oppgave.

Flere analyser har vært benyttet til mål ROS produksjon eller resultatet av oksidativt stress11,12,13. Blant disse er en av de mest brukte lysstoffrør sonde 2, 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Dette molekylet er fargeløs og lipofile. Spredningen av DCFH2-DA over cellemembranen kan det følges av intracellulær esterases, som deacetylates det i DCFH2, gjengi det celle ugjennomtrengelig. Handlingene til flere typer ROS (hydrogenperoksid, peroxynitrite, hydroksylradikaler, nitrogenoksid og peroxy radikaler) på DCFH2 oksidere det i DCF som er fluorescerende (rapporterte Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan oppdages ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med en standard filtersettet for fluorescein (FL1-kanal). Superoxide reagerer ikke sterkt med DCFH2 , men kan reagere med en annen sonde dihydroethidium (DHE) å gi fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxide uavhengig oksidasjonsprodukter)15. Fluorescerende produkter av DHE oksidasjon kan oppdages ved hjelp av en eksitasjon bølgelengden til 518 nm og et utslipp bølgelengden til 605 nm (FL2 kanal). Selv om det er relativt enkel å bruke, krever utnyttelse av disse sonder deteksjon av ROS kunnskap om sine begrensninger og forsiktig innlemmelse av flekker prosedyrer og kontroller i bestemte analysen utføres for å ha gyldig eksperimentell resultater og konklusjoner. Følgende protokollen demonstrerer bruken av en kommersielt tilgjengelig kit ansette disse 2 sonder laget for å måle ROS av flowcytometri. Vi flekken primet Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med disse sonder og indusere ROS produksjon gjennom FcγR cross-linking. Vi presenterer representant data innhentet bruker denne protokollen og stress forsiktighetsregler som må foretas for vellykket eksperimentering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for dyr håndtering ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk committee (IACUC) av University of Central Florida.

1. generasjon av benmarg avledet makrofager (BMDMs)

  1. Kultur medier forberedelse
    1. Forberede D10F base media: Å Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM), legge til 10% varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 0.05 mM β-mercaptoethanol.
      Merk: Selv om det er best å bruke fersk D10F media, D10F base media kan tilberedes opp til to uker i forveien brukes til flere eksperimenter innen en uke. En mus er rundt 175 mL D10F base medier nødvendig (25 mL å spyle bein) og 150 mL å macrophage differensiering media
    2. Forberede LADMAC vekst medier: til Eagle's Minimum viktig Medium (EMEM), legge til 10% varme inaktivert FBS og 2 mM L-glutamin. Forberede medier frisk, dagen du planlegger å starte din kulturer.
      Merk: En liter LADMAC vekst medier fører ca (19) 50 mL dele LADMAC-conditioned medier.
    3. Forberede komplett DMEM medier: DMEM, legge til 10% varme inaktivert FBS og 1 x antibiotika-Antimycotic. Forberede medier frisk, dagen BMDMs vil bli høstet.
      Merk: For en mus, rundt 100 mL DMEM komplett medier vil være nødvendig. Dette omfatter medier som brukes til grunning cellene.
  2. Utarbeidelse av LADMAC betinget medium
    1. Vokse LADMAC celler til confluency i 10 cm parabol med 10 mL LADMAC vekst medier (definert i 1.1.2). Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. På confluency, koble celler av kraftig dispenser media over cellene. Passasjen celler ved å legge til 1 mL av frittstående celler i T-175 flasker som inneholder 100 mL LADMAC vekst medier. Inkuber celler til helt confluent ved 37 ° C, 5% CO2 (ca en uke). På denne måten en 10 cm rett kan gi ti T-175 flasker eller ca 1 L betinget media.
    3. Når cellene er klar, samle betinget media og sentrifuger 350 x g for 5 min til pellets uønskede celler. Filtrerer de innsamlede supernatants gjennom et 0.2 mm filter og lagre 50 mL dele på-80 ° C. Dele LADMAC-conditioned media kan holdes på-80 ° C i måneder med minimale tap av aktivitet.
      Merk: Hvis store eksperimenter er forventet, klargjør store grupper av LADMAC-conditioned medier samtidig å sikre konsekvens. Hvis dette ikke er mulig, kan du bruke dele avledet fra samme batch eller masse LADMAC-conditioned medier for hvert eksperiment.
  3. Forberedelse av benmarg avledet makrofager
    1. På dagen for eksperimentet, forberede frisk macrophage differensiering media ved å legge til 25% av LADMAC betinget media i tidligere forberedt D10F medier (1 del LADMAC betinget medier inn i 3 deler D10F). Ikke forberede dette mediet på forhånd! Bare forberede så mye media behov for BMDM kultur.
    2. Dag 1: isolere musen bein margtransplantasjon celler i henhold til tidligere beskrevet protokollen16 med en modifisering å spyle benmargen fra femurs og tibias bruker D10F base medier. Bruk 2,5 mL av D10F media for å spyle hver ende av (4) bein. Tømme bein margtransplantasjon celler direkte inn i en pre våt 40 mm celle sil plasseres over en 50 mL tube. Gjenværende media (~ 5 mL) kan brukes til å rense ut celle silen.
    3. Sentrifuge samlet bein margtransplantasjon celler 350 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend cellene i totalt 30 mL macrophage differensiering medier (per mus).
    4. Forberede og etiketten (6) sterilt 10 cm Petri retter. Plate 5 mL macrophage differensiering medier i hver i Petriskål. Aliquot 5 mL resuspended beinmargen celleområde i macrophage differensiering media hver Petriskål for et totalt volum på 10 mL per fat. Inkuber 5 dager på 37 ° C, 5% CO2.
    5. Dag 5: Sug opp medier fra cellene. Vask en gang med 1-2 mL PBS og tilsett 10 mL av nylagde macrophage differensiering media. Inkuber ekstra 3 dager.
    6. Dag 8: Videre til høsting BMDMs som beskrevet nedenfor.

2. høsting, såing og grunning av BMDMs

  1. Etter 7 dager av voksende BMDMs i macrophage differensiering media, fjerne nedbryting. Vask tilhenger makrofager gang med 1-2 mL PBS. Sug opp PBS.
  2. Dispensere 1 mL av 0,25% Trypsin-EDTA i hver macrophage plate og la dem i 37 ° C inkubator i 5-10 min med hyppige tappe koble cellene. Oppheve tilknytningen trypsinized makrofager av pipettering opp og ned ved hjelp av en P1000 pipette og samle makrofager i 50 mL rør som inneholder 10-15 mL komplett DMEM medier. Vaske platen med ytterligere 2 mL fullfører DMEM media å høste alle gjenværende makrofager.
    FORSIKTIG: Ikke la makrofager i trypsin i mer enn 10 min.
  3. Sentrifuge 50 mL rør 350 x g for 5 min. Forkast nedbryting. Forsiktig dissociate pellet og resuspend cellene i 10 mL av komplett DMEM medier. Antall makrofager ved hjelp av en hemocytometer i nærvær av en levedyktighet fargestoff som trypan blå som følger:
    1. Bland for eksempel 90 µL av Trypan blå med 10 µL av celler for en 1:10 fortynning.
    2. Denne blandingen, laste inn 10 µL i en hemocytometer og telle den sentrale plassen (5 x 5-rutenett). Den totale celletall = antall x 104 x fortynning faktor (10) x volum (10 mL).
  4. Justere celle suspensjon skal 1 million/mL i fullstendig DMEM media og plate 4 mL av denne cellen suspensjon i hver 6 cm tallerken.
    Merk: Minimum 3 plater kreves per forsøk. En plate av celler blir venstre unstimulated, et annet sett av celler stimulert gjennom cross-linking av FcγRs og tredje platen celler brukes for alle ytterligere eksperimentelle og flyt cytometric kontroller.
  5. Inkuber platene overnatting på 37 ° C, 5% CO2.
  6. Dagen Sug opp nedbryting, vask celler når med 1-2 mL PBS. Legge til 4 mL komplett medier som inneholder 100 ng/mL musen IFN-γ til hver plate. Inkuber platene overnatting på 37 ° C, 5% CO2.
  7. Eventuelt kan du ta en aliquot i cellene å vurdere aktuelle generasjon av BMDMs av flowcytometri. 1 x 106 celler per test og forberede polystyren FACs rør for følgende: isotype kontroll, beiset med F4/80 (eller alternativt, beiset med CD11b).
  8. Forberede flowcytometri flekker bufferen ved å legge til 0,1% FBS til 1 x PBS. Bruk bare denne mengden FBS for ikke for å gjøre effekten av serum-sult i senere trinn.
  9. Aliquot 1 x 106 celler per rør og sentrifuge 750 x g for 5 min.
  10. Vask en gang dekantere vin eller aspirating nedbryting og resuspending celler i 2 mL flyt cytometri buffer. Sentrifuger 750 x g i 5 min.
  11. Sug opp nedbryting og resuspend celler i 100 µL av flowcytometri flekker buffer. Legge til 1 µL anti-musen CD16/32 Fc blokkerer antistoff hver rør. Ruge på is 5 min.
  12. Uten å vaske, Legg 2 µL FITC anti-mus F4/80 eller 1 µL APC anti-musen CD11b antistoff "farget" rør og en lignende mengde tilsvarende isotype kontroll antistoffer mot "isotype" rør. Ruge på is, i mørket, 30 min.
  13. Vask celler ved å legge 2 mL PBS direkte til cellene. Sentrifuger 750 x g i 5 min.
  14. Sug opp nedbryting og resuspend celler i 150 µL av PBS.
  15. Skaffe prøver på en flyt cytometer med et stoppvilkår 100 µL eller 10.000 hendelser på en av interesse og sikre at FSC, SSC, FL1 (FITC anti-mus F4/80) eller FL4 (APC anti-mus CD11b) kanaler er valgt for parameterne som skal analyseres.
  16. Bruker flyt cytometri programvaren, åpner en prikk tomten for FSC (på x-aksen) vs SSC (på y-aksen) og trekke en gate rundt cellene rundt, unntatt døde celler og rusk (døde celler og rusk er mye mindre hendelser enn befolkningen viktigste cellen og vises på lowe r igjen av tomten).
  17. Gating på cellene rundt, åpne et histogram plott med FL1 (FITC anti-mus F4/80) eller FL4 (APC anti-mus CD11b) på x-aksen.
  18. Kjør "isotype" prøven. Generere en markør-port slik at flertallet av "isotype" sample hendelser er til venstre for porten (< 1% positiv). Denne malen gjelde farget eksempelfilen.
  19. Kjør "farget" prøven. Vellykket generasjon av BMDMs vil medføre > 95% uttrykk for FITC anti-musen F4/80 eller APC anti-musen CD11b (figur 1A), mens feil oppdrettsforholdene kan resultere i sub-optimale generasjon makrofager (figur 1B).
    Merk: Hvis genererer BMDMs fra flere genotyper, ta note av uttrykket av disse markørene for hvert sett med BMDM som genereres, i tilfelle at dette kan være grunnlag for å ekskludere et utvalg fra analyse når ROS generasjon svar til stimulans vurderes.

3. reagenser og materiale forberedelse for ROS måling

  1. Rekonstituer lyofilisert oksidativt stress oppdagelsen reagensen i 60 µL av vannfri DMF å gi en 5 mM lagerløsning. Bland forsiktig før bruk.
    Merk: Det er oppgitt i ROS-ID kit håndboken at holdbarheten av rekonstituert reagensen er ca 1 uke på 20 ° C. Aliquoting reagensen umiddelbart etter rekonstituering i små lystette ampuller minimerer sin oksidering og maksimerer holdbarheten på 20 ° C.
  2. Rekonstituer lyofilisert superoxide oppdagelsen reagensen i 60 µL av vannfri DMF å gi en 5 mM lagerløsning. Bland forsiktig før bruk.
    FORSIKTIG: som nevnt i håndboken til kit, behandle begge oppdagelsen reagenser som mulig mutagener, håndtere hver med omsorg og kast riktig.
  3. Rekonstituer ROS induser (Pyocyanin) i 20 µL av vannfri DMF å gi en 50 mM lagerløsning.
  4. Rekonstituer ROS hemmer (N-acetyl-L-cystein) i 123 µL deionisert vann å gi en 0,5 M lager konsentrasjon.
  5. Etiketten 5 mL rundt polystyren rør (flyt cytometri rør) med eksperimentelle kontrollene og betingelser. (Se 4. Analysen forhold og kontroller)
  6. Forberede lav serum DMEM (ingen fenol rød) ved å legge til 0,1% FBS til fenol red-fri DMEM.
  7. Aliquot anti-BSA antistoffer i små dele (avhengig av bruk) og lagre dem på-80 ° C.
  8. Klargjør lager løsning av 100 mg/mL BSA i HBSS (Hanks' balansert salt løsning) eller PBS. Aliquot 100 µL dele og butikk på 20 ° C.
  9. Forberede en 2 x løsning av ROS sonder (2 x sonde løsning): for hver 10 mL av lav serum DMEM, legge 4 µL av oksidativt stress oppdagelsen reagensen (grønt fargebad) og 4 µL av superoxide oppdagelsen reagensen (oransje farge).
  10. Forberede 2 x sonde løsninger som inneholder bare oksidativt stress oppdagelsen reagens (2 x sonde løsning, grønn bare), eller som inneholder bare superoxide oppdagelsen reagens (2 x sonde løsning, oransje bare). Forbereder bare mengden av reagens nødvendig for eksperimentet og alltid forberede 2 x løsningen umiddelbart før å bruke.
    Merk: For å forberede mindre mengder 2 x oppdagelsen løsning, bruke en mellomliggende 1:10 fortynning av både grønt og oransje oppdagelsen reagenser før siste fortynning i DMEM. For eksempel for å forberede 1 mL av en 2 x oppdagelsen løsning, fortynne 1 µL av hver probe i 9 µL av DMEM (1:10 middels fortynning). Fortynne 4 µL av dette 1:10 middels fortynning i 1 mL av DMEM.

4. analysen forhold og kontroller

  1. Inkluder følgende eksperimentelle kontroller for flyt cytometric kompensasjon for hvert eksperiment:
    a) unstained kvinne og unstimulated celler.
    b) celler farget bare med oksidativt stress oppdagelsen reagensen (grønn reagens) og behandlet med ROS induser.
    c) celler farget bare med superoxide oppdagelsen reagensen (oransje reagens) og behandlet med ROS induser.
  2. For hver musen eller biologiske replikere, Inkluder 6 følgende:
    a) unstained kvinne og unstimulated celler
    b) flekker og unstimulated celler
    c) farget cellene behandlet med positiv induser
    d) farget cellene behandlet med positiv induser og ROS hemmer
    e) farget celler aktivert via FcγR cross-linking
    f) farget celler aktivert via FcγR cross-linking og behandlet med ROS hemmer
  3. Beregn mengden av 2 x sonde løsning nødvendig basert på antallet av mus (200 µL av 2 x sonde løsningen skal brukes for hver tilstand som krever flekker).
    Merk: For en analysen bruker 6 mus, 5 tilstander som krever farging med sonder vil være nødvendig per musen. Dette bringer det totale antallet forhold til 30. Dermed er den totale mengden 2 x sonde løsning nødvendig minst 6 mL (30 * 200 µL).

5. celle forberedelse

  1. Etter grunning makrofager over natten, Sug opp nedbryting. Vask cellene gang med PBS.
  2. Serum sulte cellene ved å erstatte media med samme volum av lite serum DMEM. For hver musen, en plate vil bli behandlet med anti-BSA IgG1 mens serum sultne, mens den andre vil være ubehandlet. Legge til bare lav serum DMEM ubehandlet plater. Legge til lav serum DMEM som inneholder 2,5 µg/mL murint anti-BSA IgG1 til behandlet plater.
    Merk: En ekstra ubehandlet plate er nødvendig for hvert eksperiment for flyt cytometric kompensasjon kontrollene.
  3. Inkuber platene 4 h ved 37 ° C, 5% CO2.
  4. Etter serum sultne, høste celler ved mild skraping eller 0.2 mM EDTA i PBS. Samle dem i merket 5 mL rundt bunnen rør og sentrifuger på 750 x g for 5 min. holde rede på hvilke celler ble behandlet med murint anti-BSA IgG1.
  5. Vask celle pellets når med 2 mL PBS å kvitte seg med alle gjenværende anti-BSA fra behandlet celler.
  6. Resuspend celle pellet i 600 µL av lav serum DMEM.
  7. Fra 600 µL celle suspensjon aliquot 200 µL i den pre merket 5 mL rundt bunnen rør som følger:
    1. Fra ubehandlet cellene, tar 200 µL for rør merket "unstimulated", 200 µL for rør merket "positiv induser" og 200 µL for rør merket "positiv induser + hemmer"
    2. Fra anti-BSA IgG1 behandlet celler, tar 200 µL for rør merket "FcγR crosslinking/FcγR XL" og 200 µL for rør merket "FcγR XL + hemmer"
    3. Fra ubehandlet cellene som skal brukes for kompensasjon kontroller, tar 200 µL for røret merket "unstained kvinne unstimulated", 200 µL for "grønn + induser" kontroll og 200 µL for "oransje + induser".
      Merk: Hvis cellene fra 5.7.1 og 5.7.3 er avledet fra samme musen, samme "unstained kvinne unstimulated" cellene kan brukes for eksperimentelle og kompensasjon kontrollen. Hvis ikke, en ytterligere 200 µL av celler vil være behov for en "unstained kvinne unstimulated" eksperimentelle kontroll for en).
  8. Holde rørene på is til farging og stimulering. Under serum forberede sult og binding av IgG1, sonder, bestemte stimuli, og indusere som beskrevet nedenfor.
    Merk: Hvis utfører analysen for første gang, hvis ingen mal ikke er tilgjengelig eller ingen etter-det-faktum kompensasjon er tilgjengelig på flyt cytometer og tilhørende programvare, stimulere flekken kompensasjon kontroller og kjøre disse på flyt cytometer å utføre manuell kompensasjon før tillegg stimuli til eksperimentelle prøver.

6. utfører analysen

  1. Forberede 2 x positiv induser løsning fortynne Pyocyanin 1: 100 i 2 x sonde løsning (forberedt i trinn 3.9) for å få en 2 x konsentrasjon av 500 µM av pyocyanin (siste konsentrasjon blir 250 µM). Også fortynn pyocyanin 1: 100 til "2 x sonde løsning, grønn bare" og "2 x sonde løsning, oransje bare" rør i 3.10.
    Merk: Begge betingelsene merket med "positiv induser" og "positive induser + hemmer" behandles med den positive induser. Planlegge deretter når beløpet av 2 x positiv induser løsning å forberede. For eksempel: Hvis utfører analysen med 3 mus, 6 forhold (3 * 2) behandles med positiv induser, så forberede 6 * 200 µL = 1,2 mL av 2 x positiv induser løsning.
  2. Forberede en 2 x BSA løsning fortynne BSA lager løsningen i 2 x sonde løsning å få en konsentrasjon av 2 µg/mL (siste konsentrasjon blir 1 µg/mL).
    Merk: Begge betingelsene merket med "FcγR XL" og "FcγR XL + hemmer" behandles med 2 x BSA løsning. Planlegge deretter når beløpet av løsning å forberede. For eksempel: Hvis utfører analysen bruker 3 mus, 6 (3 * 2) forhold behandles med BSA løsning og så 6 * 200 µL eller 1,2 mL av 2 x BSA løsning vil være nødvendig.
  3. Før du starter bestemte stimulering (FcγR crosslinking), kontroller at alle reagenser og celler er klar. Plass rørene på isen i rekkefølgen de vil bli stimulert.
  4. For flyt cytometers med en autosampler, Legg merke til de cytometer tar å analysere en prøve og gå videre til den neste, inkludert miksing og sonde vaske trinn (for eksempel 3,5 min).
    Merk: Timing er svært kritisk for denne analysen. For hver tilstand å være godt kontrollert må, stimulering utføres for nøyaktig tid (30 min) for hver betingelse. Stimulere celler i rekkefølge og innlemme forsinkelse mellom prøven oppkjøp av flyt-cytometer. For eksempel hvis tiden som krevs for cytometer å analysere ett utvalg og gå videre til neste 3,5 min, stimulere cellene i rekkefølgen de vil bli analysert hver 3,5 min.
  5. Hvis utfører manuell kompensasjon på dette punktet, stimulere kontroll rør som brukes for kompensasjon (trinn 5.7.3). Legge til 200 µL av "2 x sonde løsning, grønn bare" inneholder induser (fra 6.1) inn i rørene merket "grønn + induser" (trinn 5.7.3). Legge til 200 µL av "2 x sonde løsning, oransje bare" inneholder induser (trinn 6.1) inn i rørene merket "oransje + induser" (trinn 5.7.3).
  6. Inkuber celler for 30 min på 37 ° C, 5% CO2 i mørket.
  7. Bruke flyt cytometri programvaren og generere og etikett 3 eksempelfiler for den kontrollen "unstained kvinne, ubehandlet", "grønn + induser", og "oransje + induser" eksempler, og pass på å angi kanaler/parameterne skal analyseres (FSC, SSC, FL1, FL2) og ønsket stopp betingelser (100 µL, 3 min, etc.). Generere og etikettere et lignende sett med filer for eksperimentelle prøver.
  8. Kjør "unstained kvinne, ubehandlet" prøven. Åpne et dot plott for FSC (på x-aksen) vs SSC (på y-aksen) og trekke en gate rundt cellene rundt, unntatt døde celler og rusk (døde celler og rusk er mye mindre hendelser enn befolkningen viktigste cellen og vises nederst til venstre i plot).
  9. Denne "celler" gate, åpne en annen dot tomt FL1 (x-aksen) vs FL2 (y-aksen). Tegne en innledende kvadrant gate. Juster kvadrant portene slik at hendelsene vises i nedre venstre kvadrant av FL1 vs FL2 handlingen.
  10. Kjør "grønn + induser" prøven. Justere spenningen slik at hendelsene vises på nedre venstre og høyre kvadrantene av FL1 vs FL2 handlingen. Gjelde alle 3 eksempelfilene dette kompensasjonsmatrise.
  11. Kjør "oransje + induser" prøven. Justere spenningen slik at hendelsene vises på den øvre og nedre venstre kvadranter med FL1 vs FL2 handlingen. Gjelde alle 3 eksempelfilene dette kompensasjonsmatrise.
  12. Hver kompensasjon-filen og "unstained kvinne, ubehandlet" hendelser vises i nedre venstre kvadrant, "grønn + induser" hendelser vises på nedre venstre og høyre kvadrantene og "oransje + induser" hendelser vises på øvre og nedre venstre kvadranter av FL1 vs FL2 plot. Gjelde kompensasjonsplanen for alle eksperimentelle eksempelfilene.
    1. Kontroller at riktig erstatning brukes til alle kontroll eksempelfilene før gjelder alle eksperimentelle eksempelfilene kompensasjonsplanen. Se figur 2 for representant data som viser uncompensated og riktig kompensert eksempler.
      Merk: Mange cytometers angi FL1 som standard FITC/GFP kanalen (opphisset av blå 488 nm laser og oppdaget et 530/30 filteret sett) og FL2 som standard PE kanal (opphisset av blå 488 nm laser og oppdaget et 585/40 filteret sett). Vi bruker samme konvensjonen men forsiktighet nye flyt cytometri brukere for å konsultere med deres flyt cytometri kjernen manager for å sikre at deres cytometer er tilsvarende konfigurert og at den aktuelle kanaler brukes til å oppdage disse sonder. Avhengig av flyt cytometer og tilhørende programvare, kan det være mulig å utføre kompensasjon før eller etter prøver har anskaffet. Hvis etter-det-faktum kompensasjon er mulig, kan kompensasjon trinnet utføres etter at alle eksperimentelle prøver er blitt innkjøpt av cytometer. For cytometers med et dynamisk område, der avdrag spenning justeringer ikke er nødvendig, en kompensasjon eksperiment kan også utføres på en egen dag og eksperimentelle malen (inkludert kompensasjonsplanen) kan lagres for å redusere tiden det tar å utføre manuell kompensasjon.
  13. Når manuell kompensasjon er utført, og en eksperimentell mal er oppnådd, starte behandling av eksperimentelle prøver. Før behandling av positiv induser eller FcγR celle stimulering, merke som rør får ROS inhibitor. Behandle disse cellene med ROS hemmer minst 30 min før positiv induser eller FcγR stimulering.
  14. For å legge den ROS inhibitor, forberede en endelig konsentrasjon av 5 mM ved å legge til 1 µL av hemmer 200 µL av resuspended celler (uten anti-BSA IgG1).
  15. Behandle cellene med stimulans (eller positive induser) og laste cellene med ROS sonder som følger:
    1. For unstimulated celler: legge 200 µL av 2 x sonde løsning uten en stimulans til de 200 µL av cellen suspensjon merket "farget, unstimulated".
    2. For positive kontroller: legge til 200 µL av 2 x positiv induser løsning (forberedt i trinn 6.1) 200 µL av cellen suspensjon merket "positiv induser" eller "positiv induser + hemmer".
    3. For celler stimulert av FcγR cross-linking (bestemt stimulans): legge til 200 µL av 2 x BSA løsning (forberedt i 6.2) 200 µL av cellen suspensjon merket "Fcγr XL" eller "FcγR XL + hemmer".
      Merk: Husk å innlemme forsinkelse mellom eksempel analyse ved å legge til stimulans hvert x minutt der x er forsinkelse mellom oppkjøpet av ett utvalg og neste.
  16. Inkuber celler for 30 min på 37 ° C, 5% CO2 i mørket. Analysere eksemplene i rekkefølgen de ble stimulert en flyt cytometer utstyrt med en autosampler. Bruk analyse malene genereres under første kompensasjon trinnene. Ikke vask celler før analyse.

7. flyt cytometri dataanalyse og forventet resultat

  1. I flyt cytometri programvaren, åpne tidligere genererte analyse filene for de eksperimentelle prøvene (maler ble generert i trinn 6,7-6.12 og prøver ble kjørt i trinn 6.16). Kontroller at kompensasjonsplanen utføre manuell kompensasjon ble riktig brukt på eksperimentell prøvene.
    Merk: For flyt cytometers og flyt cytometri programvare som kan etter-det-faktum kompensasjon, hvis kompensasjonsplanen ikke var tidligere på eksperimentell eksempelfilene, bruke den på dette punktet.
  2. Lik verifisere riktig manuell kompensasjon, sikre at kontrollene i de eksperimentelle prøvene fungerer som forventet.
    1. Sikre at "unstained kvinne, ubehandlet" hendelsene vises på nedre venstre kvadrant av FL1 vs FL2 handlingen, at "positiv induser" hendelsene Vis økt fluorescens øverst til venstre, øvre høyre og nedre høyre kvadranter med FL1 vs FL2 tomten, og at" positiv induser + ROS hemmer"hendelser viser en reduksjon i fluorescens i øvre venstre, øvre høyre og nedre høyre kvadranter av FL1 vs FL2 plot sammenlignet fluorescensen observert med"positiv induser"prøven.
    2. Hvis kontroller innenfor de eksperimentelle prøvene ikke viser noen økt fluorescens, sjekk at alle analysen skritt ble utført, kontroller riktig generasjon og fylling av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (2.7-2.19), og gjenta eksperimentet. Hvis kontroller innenfor de eksperimentelle prøvene viser forventet trender, fortsette å analysere eksperimentelle prøver stimulert gjennom FcγR (figur 3A).
  3. Kontroller at FcγR-spesifikke stimulans fungerer riktig. Kjør følgende eksempler fra C57BL/6J WT mus: "unstained kvinne, unstimulated", "farget, unstimulated", "farget, stimulert gjennom FcγR", og "farget, stimulert via FcγR + ROS hemmer". Dette tilsvarer prøver 4.2a, 4.2b, 4.2e og 4.2f i del 4, henholdsvis.
    1. Sikre at "unstained kvinne, unstimulated" hendelsene vises på nedre venstre kvadrant av FL1 vs FL2 handlingen, at "farget, unstimulated" hendelser vises også på nedre venstre kvadrant av FL1 vs FL2 tomt, som "farget, stimulert gjennom FcγR" hendelser Vis økt fluorescens øverst til venstre, øvre høyre og nedre høyre kvadranter med FL1 vs FL2 tomten, og at "farget, stimulert via FcγR + ROS hemmer" hendelser viser redusert fluorescens i øverst til venstre, øverst til høyre og nederst til høyre kvadranter av FL1 vs FL2 tomten sammenlignet med "farget, stimulert gjennom FcγR" prøven (figur 3A).
    2. Hvis disse forventningene ikke blir oppfylt, for eksempel "farget, stimulert gjennom FcγR" prøven viser minimal eller ingen økt fluorescens i forhold til prøven "farget, unstimulated" eller "stained, unstimulated" prøven allerede viser markant økte nivåer av fluorescens sammenlignet med "unstained kvinne, unstimulated" utvalget, sjekk at alle analysen skritt ble utført riktig, kontroller riktig generasjon, grunning og håndtering av BMDMs (2.7-2.19), og gjenta eksperimentet. Hvis disse forventningene er oppfylt, videre til analyse av resten av eksperimentelle prøvene.
      Merk: Celler som produserer ROS som reagerer med grønne sonden (hydrogenperoksid, peroxynitrite, hydroksylradikaler, nitrogenoksid, peroxy radikaler, etc.) vises i øvre høyre og nedre høyre kvadranter med en stokk FL1 (x-aksen) versus en logg FL2 (y-aksen) dot tomten. Celler som produserer ROS som reagerer med oransje sonden (hovedsakelig men ikke utelukkende superoxide) vises i to øvre kvadrantene av en logg FL1 (x-aksen) versus en logg FL2 (y-aksen) dot tomten.
  4. Generere individuelle histogrammer, gated på cellene i interesse for analyse av FL1 og FL2 fluorescens. Bruker "unstained kvinne, unstimulated" prøvene, generere merketråd histogrammet slik at alle hendelser som "unstained kvinne, unstimulated" vises til venstre for denne indikatoren. Bruk denne handlingen med markøren til resten av de eksperimentelle prøvene (figur 3B).
  5. Presentere resultatene av eksperimentet som prosent av cellene positiv for hver ROS sonder eller ved å vise gjennomsnittlig fluorescens intensiteten (MFI) stimulert prøvene versus kontroll (Figur 3 c).

8. celleoverflaten flekker i kombinasjon med flyt cytometric analyse av ROS produksjon (valgfritt)

Merk: Dette trinnet gir en protokoll til farging makrofager med en celle-overflate markør før stimulering av FcγR og ROS målingen. Dette kan være nyttig i å vurdere ROS produksjon i blandet celle populasjoner. Det er viktig å velge et antistoff for macrophage overflaten markør konjugert til en passende fluor som ikke forstyrrer fluorescens fra oksidativt stress eller superoxide oppdagelsen reagenser. I denne protokollen brukes et antistoff musen F4/80 konjugert til Alexa fluor 647.

  1. Generere BMDMs, høste, og fyll dem som beskrevet tidligere (delene 1 og 2).
    Merk: Minimum tre 6 cm plater er nødvendig for å utføre alle de eksperimentelle kontroller og forhold som beskrevet nedenfor. En plate vil bli behandlet med anti-BSA IgG1 mens serum sulter mens de andre to platene vil stå ubehandlet.
    1. Inkluder 4 eksperimentelle kontroller som skal brukes for flyt cytometric kompensasjon (per forsøk):
      a) unstained kvinne og unstimulated celler.
      b) cellene behandlet med oksidativt stress oppdagelsen reagens (grønn reagens) og ROS induser.
      c) cellene behandlet med superoxide oppdagelsen reagens (oransje reagens) og ROS induser.
      d) celler farget bare med anti-musen F4/80 konjugert til Alexa 647.
    2. For hver musen eller biologiske replikere, Inkluder 3 følgende:
      a) beiset med F4/80 og venstre unstimulated
      b) beiset med F4/80 og aktivert via FcγR
      c) beiset med F4/80 og aktivert via FcγR og behandlet med ROS hemmer
  2. Etter grunning makrofager over natten, Sug opp nedbryting. Vask cellene gang med 1-2 mL PBS. Serum sulte cellene ved å erstatte media med samme volum av lite serum DMEM. For hver musen, en plate vil bli behandlet med anti-BSA IgG1 mens serum sultne, mens de to andre plater vil være venstre ubehandlet. Inkuber platene 4 h ved 37 ° C, 5% CO2.
  3. Etter serum sultne, høste celler ved mild skraping eller 0.2 mM EDTA i PBS. Samle hver plate i merket 5 mL rundt bunnen rør og sentrifuger på 750 x g for 5 min. holde rede på hvilke celler ble behandlet med murint anti-BSA IgG1.
  4. Vask celle pellets når med 1-2 mL PBS å kvitte seg med alle gjenværende anti-BSA fra behandlet celler.
  5. Resuspend en av cellen pellets fra platen som ikke får anti-BSA IgG1 i 600 µL av lav serum DMEM. Disse cellene vil ikke utsettes for cellen overflaten flekker. Bruk disse for kompensasjon kontroller. Aliquot 200 µL av denne cellen suspensjon i (3) 5 mL rundt bunnen rør merket a) unstained kvinne, unstimulated b) grønne oksidativt stress reagens + ROS induser, c) oransje superoxide oppdagelsen reagens + ROS induser.
  6. Resuspend en av cellen pellets fra platen som ikke får anti-BSA IgG1, i 300 µL av flowcytometri flekker buffer (PBS + 0,1% FBS). Aliquot 100 µL av denne cellen suspensjon i (2) 5 mL rundt bunnen rør for farging med Alexa 647 anti-musen F4/80.
  7. Resuspend celle pellets fra platen som fikk anti-BSA IgG1 i 300 µL flyt cytometri flekker bufferen. Aliquot 100 µL av denne cellen suspensjon i (2) 5 mL rundt bunnen rør for farging med Alexa 647 anti-musen F4/80.
  8. Stain celler som var aliquoted i 8.6 og 8,7, med 5 µL av Alexa 647 anti-mus F4/80 for 30 min på is, i mørket.
  9. Etter vask celler ved å legge 2 mL PBS og sentrifuger på 750 x g, Sug opp nedbryting og resuspend hver rør i 200 µL av lav serum DMEM uten fenol red. Avsette en ubehandlet tube som enkeltvis farget FL4 kontroll. Forberede sonder, induser, FcγR stimulans og ROS hemmere som angitt i delene 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 og 6.14.
    1. For celler ikke mottar anti-BSA IgG1, etiketten rør med følgende: en) ingen stimulans eller b) ROS induser.
    2. For celler som fikk anti-BSA IgG1, merke med følgende: en) Fc XL eller b) Fc XL + inhibitor.
  10. Stimulere prøvene skal brukes for godtgjørelse basert på deres respektive behandlinger som angitt i 6.5-6.6, i rekkefølgen de leses på flyt cytometer, omfatter forsinkelse mellom kjøp av ett utvalg og neste.
  11. Inkuber celler for 30 min på 37 ° C, 5% CO2 i mørket. Analysere eksemplene i rekkefølgen de ble stimulert en flyt cytometer utstyrt med en autosampler.
  12. Utføre manuell kompensasjon som beskrevet i 6,7-6.12 og dataanalyse som beskrevet i § 7.
  13. Bruker flyt cytometri programvaren, generere og etikett 4 eksempelfiler for kontrollen "unstained kvinne, ubehandlet", "grønn + induser", "oransje + induser" og "F4/80 stained" eksempler, og pass på å angi kanaler/parameterne skal analyseres (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) ønsket stopp forutsetninger (100 µL, 3 min, etc.).
  14. Kjør prøvene og generere dot tomter å utføre manuell kompensasjon.
    1. I celle overflaten flekker, generere to flere tomter: FL1 (x-aksen) vs FL4 (y-aksen) og FL2 (x-aksen) vs FL4 (y-aksen). Justere spenninger for å sikre at riktig erstatning brukes som vist i figur 7A. Når alle kompensasjon er utført riktig, gjelde kompensasjonsplanen for alle eksperimentelle eksempelfilene.
  15. Når manuell kompensasjon er utført, og en eksperimentell mal er oppnådd, starte behandling av eksperimentelle prøver som angitt i 6.13-6.15.3 og få smakebiter på en flyt cytometer som beskrevet i 6.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker protokollen skissert innen, presentere vi representant data viser flyt cytometric påvisning av ROS produksjon skyldes stimulering av WT C57BL/6J BMDMs gjennom FcγR. Som forventet, vi observerer minimale endringer i FL1 eller FL2 fluorescens over bakgrunnen nivå i unstimulated celler (figur 3A, sammenligne "farget, unstimulated" vs "unstained kvinne, unstimulated" dot tomter). Vi observerer en markant økning i FL1 og FL2 fluorescens når celler blir stimulert med FcγR cross-linking agent (figur 3A, sammenlign "farget og stimulert via Fc cross-linking" prøver vs "farget, unstimulated" dot tomter). Til slutt, når celler ble behandlet med ROS hemmer før FcγR cross-linking, dette økt fluorescens bringes tilbake til basale nivåer (figur 3A, sammenlign "farget og behandlet med ROS hemmer og stimulert via Fc cross-linking" vs "farget og stimulert via Fc cross-linking"dot plotter). Dette er også tydelig når data vises som et histogram for hver kanal (figur 3B) eller data presenteres som en prosent av cellene positivt for enten grønn eller oransje ROS sonder (Figur 3 c). En lignende trenden er også tydelig når data vises som MFI, selv om reduksjon i oransje fluorescens med pre-behandling med ROS hemmer ikke fanges også når presentert som MFI versus prosentvis (Figur 3 c). Vi har også presentere resultatene av 3 uavhengige eksperimenter utført på forskjellige dager (Figur 3, eksperiment 1, 2 og 3). Gjennomsnittsverdier og tilhørende standard feil av gjsnitt angis i grafer (Figur 3 c).

Vi presenterer også mislykket eksperimentering, der sub-optimal ROS produksjon som følge av FcγR stimulering ble observert (Figur 4). En minimal økning i FL1 og FL2 fluorescens ble oppdaget ved sammenligning "farget og stimulert via Fc cross-linking" prøver vs "farget, unstimulated" prøver (figur 4A, B, C). Dette blir presentert sammen med en vellykket eksperiment for å markere de store forskjellene mellom forventet prosenter eller MFI øker og observerte verdier i mislykkede forsøket.

Gjeldende protokollen utnytter et 24 h grunning skritt. Når man sammenligner en 24 h versus gangen 48t grunning, observerte vi ingen markant forskjell i prosent for celler positivt for grønn, oksidativt stress reagensen (figur 5A, øverste histogrammene og finne 5B grønne sonde, % positive). Men øke økende grunning tiden til 48 h gjorde prosentandelen av celler positivt for den oransje fluorescensen (figur 5A, lavere histogrammer og figur 5B oransje sonde, % positive). Dette tilsvarende gjenspeiles da data ble presentert som MFI. Dette tyder på at for optimal påvisning av alle ROS arter, en 48t grunning tid kan være mer perfekt.

Gitt at på grunn av kostnaden eller tiden som er nødvendig for eksperimentering, kan bruk av et kit til å utføre denne analysen ikke være et alternativ. Derfor vi testet like deler på dem som gis i kit og kjøpt disse fra standard leverandører (Thermofisher, EMD Millipore, Cayman). Vi finner at bruker individuelt innkjøpte komponenter og samme eksperimentelle protokoll for celle lasting og FcγR stimulering, kan vi recapitulate mange av de samme resultatene vi observerte bruke kit (figur 6A, B). Men selv om økninger i fluorescens var synlig med stimulering, ble et høyere nivå av ROS produksjon observert bruke kit. Dette kan indikere at bruk av individuelt fremskaffede komponenter kan være mulig, men må være ytterligere optimalisert for denne bestemte analysen.

Til slutt, viser vi at det er også mulig å kombinere celle-overflate farging med disse ROS sonder. Vi bruker en kjent macrophage markør, F4/80, konjugert til Alexa 647 og utføre celleoverflaten flekker før behandling med ROS inhibitor, ROS induser eller bestemte stimuli å indusere ROS produksjon. Vi viser i figur 7B som makrofager svarer som forventet når behandlet med FcγR crosslinking agent og FcγR crosslinking agent + ROS hemmer (figur 7B, oransje vs grønn prikk tomter). Videre, vi kan observere økt oransje eller grønt fluorescens spesielt generert av F4/80 merket cellene på behandling med FcγR crosslinking agent og redusert med pre-behandling med ROS hemmer (figur 7B, F4/80 vs grønne og F4/80 vs oransje prikk tomter).

Figure 1
Figur 1: Flow cytometric vurdering av aktuelle generasjon BMDMs. Wild type BMDMs ble generert og var igjen unstained kvinne eller beiset med FITC anti-musen F4/80 eller Alexa 647 anti-musen CD11b. FSC (x-aksen) vs SSC (y-aksen) tomter ble generert og makrofager (BMDMs) var gated for å utelate døde celler og rusk. Bruker en tomt FSC-H(x-axis) vs FSC-A (y-aksen), ble en singlet gate generert. Gating på singleter, histogrammer ble generert for å vise cellene beiset med enten FITC F4/80 eller APC CD11b i forhold til isotype farget kontroll. A) riktig BMDM differensiering med mer enn 95% av celler flekker positiv for CD11b eller F4/80. B) feil BMDM differensiering der mindre enn 95% av celler er flekker positiv for F4/80 og 2 topper finnes for CD11b. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Utføre kompensasjon når bruker grønn og oransje ROS sonder. Kompensasjon vil kreve unstained kvinne ubehandlet celler, celler med grønne ROS sonde og behandlet med ROS induser og celler med oransje ROS sonde og behandlet med ROS induser. Dot tomter for unstained kvinne ubehandlet celler brukes til å fastsette kvadrant portene. Data for cellene enkeltvis beiset med enten grønne ROS sonde eller oransje ROS sonde og behandlet med ROS induser vises før og etter, kompensasjon ble brukt. Kompensasjonsplanen brukes deretter til alle etterfølgende eksperimentelle prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Måling av ROS svar på bestemte FcγR stimulering bruke grønn og oransje ROS sonder og vurdering av analysen reproduserbarhet. Vill-type Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) ble generert, primet, og var igjen unstained kvinne eller beiset med en cocktail av grønt og oransje ROS sonder. Farget BMDMs var enten venstre ubehandlet, stimulert gjennom deres FcγRs bruke murint anti-BSA IgG1 + BSA for 30 min eller behandlet med ROS hemmer før stimulering via FcγR cross-linking. A) Dot plott, viser en økning i prosenter av celler i øverst til venstre, øverst til høyre og nedre høyre kvadranter på bestemte FcγR stimulering, som er redusert i nærvær av ROS inhibitor. B) histogrammer for hver fluorescens kanal, viser markøren porten å fastslå celler positivt for hver probe. C) presentasjon av dataene som en prosentdel av celler positivt for hver probe eller en økning i MFI. Tre uavhengige, representant eksperimenter presenteres. Gjennomsnittet for 3 eksperimenter og standardfeil for gjennomsnittet vises som linjer i grafer. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Eksempler på vellykkede og suboptimal FcγR stimulering. Vill-type Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) ble generert, primet, og var igjen unstained kvinne eller beiset med en cocktail av grønt og oransje ROS sonder. Farget BMDMs var enten venstre ubehandlet, stimulert gjennom deres FcγRs bruke murint anti-BSA IgG1 + BSA for 30 min eller behandlet med ROS hemmer før stimulering via FcγR cross-linking. Representant resultatene for vellykket og suboptimal stimulering vises som A) dot tomter, B) histogrammer, eller C) prosenten av celler positivt for hver probe eller som en økning i MFI. Vellykket stimulering viser økt fluorescens øverst til venstre, øvre høyre og nedre høyre kvadranter av FL1 vs FL2 tomten og økt MFI og prosentandel av positive celler med hver probe på FcγR stimulering. Suboptimal stimulering viser minimal økning i MFI eller prosentandel av positive celler. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Virkningen av grunning på ROS generasjon på FcγR stimulering. BMDMs ble generert, primet for 24 eller 48 h, og var igjen unstained kvinne eller beiset med en cocktail av grønt og oransje ROS sonder. Farget BMDMs var enten venstre ubehandlet, stimulert gjennom deres FcγRs bruke murint anti-BSA IgG1 + BSA for 30 min eller behandlet med ROS hemmer før stimulering via FcγR cross-linking. A) histogrammer til fluorescensen indusert av hver probe ved stimulering av makrofager primet for 24 eller 48 h. B) prosentandel av celler positivt for hver probe ved stimulering av makrofager primet for 24 eller 48 h. grunning makrofager 48 h resulterte i en økning i prosent av cellene positivt for oransje fluorescens (eller en økning i MFI for FL2 kanalen) sammenlignet med grunning makrofager 24 h. Gjennomsnittet for 3 eksperimenter og standardfeil for gjennomsnittet vises som linjer i grafer. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Flow cytometric ROS måling på FcγR cross-linking bruker reagenser fra forskjellige leverandører. BMDMs ble generert, primet for 24 h, og var igjen unstained kvinne eller beiset med en cocktail av oksidativt stress og superoxide oppdagelsen sonder. Farget BMDMs var enten venstre ubehandlet, stimulert med ROS induser, stimulert gjennom deres FcγRs bruke murint anti-BSA IgG1 + BSA for 30 min eller behandlet med ROS hemmer før stimulering via FcγR cross-linking. Sonder, ROS induser og ROS hemmer var brukes enten i Kit eller var kjøpt separat fra forskjellige leverandører og brukes på en lignende konsentrasjon. A) Dot tomter viser en side-ved-side-sammenligning av resultatene bruke kit og ikke-kit komponenter. B) histogrammer viser en side-ved-side-sammenligning av resultatene bruke kit og ikke-kit komponenter. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Kombinerer celle-overflate farging med cytometric måling av ROS produksjon ved FcγR cross-linking. A) Dot tomter for ulike fluorescerende kanaler med unstained kvinne eller enkeltvis farget kompensasjon kontroller. Vill-type BMDMs ble generert, primet for 24 h, og var igjen enten unstained kvinne, beiset med Alexa 647 anti-musen F4/80, farget med grønt ROS sonde bare og behandlet med ROS induser eller beiset med oransje ROS sonde bare og behandlet med ROS induser. Dot tomter for unstained kvinne ubehandlet celler brukes til å fastsette kvadrant portene. Tomter viser forventede resultater hvis kanaler er riktig kompensert. Kompensasjonsplanen ble så brukt på alle etterfølgende eksperimentelle prøver. B) vill-type BMDMs ble generert, primet for 24t og farget med Alexa 647 anti-musen F4/80. Etter var BMDMs enten venstre unstimulated, stimulert gjennom deres FcγRs bruke murint anti-BSA IgG1 + BSA for 30 min, eller behandlet med ROS hemmer før stimulering via FcγR cross-linking. Dot tomter viser at grønn eller oransje fluorescens spesielt produsert av F4/80 celler kan oppdages. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DCFH2-DA og DHE-basert oppdagelsen av ROS er en brukte teknikken14,15. Brukervennlighet og tilpasningsevne disse ROS sonder for kinetisk microplate formater, fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidratt til deres popularitet. Men i våre studier av FcγR-mediert macrophage funksjoner synes det ikke å være en standardprotokoll for å utføre denne analysen for flyt cytometric analyse av FcγR krysskoblet celler. Gitt den reaktive naturen analytter å være vurdert, har vi funnet at timingen er av avgjørende betydning i å sørge for at reproduserbarhet oppnås. Selv om vi har også gjennomført kinetisk microplate analyser, kan det være en bred variasjon i intensiteten av fluorescens fra eksperimentet å eksperiment, gjør det vanskelig å samle biologiske replikerer for statistisk analyse. Flow cytometric bruk av disse sonder tillater kvantifisering "ROS positiv" celler som løser noen av disse problemene, men er ikke uten komplikasjoner. Dette gjelder spesielt når du bruker en flyt cytometer utstyrt med en autosampler. I dette tilfellet vil analyse av et stort antall eksempler påvirke tiden cellene er utsatt for ulike stimuli. For å løse dette, har vi innarbeidet forsinkelse mellom eksempel analyse i protokollen for å sørge for at analysen er utført på celler stimulert en lignende mengde tid.

En annen viktig faktor i flyt cytometric ROS analyse er inkluderingen av egnede kontroller. Det kan ikke overvurderes at hvert eksperiment må (minst) alle den eksperimentelle og kompensasjon kontroller vi liste i denne protokollen. Dette er viktig å sikre gyldigheten av hvert eksperiment også på rette utelate prøver hvis nødvendig. Eksempler på dette inkludere hvis makrofager ikke skille passer riktig og viste mye lavere ROS produksjon selv med induser behandling. En annen sak kan være upassende aktivering av makrofager selv før FcγR cross-linking, noe som resulterer i et høyt basale ROS signal. Bruk av ROS hemmere sammen med spesifikke FcγR cross-linking viser forsvinningen av fluorescerende signaler er en annen viktig kontroll vi har ofte funnet mangler i andre studier som utfører lignende analyser. Den ROS inhibitor brukt i denne studien, N-acetyl-L-cystein, regnes som en universell ROS inhibitor. Hvis man er interessert i ROS produsert av spesielle enzymer, kan imidlertid andre spesifikke ROS hemmere inkluderes i analysen også. Noen eksempler er mefanamic syre (cyclooxygenase-avhengige ROS hemmer), apocynin (NADPH oksidase-avhengige ROS hemmer) eller allopurinol (en xantin oksidase-avhengige ROS hemmer).

Det er dessuten avgjørende å forstå hva er faktisk måles i denne avlesning. Som tidligere nevnt, DCFH2-DA måler flere ROS arter, og så fluorescens skyldes grønne proben kan ikke brukes til å diskriminere en ROS Art fra en annen14. Likeledes, oransje sonden (sannsynligvis DHE), men ofte sitert som superoxide spesifikke, kan produsere både superoxide-spesifikke og superoxide uavhengig oksidasjonsprodukter, som ikke kan skilles uten bruk av flere teknikker som HPLC 15. i forbindelse med måling "totale ROS" eller "indusert ROS" under respiratory utbrudd, bruk av disse sonder sammen med riktige kontroller, kan imidlertid være akseptabelt. Mange nye fluorescerende basert ROS sensorer har oppstått eller er blir utviklet11,13. Noen som redoks-sensitive fluorescerende proteiner, har fordelen av en dynamisk måling av ROS på grunn av deres reversibel oksidasjon. Imidlertid ville dette kreve genetisk manipulering av celler, som ikke alltid er mulig eller ønskelig. I mange tilfeller fluorescerende probe-baserte ROS oppdagelsen er fortsatt et gyldig og nyttig verktøy, så lenge eksperimentet er standardisert, godt kontrollert, og konklusjonene avledet fra slike eksperimenter er ikke overdrevet.

Fordelene ved hjelp av denne kommersielt tilgjengelig ROS kit er at alle nødvendige reagenser inkludert ROS indusere, fjerner og titrerte sonder er inkludert og "klar til bruk". Hvis eksperimentering perioden er forventet for å være kort (fullført innen en uke), kan dette settet gi en mer kostnadseffektiv metode for å utføre flyt cytometri-basert ROS oppdagelsen uten behovet å kjøpe eller optimalisere hver bestemt komponent individuelt. Vi i tillegg vise dette settet med en bestemt Agonistiske (FcγR stimulering) og demonstrere reproduserbarhet over eksperimenter; vi vurdere virkningene av grunning ganger på ROS generasjon; vi sammenligne lignende sonder, hemmere og indusere fra ulike selskaper; Vi gir eksempler på mislykket eksperimentering; og til slutt vi kombinerer celle-overflate flekker med bruk av disse ROS sonder. Dette ville tillate samtidig deteksjon av ROS fra ulike celletyper i en blandet befolkning, som krever mindre utvalg og reagenser. For eksempel, kan dette være spesielt nyttig når skille mellom macrophage og nøytrofile-avledet ROS, de viktigste celletyper kunne FcγR hemorroider. For flere eksperimenter som må utføres med lang mellomliggende perioder i mellom, kan bruk av et sett ikke være like ideell. Quidel av sonder gis ikke og når rekonstituert, produsenten anbefaler bare at reagenser brukes innen en uke (som ROS sonder er svært reaktive). Hvis det er forventet at denne perioden er kompatibel med eksperimentering, anbefaler vi at enkelte reagenser i stedet for en kit være kjøpes separat og rekonstituert bare på dagtid eksperimentering. Som vi viser her, kan ytterligere optimalisering individuelt innkjøpte komponenter i tillegg være nødvendig før analysen. Total, vi håper at dette arbeidet gir en nyttig ressurs for forskere bruker flowcytometri til å måle reproduserbar ROS generasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke andre medlemmer av det Tigno-Aranjuez inkludert Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjelp i laboratoriet vedlikehold og mus kolonien vedlikehold. Støtte for denne forskningen ble levert av grant R00 HL122365 og oppstart midler til J.T.T-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 145 reaktive oksygen arter (ROS) flow cytometri Fc gamma reseptor (FcγR) Fc reseptorer makrofager åndedretts burst
Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter