Summary
תרגום קליני של אקסוחלק נגזר הסמנים עבור תאים חולים וממאירים מפריע היעדר שיטות קוונפיקציה מהירה ומדויקת. דו ח זה מתאר את השימוש בתמונות מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה של שדה כהה כדי לכמת מסוג מסוים אקחלק בסרום בנפח קטן או בדגימות פלסמה.
Abstract
תאים נגועים או ממאירים לעתים קרובות להפריש אקסוזומים יותר, המוביל רמות גבוהות של מחלות הקשורות אקסוזומים במחזור הדם. אקסוזומים אלה יש פוטנציאל לשמש בסמנים לאבחון מחלות כדי לפקח על התקדמות המחלה ותגובת הטיפול. עם זאת, רוב ההליכים הניתוח דורש אקסוקצת בידוד ושלבי הטיהור, אשר בדרך כלל צורכת זמן ועבודה אינטנסיבית, ובכך השירות מוגבל בהגדרות קליניות. דו ח זה מתאר הליך מהיר לניתוח סמנים ספציפיים על הקרום החיצוני של האקסוזומים ללא צורך בידוד ושלבי טיהור נפרדים. בשיטה זו, האקסוזומים נלכדים על פני השטח של שקופית על-ידי מספר נוגדנים מסוימים, ולאחר מכן הוכלא עם נוגדנים ננו-חלקיק-מצודים בבדיקות ספציפיות למחלה. לאחר היברידיזציה, השפע של היעד אקסוחלק האוכלוסייה נקבעת על ידי ניתוח הגדלה נמוכה מיקרוסקופ שדה כהה (LMDFM) תמונות של חלקיקים מאוגדים. גישה זו יכולה להיות מאומצת בקלות עבור מחקר ושימוש קליני כדי לנתח ממברנה הקשורים אקכמה ביואריטים מקושרים למחלות.
Introduction
אקסוזומים משתחררים מרוב סוגי התאים ומשחקים תפקיד מרכזי בתקשורת תא לתאים, כולל תהליכים פתופסלוגיים הקשורים למחלות שונות, שכן הם יכולים להיות ביתם של רקמות או סוגי תאים ספציפיים, ולהכיל מגוון של חומצות גרעין , חלבונים ושומנים שמשקפים את תא המוצא שלהם ויכולים להפעיל השפעות רגולטוריות על תאי הנמען1,2,3,4. אקסוזומים מופרש לעתים קרובות ברמות גבוהות במצבי מחלה, יכול אינטראקציה עם תאים סמוכים ומרוחקים, והם נמצאים בריכוז גבוה יחסית במחזור, כמו גם רוב נוזלי הגוף האחרים, כולל רוק, שתן, הלבלב והמרה . ונוזל ברונכשיים5,6,7,8,9,10,11 זה שפע ויציבות של אקסוזומים בגוף האדם נוזלי, ביחד עם המידע שלהם בטבע עשיר, הופך אותם ביוארקרס אידיאלי לאבחון מחלות וניטור הטיפול.
זה כולל אקסוזומים הנגזר מהגידול (TDEs), אשר מכילים גורמים ספציפיים לגידול או סלקטיבי, אשר יכולים לשמש כסמנים למחלות, כולל מוטציות הקשורות לגידול אלטלס. TDEs יכול להשתתף שיפוץ של מיקרוסביבה הגידול כדי להקל על התפתחות הגידול גרורות, ולהסדיר את התגובות נגד הגידול12. הפרשה TDE מוגברת הוא פנוטיפ נפוץ של רוב סוגי הסרטן ומספר תכונות של מיקרוסביבה הגידול, כולל היפוקסיה, חומציות חומצי, ודלקת, ידועים כדי לקדם הפרשה אקסוחלק. באופן מפתיע, בהתחשב במספר התאים הפרישות אקסוזומים, עלייה ברמה הכוללת אקסוחלק יכול, עצמו, פונקציה כמו ביוארקר סרטן. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה מצא כי הריכוז EV הכולל במיץ מרה מפלה ממאיר ולא ממאיר ב משותף היצרות צינור המרה בחולים עם 100% דיוק7. תוצאות דומות נמצאו עם מחקרים באמצעות נוזלי גוף אחרים, כולל פלזמה. עם זאת, בשל הפוטנציאל לנושא וריאציה הנושא, וגורמים אחרים מייסדים, רוב המחקרים חוקרים אקסוזומים כמו בסמנים המחלה יש התמקדו זיהוי של סמנים באופן סלקטיבי הקשורים TDEs במקום הכולל אקסוחלק מספרים.
תרגום אקסוכמה ביואריטים לתוך הפרקטיקה הקלינית, עם זאת, נשאר מאתגר מאז הדיווחים הרבה ביותר הגישות הטיפול דורש זמן רב והליכי בידוד אינטנסיבית העבודה 13. כיום, שיטות הבידוד הפופולריות כוללות הדרגתיות, מעברי דחיסות, גודל-הדרה, משקעים משותפים, לכידת אהדה וגישות בידוד מיקרופלואידיג. הקשר הוא "תקן זהב" שיטה, והוא הנפוץ ביותר עבור אקסוכמה בדלציות, אבל הליך זה הוא זמן רב ותוצאות אקסוכמה נזק אקסוכמה הממברנה באשכולות, ומייצרת אקסוכמה דגימות מזוהמים עם חלבונים, ליפופרוטאינים וגורמים אחרים שיכולים להשפיע בניתוחים הבאים14. רוב שיטות הבידוד, כולל בידוד, אינן יכולות להפריד בין אקזומים (30 – 150 ננומטר) ממיקרו-שלפוחיות (100 – 1000 ננומטר) וגופים אפוטוטיים (100 – 5000 ננומטר), הנובעים באמצעות מנגנונים שונים ובעלי פונקציות שונות, בשל גודל חפיפה בין הקבוצות הללו, והמגוון של האוכלוסייה האקסומספר15. גישות חדשות נחוצות כדי לשפר את הרגישות והשחזור של אקסוחלק בחני על ידי שיפור אקסוכמה התאוששות תוך הפחתת הנזק אקסוכמה וזיהום, למרות כל בחני any המבוסס על שיטות כאלה יהיה גם צריך להיות ממוטב כדי להפוך אותם מתאים לתרגום יישומים במסגרות קליניות.
מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו להעסיק פלטפורמות משולבות כדי ללכוד ולנתח אקסוזומים ישירות מנוזלי הגוף. שיטות אלה מעסיקים microflu, אלקטרוקינטי, לכידת אהדה, ושיטות אחרות שונות עבור אקסומין בידוד, ו אלקטרוכימיה, התהודה של פני השטח, ושיטות אחרות כדי לזהות אקסוזומים שנתפסו. לא ברור איך הרבה גישות אלה יהיו בהגדרות קליניות, בשל המורכבות שלהם, הוצאות, תפוקה נמוכה או נושאים אחרים.
פיתחנו באופן מהיר וזול שניתן להשתמש בו עבור כימות רגיש וספציפי של האקסוזומים הכולל ומתת ספציפיים מסוימים, כולל אקסוזומים הקשורים למחלות, כגון TDEs, אשר דורש רק כמות קטנה של מדגם, אשר מעסיקה זרימת עבודה יעילה המתאימה לסביבות קליניות. באופן זה, שקופית מצופה בנוגדנים שקושרים או מסוג אקסומין ספציפי או מחלה המתבטא על משטח האקסומין על מנת ללכוד במישרין את היעד החיצוני הנוכחי בדגימות פלזמה בנפח קטן או סרום להחיל על בארות על שקופית. אקסוזומים שנתפסו לאחר מכן הוכלא עם ננו-חלקיק מעלה נוגדן המכיר את ביוארקר של עניין על האקסוזומים האלה, אשר יכול להיות או כללי אקסוחלק הסמן או גורם ספציפי אקמין תת סוג של עניין. תמונות של בארות אלה לדוגמה הם שנתפסו אז באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה (dfm) וניתח למדוד את האור מפוזרים חלקיקים הקשורים אקסוזומים של ריבית שנתפסו בכל מדגם טוב6,16,17. בעיקר, הדמיה של דוגמה שלמה גם על ידי DFM בהגדלה נמוכה (LMDFM) מונעת הטיית בחירה נתקל בניתוח DFM הגדלה גבוהה כאשר משתמשים חייבים לבחור באופן ישיר אילו שדות ללכוד עבור ניתוח תמונה בעקבות. ניתוח תמונה LMDFM כפוף ממצאים פיזור אור מפני אי סדרים פני השטח, כולל שריטות ופסולת לדוגמה, אבל הרקע הזה יכול להיות מופחת באמצעות אלגוריתם פשוט הפחתת רעש שפיתחנו לפעול בתוכנית ניתוח תמונה NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). אלגוריתם זה מחיל תחילה סף מתאר קלט המשמש לזיהוי גבולות המדגם היטב כדי להגדיר את אזור התמונה לצורך הניתוח העוקב. האזור שהוגדר על ידי אזור מתאר זה מפוצל לאחר מכן לאות נפרד נוכח באדום, ערוצי כחול וירוק של התמונה ואת הערוץ הכחול מופחתים מן הערוץ האדום כדי להסיר אות הנובעים ממצאים פני השטח ותאורה מחוספס מ nanorod אות.
מאמר זה מתאר כיצד להשתמש באפשרות זו כדי לכמת במהירות את המספר הכולל או הספציפי רמות בדגימות פלזמה או סרום.
Protocol
1. הכנת רגשים ננו-חלקיק
הערה: שיטת זה משתמשת Nanorods זהב מתפקד (בקוטר 25 ננומטר x 71 ננומטר אורך), כי הם בעלי מצועם פולימרים neutravidin (AV) ויש להם את השיא התהודה המשטח המפיקה אדום (641 ננומטר שיא) פיזור האות על DFM תאורה.
- לשטוף את 40 μL של ה-AV (2.56 x 10 החלקיקים) שלוש פעמים עם 200 ΜL PBS (pH 7.0) על ידי צנטריפוגה ושאיפה (8,500 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות), ואחריו צנטריפוגה הסופי ושאיפה השלב שאחריו הגלולה מושעה-AV. ב-40 μL PBS.
- מערבבים את ההשעיה הזאת עם הבולם הפנימי של הבית, עם נוגדן ביולוגי 10 μl (0.5 מ"ג/mL) ספציפיים עבור אנטיגן על פני השטח של המין השני של הריבית ו 150 μl של PBS ולאחר מכן לערבב ב 4 ° צ' עבור 2 h באמצעות מערבל כדי לאפשר neutravidin-biotin האיגוד כדי להגיע ל
- לשטוף את הנוגדן כתוצאה מצומנת (אונאר-IgG) שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ושאיפה (6,500 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות), ולאחר מכן להשעות אותם ב 200 ΜL PBS ולאחסן אותם ב 4 ° צ' עד השימוש.
הערה: יש להשתמש בטכניקה סטרילית ובזמני אחסון קצרים כדי להימנע מזיהום והשפלה של האונאר-IgG. מומלץ להשתמש בנוגדן-מעלה בתוך 24 שעות של הקוניוגציה שלהם.
2. הכנת שקופיות לכידת EV
- דלל בחרה אקסוכמה נוגדנים ללכוד 0.025 mg/mL ב-PBS ולהוסיף 1 μL/טוב של דילול זה על חלבון רב היטב A/G שקופית, ולאחר מכן מודלת שקופית זו ב 37 ° c עבור 1 h בחדר מחולל לחות כדי לאפשר כריכת נוגדנים ללכוד חלבון A/G מקיבוע על השקופית.
- שטפי בארות כדי להסיר נוגדנים לא מאוגדים, ולשטוף בארות שלוש פעמים על ידי התוספת והשאיפה של 1 μL/טוב של PBS, לאחר מכן לטעון כל טוב עם 1 μL של חסימת מאגר (ראה טבלת חומרים) ו דגירה השקופית עבור 2 h ב 37 ° c בחדר מחולל לחות כדי b לנעול את כל אתרי כריכת החלבונים שנותרו.
- בארות לסלק להסיר מאגר חוסם, לשטוף בארות שלוש פעמים על ידי התוספת והשאיפה של 1 μL/טוב של PBS, ומיד להשתמש בשקופיות חסומות עבור אקסוכמה לכידה וניתוח.
3. הכנה לעיקול סטנדרטי
- כדי לכמת במדויק את השפע המוחלט או היחסי של מסוג אקסוסט ספציפי, המשתמש חייב ליצור עיקול רגיל עם האוכלוסייה הטהורה האוכלוסיה המבטאת בצורה אחידה את האקסומין המשטח של משטח הריבית. מחקר זה מנתח את השפע של אקסוזומים ביטוי גרורות הקשורות חלבון ממברנה, הקולטן של אפרם A2, אשר יש קשר דיווח עם הבמה סרטן הלבלב פרוגנוזה6,18.
הערה: שורת התאים האנושית של סרטן הלבלב PANC-1 ו האקסוזומים שלה ידועים לבטא את החלבון הזה אקסוזומים מבודדים מקו תא זה שימשו כדי ליצור עיקול רגיל כדי לכמת את מספר האקסוזומים כי לבטא את החלבון הזה אקסוכמה מורכבים דגימות. - התאים התרבותיים עבור 48 שעות ב 37 ° c במדיה של תרבות ללא סרום כדי לאפשר הצטברות אקסומין בתקשורת, ולאחר מכן לבודד את התרבות התאית על ידי צנטריפוגה של תרבויות ההשעיה או שאיפה ישירה של מדיית התרבות מתרבויות תאים חסיד.
- צנטריפוגה את המדיה שנאספו ב 2000 x g עבור 30 דקות כדי להסיר את הפסולת ולשחזר את supernatant.
- לסנן את התרבות הבהירה supernatant באמצעות מסנן חלבון 0.45 יקרומטר נמוך המסנן של הקיבולת המתאימה (למשל 250 mL polyethersulfone יחידת סינון ואקום).
- לרכז את פילטרט וכתוצאה מכך על ידי צנטריפוגה ב 3200 x g באמצעות 100,000 משקל מולקולרי הנומינלית מערכת מסנן לנפח 250 μl הסופי. לאסוף את אמצעי האחסון שנשמר ממסנן זה, ולאחר מכן לשטוף את המסנן עם 200 μL PBS, ולשלב את העוצמה לשטוף זה עם האקסוכמה לדוגמה שנאספו נפח.
- צנטריפוגה את המדגם הזה ב 21,000 x g עבור 45 דקות ובזהירות לשחזר את supernatant, מטפל לא לאסוף כל חומר זירז.
- צנטריפוגה את supernatant התאושש ב 100,000 x g עבור 3 שעות כדי לזרז את האקסוזומים. מנושף את סופרנטאנט ואוספים את האקכמה גלולה ב 100 μL PBS.
- אחסן את השפחות התוצאה ב-4 ° צ', אם נעשה בה שימוש בתוך 24 שעות או ב-80 ° c לאחסון ארוך טווח.
הערה: אין לבצע כפוף לדגימות אקסוסיביות כדי לחזור על מחזורי הפשרת הקפאה. - לכמת את ההשעיה של אקסוכמה השעיה לאחר ערבוב על ידי מדידה ישירה של מספרי אקסוחלק (g., על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק או לחוש דופק התנגדות מתוך חישה או על ידי מדידת ריכוז החלבון של אקסוכמה lysates על ידי מיקרו-בינובצ'ונאינic שיטת חומצה, או שיטה שוות ערך, כאמצעי לקירוב כמות אקסוכמה)16,19.
- צור קבוצה של מדלל סדרתי של ההשעיה אקסוכמה כדי לאפשר השוואה של אות ננו-חלקיק לקלט אקסוכמה מספר או תוכן חלבון.
- העבר 1 μL של כל מתקן רגיל לכל אחד הבארות שלו שכפול על צלחת החדר.
הערה: ניתן להשתמש בעקומות סטנדרטיות כדי לחשב את השיפוע של קו המתאם בין האות הננו-חלקיק לבין הריכוז היחסי (1) הערכת ביצועי התקן ו-(2) לקבוע את הריכוזיות היחסית של אקסוזומים מטרה בדגימות נסיוניות.
4. עיבוד בדיקות פלזמה או נסיוב האדם
- לאסוף דגימות פלזמה או סרום לפי שיטות סטנדרטיות ולאחסן ב-80 ° צ' עד הצורך לניתוח אקסוכמה. הפשרת דגימות במהירות בטמפרטורת החדר אמבט מים. מערבבים שוב ושוב את הדגימות המופשרים על ידי היפוך כדי לקדם השעיה
הערה: ייתכן שתוצאות הסרום והפלסמה לא יהיו שוות ערך, מאחר שקיימת שחרור משמעותי של האקסוזומים במהלך תגובת הקרישה. - הפלזמה הצנטריפוגה או דגימות הנסיוב ב 500 x g עבור 15 דקות כדי לזרז אגרגטים חלבון ופסולת אחרים. העבר מערך של מדגם פלזמה או סרום לצינורית טרייה והוסף את ה-PBS להפקת דילול 1:1. מערבבים את המדגם מדולל על ידי היפוך עדין או להיפוך, לפי הצורך. העבר 1 μL של כל הבולם פלזמה או סרום לכל אחד שכפול שלו בארות על צלחת החדר.
5. אקסוחלק לכידה ואיתור
- טען בארות של שקופית לכידת EV חסום עם 1 μL/טוב של מדגם אקסוחלק, באמצעות 8 משכפל לכל מדגם, ו מודיית את השקופית לילה ב 4 ° c בחדר מחולל לחות. מטפי את כל הבארות לדוגמה ולאחר מכן להוסיף 1 μL/טוב של PBS לשטוף בארות ולהסיר אקסוזומים לא מאוגדים ומזהמים אחרים ממדגם האקסוכמה טעון.
- לטעון בארות לדוגמה עם 1 μL/טוב של השעיה בעבר מוכן ההשעיה של הבנק (ראה סעיף 1 לעיל) ו מודקות את השקופית עבור 2 h ב 37 ° c בחדר מחולל לחות. מייבש את הפתרון ננו-חלקיק ולשטוף את השקופית ב-PBS בתוספת 0.01% יצירת רצף-20 (PBST) עבור 10 דקות באמצעות מערבל, ולאחר מכן מייבשים ולשטוף את כל הבארות לדוגמה עם מים מוהים עבור 10 דקות באמצעות מערבל מסתובב, והאוויר יבש עבור הדמיה LMDFM הבאים.
הערה: מקדמי הווריאציה (קורות חיים) מוערך משמונה שכפול של אותה דוגמית. דגימות של קורות חיים > 20% נחשבות לבלתי אינפורמטיביות ואמורות לחזור על עצמן, אם יש דגימה מספקת.
6. DFM לכידת תמונה
- לכידת תמונות עבור כימות אקסוזום תחת תאורה עקבית באמצעות מצלמה דיגיטלית המצורפת מיקרוסקופ מצויד בקבל שדה כהה (1.2 < NA < 1.4) ו מטרה 4x העסקת הזמן חשיפה של 1/220.
- פתח את תוכנת לכידת התמונות.
הערה: אנו משתמשים בתוכנות לדימות מיקרוסקופ שקלים (ראו טבלת חומרים) עבור הפרוטוקול המתואר להלן, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת שיכולה להתאים לפרמטרי לכידת התמונות שלה. שניס-אלמנטס תוכנה לדימות מציג היא תוכנית עצמאית חינם כדי להציג קבצי תמונה וערכות נתונים המכיל ניתוח, הדמיה וכלים בארכיון. הפרמטרים להלן גם עבור מיקרוסקופ עם פוקוס אוטומטי ובשלב אוטומטי המאפשר תמונות מרובות להיות בשבי באופן אוטומטי תפור לתמונה אחת. - הצב את השקופית הפוך על הבמה במיקרוסקופ, להתאים את מיקום השקופית ולהחיל טיפה קטנה של שמן טבילה בגב השקופית, שם עדשת העבה לקשר את השקופית.
- לחץ על לחצן live בממשק התוכנה, וכוונן את זמן החשיפה מול תקן ריכוז גבוה היטב כדי לוודא שהתמונה אינה רוויה.
- פתח את החלון ' סרוק תמונה גדולה ' מהכרטיסיה רכישה והגדר את הפרמטרים של ממשק התוכנה כדלקמן: מאקרו אופטי תמונה conf = נוכחי; המטרה: 2:10x, סריקת אופטי conf = הנוכחי, המטרה: 2:10x; תפירת חפיפה = 20%; תפרים דרך = נתיב אופטימלי.
- בחר יצירת תמונה גדולה, סגור תריס פעיל במהלך תנועת הבמה, לחכות לפני כל לכידה: 20 ms, להתמקד באופן ידני בהתחלה, ולהשתמש צעד אחר צעד מיקוד כל 20 שדה. הגדרה זו תישמר עם התמונות הסרוקות.
- הזז את שלב המיקרוסקופ כדי להגדיר את המגבלות התחתונות השמאלית העליונה של שדה סריקת היעד. להתאים את המוקד כדי להשיג תמונה ברורה על הצג ולהתאים את הגדרות העבה תאורה סביבתית לפי הצורך כדי למזער את אי סדרים תאורה בתמונה ממוקדת.
- נקוב בשמות של קובץ פלט התמונה בתוכנה. לחץ על לחצן הסריקה ולאפשר למיקרוסקופ לסרוק וליצור ולשמור תמונה תפור של השקופית כולה.
- פתח את התמונה השמורה עם תוכנת לכידת התמונות שאתה משתמש בה ושמור אותה בקנה מידה 1/8 לניתוח הבא בתוסף ה-DSM ב-ImageJ.
7. ניתוח תמונה DFM
- הורד את התוכנית ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). התקן את תוסף האלגוריתם של DSM לתוך ImageJ באמצעות ההוראות המפורטות ב-https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
- פתח את התוכנה ImageJ ולאחר מכן הגדר את פרמטרי הקלט הבאים בתוך אלגוריתם ה-DSM: סף מתאר (Ct) = 253.020, הקלד = Red, סולם מרכזי (S) = 0.8, נמוך (Lt)/גבוה (Ht) מגבלת הקוונפיקציה = 0/62.
- פתח את התמונה השמורה מסעיף 6.8 עם ImageJ. בחרו בלחצן ' סריקת DSM ' מהכרטיסיה ' תוספים ', ולאחר מכן הגדירו את מספר הטורים והשורות בהתאם לתמונה שנפתחה. התוכנית יכולה לזהות את אזורי גילוי ולנתח את עוצמת פיזור של ננו-חלקיק בהתאם לאזורים באופן אוטומטי. הגדר את פרמטרי הקלט הבאים בתוך חלון הסריקה של DSM : שינוי גודל של אחוז = 25, קוטר ספוט (בפיקסלים) = 190-200, טווח קוטר = 32, קוטר התוספת (בפיקסלים) = 8, תצורת DSM-נמוכה מגבלה = 0, מגבלה גבוהה = 62, במרחק סמוך = 100, חיסור הטיה = 0.
הערה: התוצאות של עוצמת פיזור של ננו-חלקיק משקפות את כמות האקסוזומים המאוגדים בשקופית.
Representative Results
Multi-היטב חלבון A/G מצופה שקופיות (איור 1A) היו פונקציונליזציה עם נוגדן Anti-EphA2 ולאחר מכן משמש ללכוד במיוחד האקסוזומים EphA2-חיוביים מדגימות סרום של חולים עם וללא סרטן הלבלב (1 μl/ובכן) ו דגירה עם nanorods זהב מצועם עם נוגדן anti-CD9 (איור 1B). תמונות DFM של אור הפזורים חלקיקים אלה נותחו באמצעות תוסף DSM בתוכנת ImageJ כדי לכמת את EphA-2 חיובי חיובית בתוך כל טוב. אלגוריתם ה-DSM מגדיר באופן אוטומטי את גבול המדגם, מסנן את הרעש מחפצים, מחשב את האות הפזורים מכל באר ומוציא מידע זה (איור 2). אלגוריתם ה-DSM מחליש בחוזקה את ממצאים של פיזור אור מפני שריטות או פסולת הנמצאים במדגם ומשפרת את הרגישות ואת היכולת לגילוי ננו-חלקיק ויכולה לעבד באופן אוטומטי אצווה של תמונות שקופיות לתפוקה גבוהה השתמש. אלגוריתם זה משתמש בפקודות ImageJ ובקלט פרמטרים על-ידי המשתמש כדי להפחית את רקע התמונה, לחשב את אות הפיזור מכל באר וליצור פלט של נתונים וקובץ תמונה (איור 3). אזורי עניין מוגדרים על-ידי גבולות בעלי עוצמה גבוהה בתמונת הלכידה באמצעות פונקציית סף המתאר של תוכנית המאקרו ImageJ. מנתח תמונה להשתמש סף מתאר מוגדר מראש ופרמטרים תמונה כדי לחשב את עוצמת הפיזור ננו-חלקיק עבור כל טוב.
כפי שדווח בעבודתנו הקודמת (מידע משלים של ליאנג ואח '6), אקזומים מבודדים מתרבויות התאים panc-1 המאופיינת במיקרוסקופיה אלקטרון ובכתם המערבי הציגו את טווח הגודל, מורפולוגיה, וסמן החלבון ביטוי התואם את הדגימה האקסומית גבוהה. PANC-1 האקסוזומים, מוכן עם אותו ההליך כמו העבודה הקודמת שלנו, שימשו כאן כדי לאמת את הטיפול שלנו nPES עבור כימות אקסומין. הבחינה הזאת השתמשה נוגדן anti-EphA2 ללכוד אוכלוסיה גדולה של אקסוזומים מן האוכלוסייה הכולל אקסומסוימים ונוגדן נגד מCD9 החלבון הכללי כדי לזהות אקסוזומים שנתפסו. התוצאות שהתקבלו באמצעות מדולל panc-1 אקכמה דגימות, עם ריכוזי חלבון החל מ 0.24 כדי 1.2 μg/μl, הראה לשגות טוב ב שכפול בארות (איור 4a) ומתאם ליניארי חזק בין תגובת פיזור ו אקקצת ריכוז חלבונים (איור 4B).
כדי להדגים את היישום הפוטנציאלי של שיטה זו, דגימות סרום מחולים עם וללא סרטן הלבלב נותחו כדי לזהות את השפע של הנסיוב אקסוזומים ביטוי סרטן משויך ביוארקר EphA2, באמצעות נוגדן אנטי EphA2 כדי ל ישירות ללכוד אקסוזומים היעד מ סרום חלקיקים מצועם עם נוגדן anti-CD9 לזהות אקסוזומים מאוגד. ניתוח זה חשף כי דגימות סרום מן החולים בסרטן הלבלב היו רמות גבוהות באופן משמעותי של EphA2 + אקסוזומים (איור 5) מאשר הפקדים שלהם.
איור 1: שיטת הכמת. (א) סכמטי שקופיות מרובות חלבון A/G (192 בארות) המשמשות באותה שיטת. (ב) היעד האקסוזומים במישרין מדגימות, כולל סרום פלזמה, על ידי שלילת פני השטח על הנוגדן לכידת (g. Anti-EphA2 נוגדן) מאוגד לשקופית, ולאחר מכן מודדת עם nanorods זהב מצועם זיהוי נוגדן (למשל נוגדן anti-CD9) לפני ניתוח על ידי ניתוח תמונה DFM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: החלת האלגוריתם של ה-DSM לתמונות LMDFM. תמונות בהגדלה נמוכה מעובדות עם אלגוריתם ה-DSM כדי למנוע אותות רקע וממצאים שעלולים לנבוע משריטות, מערבוב חללים, פסולת ותאורה מדגם אחיד כדי לאפשר זיהוי חזק של אות nanorod זהב, אשר מתואם לריכוז אקקצת. דמות זו הותאמה עם הרשאה מן השמש, D. et al. הפחתת רעש שיטה להפחתת פיזור אור ננו-חלקיק בהגדלה נמוכה מיקרוסקופ שדה כהה תמונות השדה הרחוק. כימיה אנליטית. 88 (24), 12001-12005 (2016). זכויות יוצרים (2016) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכמטית של הפקודות והתפוקות של אלגוריתם DSM. השלבים המצוינים משתמשים בפקודות מקוריות מ-ImageJ וכל פרמטרי הקלט נבחרים בהתאם לדרישות הניסויים באמצעות ממשק משתמש גרפי. דמות זו הותאמה עם הרשאה מן השמש, D. et al. הפחתת רעש שיטה להפחתת פיזור אור ננו-חלקיק בהגדלה נמוכה מיקרוסקופ שדה כהה תמונות השדה הרחוק. כימיה אנליטית. 88 (24), 12001-12005 (2016). זכויות יוצרים (2016) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות nPES LMDFM מייצגים ונתוני פלט DSM. (א) תמונה lmdfm של שיטת npes ניתוח הדרגתי ריכוז של panc-1 אקסוזומים ו (ב) מתאם ליניארי של האות האופטי ו אקסוחלק ריכוז משקופית זו (משמאל לימין: 0.24, 0.356, 0.53, 0.80, 1.20 Μg/μl בהתאמה לכל עמודה). נתונים מוצגים כממוצע ± SE, n = 6, עם מקדם מתאם פירסון R2 = 0.99 ומקדם וריאציה עבור שכפול של כל ריכוז < 0.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: האות LMDFM של EphA2+ אקסוזומים שונה סרום מחולים עם וללא סרטן הלבלב. דגימות סרום שנותחו על ידי npes באמצעות נוגדן לכידת anti-EphA2 (סרטן הקשורים) ו נוגדן זיהוי anti-CD9 (כללי אקסוחלק סמן) הציגו הבדל משמעותי בריכוז של EphA2 + אקסוזומים בדגימות סרום של חולים עם ו ללא סרטן הלבלב (N = 7/קבוצה). תוצאות מוצגות כממוצע ± SE. * *p = 0.002 על ידי מאן-ויטני U-מבחן (דו-צדדי). איור זה שונה מ [יום א', D. et al. הפחתת רעש שיטה עבור כימות ננו-חלקיק פיזור אור בהגדלה נמוכה מיקרוסקופ שדה כהה תמונות השדה הרחוק. כימיה אנליטית. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אקסוזומים נובעים הפולשים מוסדר של קרום האנדומין החיצוני המייצרים גופים multivesicular מערכת מיוחדת של אנדוזומים המכילים מספר גדול של ושלפוחיות intraluminal העוברים היתוך עם קרום פלזמה לשחרר בוגרת האקסוזומים לתוך החלל החילוץ. בשל מסלול biogenesis זה, אקסוזומים יכול לשאת גורמי ממברנה הקשורים שברים ממברנה המרכיבים או הפתיל עם קרום אנדוכמה, כמו גם סוגים שונים של מרכיבים ציטוסולג, ובכך להכיל מטענים של חלבונים, DNA ו-סוגים שונים של RNA (mRNAs, microRNAs, ארוך ללא קידוד RNAs) זה יכול לשקף את הפנוטיפ של התא שלהם מקור20. מאחר שהאקסוזומים מופרשים על-ידי רוב אם לא כל סוגי התאים, יכול להציג הפרשה מוגברת מתאים נגועים או ממאירים, ולצבור ברוב נוזלי הגוף, האקסוזומים הם הנושא של חקירה מקיפה ושיטתית כמו מבטיח מינימלית פולשנית אמצעים כדי לזהות תנאי מחלה ספציפיים לפקח על התגובות שלהם לטיפול21.
אקסומין בידוד, אשר נדרש עבור הניתוחים העדכניים ביותר של האקסוחלק, הוא הליך ארוך ונמרץ עבודה, הגבלת התרגום הקליני של אקסוחלק הקשורים בסמנים עם רלוונטיות רפואית פוטנציאלית. הרבה שיטות בידוד נפוצות (הכללה, גודל-הדרה, משקעים, וכו ') לעתים קרובות לא להבדיל מספיק אקסוזומים (30-100 ננומטר) מ-מיקרו ושלפוחיות (100-1000 ננומטר) ו האפוטוטיים גופים (100 – 5000 ננומטר) עקב חופף בטווחים גודל שלהם או מאפיינים פיזיים או עלול להזיק אקסומין שלמות15. גישות חדשות נמצאות בשלבי פיתוח שעשויים לאפשר מהיר יותר הניתוחים מהירים, אבל זה לא ברור איך זה יכול להיות ליישם רבים של פלטפורמות אלה הגדרות קליניות בשל.
בדוח זה, אנו מציגים גישה הרומן המאפשר ננו-חלקיק מבוססי תפוקה גבוהה אקסופיקציה באמצעות הגדלה נמוכה תמונות מיקרוסקופ שדה כהה. שיטה זו אינה דורשת אקסוכמה טיהור, ציוד ייעודי יקר, או מומחיות טכנית הרומן, ולכן צריך להיות קלה לתרגום מהיר ברוב המחקר והגדרות קליניות. היכולת שלנו ניתן להחיל בדיוק לכמת את הריכוז של היעד אקסוכמה האוכלוסייה הנושאת בסמנים ספציפיים כאשר התוצאות של שיטת מושווה עקומת רגיל, מאז התערוכה שלנו מוצג יש קורלציה לינארית חזקה (R2 = 0.99) בין תגובה אופטית לבין מספר ריכוז. כדי להדגים את הפוטנציאל העולמי האמיתי של גישה זו, יש לנו נתונים שבהם אנו מועסקים בשיטה זו כדי לכמת את הריכוז של מספר ביואריקר הקשורים לסרטן הלבלב בדגימות סרום שהתקבלו מחולים עם ובלי סרטן הלבלב.
ב LMDFM, כל המדגם היטב הוא התמונה כדי למנוע את הטיית הבחירה שנמצאו בניתוח DFM בהגדלה גבוהה, שבו משתמשים חייבים לבחור ישירות את שדות לדוגמה כדי ללכוד עבור ניתוח תמונה בעקבות, אבל הוא כפוף לפריטים פיזור אור מפני השטח אי סדירות, כולל שריטות ופסולת לדוגמה. הרקע הזה יכול להיות מופחת כדי לזהות היעד אקסוחלק הנגזר האות באמצעות אלגוריתם DSM שלנו הפחתת רעש שפועל על התוכנית לניתוח תמונה NIH, ImageJ, אבל הטיפול חייב עדיין להילקח כדי להימנע מציג פריטים כאלה אשר עשוי להפחית את טווח דינמי של השיטת.
החומרים המשמשים בתוך השימוש:
Multi-היטב SuperProtein A/G שקופיות מחזיק 1 μL/טוב נרכשו מ Arrayit Corporation (AGMSM192BC). חלקיקי חלקיקים התקבלו מ Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6.4 x10 12/Ml). תמונות DFM נתפסו עם מצלמה דיגיטלית ניקון DiR2 המצורפת למיקרוסקופ Ti ליקוי לליקוי ניקון, עם תאורה עקבית וזמן חשיפה 1/220 s. קו התאים PANC-1 המשמש במחקר זה נרכש מאוסף התרבות סוג אמריקאי.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה הייתה נתמכת בעיקר על ידי מימון מחקר שסופקו על ידי NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 ו R21Al126361-01), הנציבות הרפואית של אריזונה ועדת המחקר (ABRC) פרס החוקר הצעיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
