Klinisk oversættelse af exosome afledte biomarkører for syge og maligne celler hæmmes af manglen på hurtige og præcise kvantificeringsmetoder. Denne rapport beskriver brugen af mørke mikroskoper med lav forstørrelse til at kvantificere specifikke exosomvesikler subtyper i små mængder serum-eller plasmaprøver.
Inficerede eller maligne celler udskiller ofte flere exosomer, hvilket fører til forhøjede niveauer af sygdoms associerede exosomer i kredsløbet. Disse exosomer har potentialet til at fungere som biomarkører for sygdomsdiagnosticering og til at overvåge sygdomsprogression og behandlingsrespons. Men de fleste exosomvesikler analyseprocedurer kræver exosomvesikler isolation og rensning trin, som normalt er tidskrævende og arbejdskrævende, og dermed af begrænset nytte i kliniske indstillinger. Denne rapport beskriver en hurtig procedure til at analysere specifikke biomarkører på exosomer ydre membran uden at kræve separate isolering og oprensningstrin. I denne metode, er exosomer fanget på overfladen af et dias ved exosome-specifikke antistoffer og derefter hybridiseret med nanopartikel-konjugeret antistof sonder specifikke for en sygdom. Efter hybridisering, er den overflod af målet exosomvesikler befolkning bestemmes ved at analysere lav forstørrelse mørk-felt mikroskop (LMDFM) billeder af de bundne nanopartikler. Denne fremgangsmåde kan nemt anvendes til forskning og klinisk brug til at analysere membran-associerede exosomvesikler biomarkører forbundet med sygdom.
Exosomer frigives fra de fleste celletyper og spiller en central rolle i celle-til-celle kommunikation, herunder patofysiologiske processer forbundet med forskellige sygdomme, da de kan være hjemsted for specifikke væv eller celletyper, og indeholder en række nukleinsyrer , proteiner og lipider, der afspejler deres oprindelses celle og kan øve regulerende virkninger på deres recipient celler1,2,3,4. Exosomer er ofte udskilles på forhøjede niveauer i sygdomstilstande, kan interagere med både tilstødende og fjerne celler, og findes på relativt høj koncentration i cirkulation samt de fleste andre kropsvæsker, herunder spyt, urin, bugspytkirtel og galde saft og bronchoalveolær skylning væske5,6,7,8,9,10,11. Denne overflod og stabilitet af exosomer i menneskelige kropsvæsker, kombineret med deres informationsrige natur, gør dem ideelle biomarkører for sygdom diagnose og behandling overvågning.
Dette omfatter tumor-afledte exosomer (TDEs), som indeholder tumor-specifikke eller selektive faktorer, som kan tjene som sygdom biomarkører, herunder tumor-associerede mutante alleler. TDEs kan deltage i remodeling af tumor mikromiljø for at lette tumor udvikling og metastaser, og regulere anti-tumor svar12. Øget TDE sekretion er en fælles fænotype af de fleste kræftformer og flere funktioner i tumor mikromiljø, herunder hypoxi, sure pH, og betændelse, er kendt for at fremme exosomvesikler sekretion. Overraskende, i betragtning af antallet af celler, der udskiller exosomer, en stigning i det totale exosomvesikler niveau kan, selv, fungere som en kræft biomarkør. For eksempel, en nylig undersøgelse fandt, at den samlede EV koncentration i galde juice diskriminerer maligne og nonmaligne i fælles galde Duct stenose patienter med 100% nøjagtighed7. Lignende resultater er blevet fundet med undersøgelser ved hjælp af andre kropsvæsker, herunder plasma. Men på grund af potentialet for emne variation og andre forstyrrende faktorer har de fleste undersøgelser, der undersøger exosomer som sygdoms biomarkører, fokuseret på påvisning af biomarkør, der er selektivt forbundet med TDEs i stedet for total exosomvesikler Numre.
Det er dog stadig en udfordring at oversætte exosomvesikler biomarkører til klinisk praksis, da de fleste rapporterede exosomvesikler assay tilgange kræver tidskrævende og arbejdskraftintensive isolations procedurer 13. I øjeblikket populære exosomvesikler isolation metoder omfatter ultracentrifugering, tæthed gradienter, størrelse-udelukkelse, co-nedbør, affinitet fange, og mikrofluidisk kapllærelektroforese isolation tilgange. Ultracentrifugering er “Gold standard” metode, og er mest almindeligt anvendt til exosomvesikler isoleringer, men denne procedure er tidskrævende og resulterer i exosomvesikler skader og exosomvesikler membran klyngedannelse, og producerer exosomvesikler prøver, der er forurenet med proteiner, lipoproteiner og andre faktorer, der kan påvirke efterfølgende analyser14. De fleste exosomvesikler isolations metoder, herunder ultracentrifugering, kan ikke adskille exosomer (30 – 150 nm) fra mikro-vesikler (100 – 1.000 nm) og apoptotiske organer (100 – 5000 nm), som opstår gennem forskellige mekanismer og har forskellige funktioner, på grund af størrelsen overlapning mellem disse grupper, og mangfoldigheden af exosomvesikler populationer15. Nye tilgange er nødvendige for at forbedre følsomheden og reproducerbarhed af exosomvesikler analyser ved at forbedre exosomvesikler opsving samtidig reducere exosomvesikler skader og forurening, selv om enhver analyser baseret på sådanne metoder vil også nødt til at være optimeret til at gøre dem egnet til oversættelse til applikationer i kliniske indstillinger.
Flere nylige undersøgelser har foreslået at ansætte integrerede platforme til at indfange og analysere exosomer direkte fra kropsvæsker. Disse metoder anvender microfluidic, elektro kinetisk, affinitet Capture, og forskellige andre metoder til exosomvesikler isolation, og elektrokemi, overflade Plasmon resonans, og andre metoder til at detektere erobrede exosomer. Det er ikke klart, hvor muligt mange af disse tilgange vil være i kliniske indstillinger, på grund af deres kompleksitet, udgifter, lav-gennemløb eller andre spørgsmål.
Vi har udviklet en hurtig og billig analyse, der kan anvendes til følsom og specifik kvantificering af totale exosomer og specifikke exosomvesikler subtyper, herunder sygdoms associerede exosomer, såsom TDEs, som kun kræver en lille mængde prøve, og som anvender et strømlinet workflow, der er velegnet til kliniske miljøer. I denne analyse er et lysbillede belagt med antistoffer, der binder enten en exospecifik eller sygdomsspecifik markør, der udtrykkes på exosomvesikler overfladen, med henblik på direkte at indfange målexosomer til stede i små plasma-eller serumprøver, der påføres brønde på Dias. Erobrede exosomer er derefter hybridiseret med en antistof-konjugeret nanopartikel, der genkender biomarkør af interesse på disse exosomer, som kan være enten en generel exosomvesikler markør eller en faktor specifik for en exosomvesikler under type af interesse. Billeder af disse prøve brønde opsamles derefter ved hjælp af et mørkt felt mikroskop (DFM) og analyseres for at måle lyset spredt fra nanopartikler bundet til exosomer af interesse fanget i hver prøve godt6,16,17. Især Imaging en hel prøve godt ved lav forstørrelse DFM (LMDFM) undgår en udvælgelse bias stødt med høj forstørrelse DFM analyser, når brugerne skal direkte vælge, hvilke felter til at fange for efterfølgende billedanalyse. LMDFM billedanalyse er underlagt lys spredning artefakter fra overflade uregelmæssigheder, herunder ridser og prøve snavs, men denne baggrund kan reduceres ved hjælp af en simpel støjreduktion algoritme vi udviklet til at køre på NIH billedanalyse program, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Denne algoritme anvender først en input kontur tærskel, der bruges til at registrere afgrænsningen af prøvebrønden for at definere billedets område til efterfølgende analyse. Det område, der er defineret af dette kontur område, opdeles derefter til separat signal til stede i de røde, blå og grønne kanaler i billedet, og den blå kanal trækkes fra den røde kanal for at fjerne signalet fra overflade artefakter og ujævn belysning fra nanorod Signal.
Denne artikel beskriver, hvordan du bruger denne analyse til hurtigt at kvantificere enten totale eller specifikke exosomvesikler niveauer i plasma eller serumprøver.
Exosomer stammer fra regulerede invagler af den ydre endosome membran, der producerer multi vesikulære organer, en specialiseret delmængde af endosomer, der indeholder et stort antal intraluminale vesikler, der gennemgår fusion med plasma membranen for at frigive modne exosomer i det ekstracellulære rum. På grund af denne Biogenese pathway, kan exosomer bære membran bundne faktorer forbundet med membran fraktioner, der omfatter eller smelter sammen med den endosome membran, samt flere forskellige typer af cytosoliske komponenter, og dermed indeholder ladninger af proteiner, DNA og forskellige RNA-undertyper (mRNAs, microRNAs, lange ikke-kodende RNA’er), der kan afspejle Fænotypen af deres oprindelses celle20. Da exosomer udskilles af de fleste, hvis ikke alle celletyper, kan udstille øget sekretion fra syge eller maligne celler, og ophobes i de fleste kropsvæsker, exosomer er genstand for omfattende og systematisk undersøgelse som en lovende minimalt invasive midler til at påvise specifikke sygdomstilstande og overvåge deres respons på behandling21.
Exosomvesikler isolation, som er nødvendig for de fleste aktuelle exosomvesikler analyser, er en langvarig og arbejdskrævende procedure, der begrænser den kliniske oversættelse af exosomvesikler-associerede biomarkører med potentiel medicinsk relevans. Mange almindelige isolations metoder (ultracentrifugering, size-udelukkelse, nedbør osv.) skelner ofte ikke tilstrækkeligt mellem exosomer (30 – 100 nm) fra mikro-vesikler (100 – 1.000 nm) og apoptotiske organer (100 – 5000 nm) på grund af overlapninger i deres størrelsesintervaller eller fysiske egenskaber eller kan beskadige exosomvesikler integritet15. Nye tilgange er under udvikling, der kan give mulighed for hurtigere exosomvesikler analyser, men det er ikke klart, hvor muligt det kan være at gennemføre mange af disse platforme i kliniske indstillinger på grund.
I denne rapport præsenterer vi en roman tilgang, der tillader nanopartikel-baseret høj-gennemløb exosomvesikler kvantificering ved hjælp af lav forstørrelse mørke felt mikroskop billeder. Denne metode kræver ikke exosomvesikler rensning, dyrt dedikeret udstyr, eller ny teknisk ekspertise og bør derfor være muligt at hurtig oversættelse i de fleste forskning og kliniske indstillinger. Vores analyse kan anvendes til præcist at kvantificere koncentrationen af et mål exosomvesikler befolkning bærer en specifik biomarkør, når analysen resultater er sammenlignet med en standardkurve, da vores resultater udviser der er en stærk lineær korrelation (R2 = 0,99) mellem optisk respons og exosomvesikler koncentration. For at demonstrere den virkelige verden potentialet i denne tilgang, vi har tilvejebragt data, hvor vi anvendte denne metode til at kvantificere koncentrationen af en exosomvesikler biomarkør forbundet med kræft i bugspytkirtlen i serumprøver opnået fra patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen.
I LMDFM afbildes hele prøvebrønden for at undgå den selektions skævhed, der findes i DFM-analyser med høj forstørrelse, hvor brugerne direkte skal vælge de eksempelfelter, der skal tages til efterfølgende billedanalyse, men er underlagt synlige artefakter fra overfladen uregelmæssigheder, herunder ridser og prøve affald. Denne baggrund kan reduceres til at detektere målet exosome-afledt signal ved hjælp af vores DSM støjreduktion algoritme, der kører på NIH billedanalyse program, ImageJ, men pleje skal stadig træffes for at undgå at indføre sådanne artefakter, som kan reducere det dynamiske område af analysen.
Materialer, der anvendes i denne analyse:
Multi-Well SuperProtein A/G-dias med 1 μL/brønd blev købt hos Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanopartikler blev fremstillet af Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). DFM-billeder blev taget med et Nikon DiR2 digital kamera fastgjort til et Nikon ti-Eclipse mikroskop, med konsistent belysning og en 1/220 s eksponeringstid. PANC-1-celle linjen, der blev brugt i dette studie, blev købt fra American type Culture Collection.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev primært støttet af forskningsmidler fra NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 og R21Al126361-01), den unge investigator-pris, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC).
Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |