Summary
ويعوق الترجمة السريرية للخلايا الحيوية المشتقة من الخلايا الاحيائيه المصابة والخبيثة الافتقار إلى طرق التحديد الكمي السريعة والدقيقة. يصف هذا التقرير استخدام صور المجهر منخفضه التكبير في الحقل المظلم لقياس أنواع فرعيه معينه من النوع exosome في المصل الصغير الحجم أو عينات البلازما.
Abstract
الخلايا المصابة أو الخبيثة في كثير من الأحيان تفرز المزيد من الجذور ، مما يؤدي إلى مستويات مرتفعه من الأورام المصاحبة للمرض في الدورة الدموية. هذه التماثيل لديها القدرة علي ان تكون بمثابه المؤشرات الحيوية لتشخيص الامراض ورصد تطور المرض واستجابه العلاج. ومع ذلك ، فان معظم إجراءات تحليل exosome تتطلب العزلة exosome وتنقيه الخطوات ، والتي عاده ما تستغرق وقتا طويلا وكثيفه العمالة ، التالي من فائده محدوده في الإعدادات السريرية. يصف هذا التقرير الاجراء السريع لتحليل المؤشرات الحيوية المحددة علي الغشاء الخارجي لل exosomes دون الحاجة إلى عزل منفصلة وخطوات تنقيه. في هذه الطريقة ، يتم القبض علي التماثيل علي سطح الشريحة من قبل الأجسام المضادة الخاصة exosomes ومن ثم التهجين مع مجسات الأجسام المضادة جسيمات متناهي-مترافق محدده لمرض. بعد التهجين ، يتم تحديد وفره من السكان exosome الهدف عن طريق تحليل منخفضه التكبير المجهر الحقل المظلم (LMDFM) الصور من جسيمات نانويه منضم. ويمكن اعتماد هذا النهج بسهوله للبحوث والاستخدام السريري لتحليل الاغشيه المرتبطة بالغشاء الحيوي exosome مرتبطة بالمرض.
Introduction
يتم الإفراج عن التماثيل من معظم أنواع الخلايا وتلعب دورا رئيسيا في الاتصالات من الخلية إلى الخلية ، بما في ذلك العمليات الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بالامراض المختلفة ، لأنها يمكن ان تكون موطنا لأنسجه محدده أو أنواع الخلايا ، وتحتوي علي مجموعه متنوعة من الأحماض النووية ، والبروتينات ، والدهون التي تعكس الخلية الاصليه ويمكن ان تمارس اثارا تنظيميه علي الخلايا المتلقية لها1،2،3،4. غالبا ما تفرز التماثيل في مستويات مرتفعه في الدول المرض ، ويمكن ان تتفاعل مع كل من الخلايا المتجاورة والبعيدة ، ووجدت في تركيز عال نسبيا في الدورة الدموية ، فضلا عن معظم سوائل الجسم الأخرى ، بما في ذلك اللعاب والبول والبنكرياس والصفراء عصير ، وغسل القصبات السائل5، 6،7،8،9،10،11. هذا وفره واستقرار التماثيل في سوائل الجسم البشري ، إلى جانب طبيعتها الغنية بالمعلومات ، يجعلها العلامات الحيوية المثالية لتشخيص الامراض ورصد العلاج.
وهذا يشمل الأورام المشتقة من الورم (TDEs) ، والتي تحتوي علي عوامل الورم محدده أو انتقائية ، والتي يمكن ان تكون بمثابه المؤشرات الحيوية المرض ، بما في ذلك الأورام المرتبطة الورم المصاحبة. TDEs يمكن ان تشارك في أعاده عرض البيئة المجهرية الورم لتسهيل نمو الورم والانبثاث ، وتنظيم الاستجابات المضادة للورم12. زيادة إفراز TDE هو النمط الظاهري الشائع لمعظم أنواع السرطان والعديد من الميزات من البيئة المجهرية الورم ، بما في ذلك نقص الأكسجين ، والحموضة الحمضية ، والتهاب ، ومن المعروف ان تعزيز إفراز exosome. ومن المستغرب ، نظرا لعدد من الخلايا التي تفرز الجذور ، وزيادة في المستوي الإجمالي exosomes يمكن ، في حد ذاته ، تعمل بوصفها العلامات البيولوجية السرطان. علي سبيل المثال ، وجدت دراسة حديثه ان تركيز EV الكلي في عصير الصفراء يميز الخبيثة وغير الخبيثة في المرضي تضيق القناة الصفراوية المشتركة مع 100 ٪ دقه7. وقد تم العثور علي نتائج مماثله مع الدراسات باستخدام سوائل الجسم الأخرى, بما في ذلك البلازما. ومع ذلك ، نظرا لاحتمال الخضوع لاختلاف الموضوع ، وغيرها من العوامل المربكة ، ركزت معظم الدراسات التحقيق في التماثيل البيولوجية كمرض المؤشرات الحيوية علي الكشف عن المؤشرات الحيوية التي ترتبط بشكل انتقائي مع TDEs بدلا من مجموع exosomes ارقام.
ترجمه المؤشرات الحيوية exosome في الممارسة السريرية ، ومع ذلك ، لا يزال تحديا لان معظم التقارير التي أبلغت عنها النهج المقايسة تتطلب وقتا طويلا وإجراءات العزل كثيفه العمالة 13. وتشمل أساليب العزل exosome شعبيه حاليا ultracentrifugation حلول ، والتدرجات الكثافة ، وحجم الاستبعاد ، والامطار المشتركة ، والتقاط التقارب ، ونهج العزلة ميكروفلويديك. Ultracentrifugation حلول هو "المعيار الذهبي" الأسلوب ، والأكثر شيوعا لعزل exosome ، ولكن هذا الاجراء يستغرق وقتا طويلا والنتائج في الضرر exosome والتكتلات غشاء exosome ، وتنتج عينات exosome التي هي ملوثه مع البروتينات والبروتينات الدهنية وغيرها من العوامل التي يمكن ان تؤثر علي التحليلات اللاحقة14. معظم أساليب العزلة exosome ، بما في ذلك التسميد ، لا يمكن فصل التماثيل (30-150 نانومتر) من الحويصلات الصغرى (100-1000 نانومتر) والهيئات ابوتوتيك (100-5000 نانومتر) ، التي تنشا من خلال أليات مختلفه ولها وظائف مختلفه ، نظرا لحجم التداخل بين هذه المجموعات ، وتنوع السكان exosome15. هناك حاجه إلى نهج جديده لتحسين حساسية واستنساخ من اختبارات exosome عن طريق تحسين الانتعاش exosome مع الحد من الضرر exosome والتلوث ، علي الرغم من ان اي اختبارات علي أساس مثل هذه الأساليب سوف تحتاج أيضا إلى ان تكون الأمثل لجعلها مناسبه للترجمة إلى التطبيقات في الإعدادات السريرية.
وقد اقترحت العديد من الدراسات الحديثة لاستخدام منصات متكاملة للتقاط وتحليل التماثيل مباشره من سوائل الجسم. تستخدم هذه الطرق ميكروفلويدريك ، كهربية ، التقاط تقارب ، وطرق أخرى مختلفه للعزل exosome ، والكيمياء الكهربائية ، والرنين البلازمون سطحي السطحية ، وغيرها من الطرق للكشف عن التماثيل الملتقطة. وليس من الواضح مدي جدوى العديد من هذه النهج في البيئات السريرية ، بسبب تعقيدها ، والنفقات ، وانخفاض الانتاجيه أو غيرها من القضايا.
وقد وضعنا الفحص السريع وغير مكلفه التي يمكن استخدامها للقياس الكمي الحساسة والمحددة من التماثيل الاجماليه والأنواع الفرعية المحددة exosomes ، بما في ذلك الامراض المرتبطة بالمبيدات ، مثل TDEs ، والذي يتطلب سوي كميه صغيره من عينه والتي توظف سير عمل مبسطه مناسبه للبيئات السريرية. في هذا الفحص ، يتم تغليف شريحة مع الأجسام المضادة التي تربط اما علامة exosome محدده أو محدده المرض التي أعرب عنها علي سطح exosome من أجل التقاط مباشره التماثيل المستهدفة الموجودة في البلازما حجم صغير أو عينات المصل تطبيقها علي الآبار علي الشريحه. ثم يتم تهجين الجسيمات متناهي الملتقطة مع الأجسام المضادة المترافقة التي تعترف بالعلامات الحيوية للفائدة علي هذه المبيدات الحشرية ، والتي يمكن ان تكون اما مؤشر exosomes عام أو عامل محدد لنوع فرعي exosomes الفائدة. ثم يتم التقاط صور هذه الآبار النموذجية باستخدام مجهر الحقل المظلم (بورصة دبي) وتحليلها لقياس الضوء المتناثر من الجسيمات النانويه المرتبطة بالفوائد الملتقطة في كل عينه جيدا6،16،17. وعلي وجه الخصوص ، فان تصوير عينه كامله بشكل جيد من خلال التكبير المنخفض في سوق دبي السينمائي (LMDFM) يتجنب تحيز الاختيار الذي تم مواجهته بتحليلات عاليه التكبير في سوق دبي السينمائي عندما يجب علي المستخدمين اختيار الحقول التي سيتم التقاطها لتحليل الصور اللاحقة مباشره. تحليل الصور LMDFM يخضع لتشتت الضوء التحف من المخالفات السطحية ، بما في ذلك الخدوش والحطام عينه ، ولكن هذه الخلفية يمكن ان تخفض باستخدام خوارزميه الحد من الضوضاء بسيطه وضعنا لتشغيل علي برنامج تحليل صوره المعاهد القومية للصحة ، ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). تطبق هذه الخوارزميه أولا عتبه كفاف الإدخال التي يتم استخدامها للكشف عن حدود العينة جيدا لتعريف منطقه الصورة للتحليل اللاحق. ثم يتم تقسيم المنطقة المحددة من قبل هذه المنطقة كفاف إلى اشاره منفصلة موجودة في القناات الحمراء والزرقاء والخضراء من الصورة ويتم طرح القناة الزرقاء من القناة الحمراء لأزاله الاشاره الناشئة عن التحف السطحية والاضاءه متفاوتة من nanorod اشاره.
توضح هذه المقالة كيفيه استخدام هذا الفحص للتحديد الكمي لمستويات exosome الاجماليه أو المحددة بسرعة في عينات البلازما أو المصل.
Protocol
1-اعداد مجسات جسيمات متناهي
ملاحظه: هذا الفحص يستخدم الوظيفية Nanorods الذهب (AuNRs ؛ 25 نانومتر قطر x 71 nm طول) التي يتم مترافق بالصدفة مع البوليمرات المحايدة (AV) ولها الذروة الرنين البلازما السطحية التي تنتج احمر (641 nm الذروة) اشاره تشتت علي سوق دبي السينمائي الاضاءه.
- غسل 40 μL من AuNR-AV (2.56 x 1011 الجسيمات) ثلاث مرات مع 200 ΜL تلفزيوني (pH 7.0) بواسطة طرد والطموح (8,500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 10 دقائق) ، تليها الطرد النهائية والطموح الخطوة بعد ذلك يتم تعليق بيليه اونار-av في 40 μL تلفزيوني.
- مزيج هذا AuNR-AV التعليق مع 10 μL الأجسام المضادة الحيوية (0.5 ملغ/مل) محدده لمستضد علي سطح النوع الفرعي exosome من الفائدة و 150 μL من تلفزيوني ومن ثم خلط في 4 درجه مئوية ل 2 ح باستخدام خلاط للسماح للمحايد البيوتين ملزمه للوصول إلى الانتهاء.
- غسل الأجسام المضادة الناتجة-اونرس مترافق (Aunrs-مفتش) ثلاث مرات عن طريق الطرد والطموح (6,500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 10 دقائق) ، ومن ثم تعليقها في 200 ΜL التلفزيوني وتخزينها في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظه: يجب استخدام تقنيه معقمه وأوقات التخزين قصيرة لتجنب التلوث وتدهور من المفتشين. فمن الأفضل لاستخدام الأجسام المضادة-مترافق اونرس في غضون 24 ساعة من الاقتران بهم.
2. اعداد الشرائح التقاط EV
- تمييع الأجسام المضادة التقاط exosome إلى 0.025 ملغ/مل في الاذاعه التلفزيونية وأضافه 1 μl/well من هذا التخفيف علي الشريحة البروتين متعددة الآبار a/G ، ومن ثم احتضان هذه الشريحة في 37 درجه مئوية ل 1 ح في غرفه مرطب للسماح الأجسام المضادة القبض ملزمه للبروتين a/G يجمدها علي الشريحة.
- يستنشق الآبار لأزاله الأجسام المضادة غير المنضمة ، ويغسل الآبار ثلاث مرات بالاضافه والطموح من 1 μL/well من تلفزيوني ، ثم تحميل كل بئر مع 1 μL من حجب العازلة (انظر جدول المواد) واحتضان الشريحة ل 2 ح في 37 درجه مئوية في غرفه ترطيب ل b قفل اي مواقع البروتين المتبقية ملزمه.
- يستنشق الآبار لأزاله العازلة حجب ، وغسل الآبار ثلاث مرات بالاضافه والطموح من 1 μL/well من تلفزيوني ، وعلي الفور استخدام الشرائح المحظورة للتقاط exosome والتحليل.
3. اعداد منحني القياسية
- لتحديد كميه الوفرة المطلقة أو النسبية لنوع فرعي exosome محدده بدقه ، يجب علي المستخدم إنشاء منحني قياسي مع السكان exosome النقي الذي يعبر بشكل موحد عن الحيوية السطحية exosome من الفائدة. تحلل هذه الدراسة وفره من التماثيل التي تعبر عن بروتين الغشاء المصاحب للانبثاث ، ومستقبلات افرين A2 ، التي لها علاقة مع مرحله سرطان البنكرياس والتكهنات6،18.
ملاحظه: ومن المعروف ان خط خليه سرطان البنكرياس البشري PANC-1 والتماثيل الخاصة به للتعبير عن هذا البروتين وتم استخدام التماثيل المعزولة من هذا الخط الخلوي لتوليد منحني قياسي لقياس عدد التماثيل التي تعبر عن هذا البروتين في exosomes معقده عينات. - [كلتثر سل] ل 48 ساعات في 37 [ك] في [سيروم-فر] ثقافة أوساط ان يسمح [ااكسسوم] تراكم في الأوساط, بعد ذلك يعزل خليه ثقافة [سوبرنتنتس] ب طرد من تعليق ثقافات أو طموح مباشره من ثقافة أوساط من ملتصقة خليه ثقافات.
- الطرد المركزي وسائل الاعلام التي تم جمعها في 2000 x g لمده 30 دقيقه لأزاله الحطام واستعاده supernatant.
- تصفيه الثقافة الموضحة ماده طافي من خلال 0.45 μm البروتين منخفضه ملزمه وحده فلتر من القدرة المناسبة (علي سبيل المثال ، 250 mL polyايثولسولفون فراغ وحده الترشيح).
- التركيز علي الترشيح الناتجة من قبل طرد في 3200 x g باستخدام 100,000 الاسمية الوزن الجزيئي نظام تصفيه الحد إلى حجم النهائي 250 μl. جمع حجم الاحتفاظ بها من هذا الفلتر ، ثم غسل الفلتر مع 200 μL تلفزيوني ، والجمع بين هذا حجم الغسيل مع حجم عينه exosome التي تم جمعها.
- الطرد المركزي هذه العينة في 21,000 x g لمده 45 دقيقه واستعاده بعناية supernatant ، مع الحرص علي عدم جمع اي مواد عجلت.
- طارد الطرد المركزي تعافي ماده طافي في 100,000 x g لمده 3 ساعات ليعجل exosomes. يستنشق بعيدا ماده طافي وجمع بيليه exosome في 100 μl تلفزيوني.
- تخزين تعليق exosome الناتج في 4 درجه مئوية إذا ما استخدمت في غضون 24 ساعة أو في-80 درجه مئوية للتخزين علي المدى الطويل.
ملاحظه: لا تخضع عينات exosome لتكرار دورات تجميد الذوبان. - القياس الكمي لتعليق exosome بعد خلطها عن طريق المقياس المباشر للأرقام exosome (علي سبيل المثال ، عن طريق تحليل تتبع جسيمات متناهي أو الاستشعار عن بعد النبض مقاوم انضباطي أو عن طريق قياس تركيز البروتين من المضادات الحشرية exosome بواسطة الصغرى bicinشونغينيتش فحص حمض ، أو طريقه مكافئه ، كوسيلة لتقريبي كميه exosome)16،19.
- توليد مجموعه من التخفيفات التسلسلية للتعليق exosome للسماح بالمقارنة بين اشاره جسيمات متناهي لإدخال رقم exosome أو محتوي البروتين.
- نقل 1 μL من كل معيار exosome لكل من الآبار استنساخها علي لوحه الفحص.
ملاحظه: يمكن استخدام المنحنيات القياسية لحساب الميل من خط الارتباط بين اشاره جسيمات متناهي وتركيز exosome إلى (1) تقييم أداء الفحص و (2) تحديد التركيز النسبي من التماثيل المستهدفة في عينات تجريبية.
4. معالجه عينات البلازما البشرية أو المصل
- جمع عينات البلازما أو المصل بواسطة الأساليب القياسية وتخزين في-80 درجه مئوية حتى الحاجة للتحليل exosome. ذوبان العينات بسرعة في حمام المياه درجه حرارة الغرفة. اخلط العينات المذابة بشكل متكرر من خلال الانقلاب لتعزيز التعليق المتجانس.
ملاحظه: قد تكون النتائج من عينات المصل والبلازما لا تعادل ، لان هناك إطلاق كبير من التماثيل اثناء تفاعل التخثر. - البلازما الطرد المركزي أو عينات المصل في 500 x ز ل 15 دقيقه ليعجل المجاميع البروتين وغيرها من الحطام. نقل قسامه من عينه البلازما أو المصل إلى أنبوب جديد وأضافه تلفزيوني لتوليد 1:1 التخفيف. اخلط العينة المخففة بواسطة المزج اللطيف أو الانقلاب ، حسب الاقتضاء. نقل 1 μL من كل البلازما أو المصل تعليق لكل من الآبار تكرارها علي لوحه الفحص.
5. التقاط وكشف exosome
- تحميل الآبار من شريحة القبض EV المحظورة مع 1 μL/بئر من عينه exosome ، وذلك باستخدام 8 نسخ متماثلة لكل عينه ، واحتضان الشريحة بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في غرفه مرطب. يستنشق كل ابار العينة ومن ثم أضافه 1 μL/well من تلفزيوني لغسل الآبار وأزاله السموم غير المنضمة وغيرها من الملوثات من عينه exosomes المحملة.
- تحميل الآبار عينه مع 1 μL/well من السابق استعداد التعليق المفتش (انظر القسم 1 أعلاه) واحتضان الشريحة ل 2 ح في 37 درجه مئوية في غرفه ترطيب. يستنشق الحل الجسيمات متناهي ويغسل الشريحة في النظام التلفزيوني تستكمل مع 0.01 ٪ توين-20 (PBST) لمده 10 دقيقه باستخدام خلاط ، ثم يستنشق وغسل جميع الآبار عينه مع الماء منزوع الأيونات لمده 10 دقيقه باستخدام خلاط الدورية ، والهواء الجاف للصور LMDFM اللاحقة.
ملاحظه: يتم تقييم معاملات التباين بين الفحص (CVs) من ثمانيه نسخ متماثلة من نفس العينة. تعتبر العينات التي تعرض السيرة الذاتية > 20 ٪ غير مفيده وينبغي تكرارها ، إذا كان هناك عينه كافيه.
6. تسجيل صور سوق دبي السينمائي
- التقاط الصور للقياس الكمي exosome تحت أضاءه متسقة باستخدام كاميرا رقميه تعلق علي المجهر مجهزه مكثف الحقل المظلم (1.2 < NA < 1.4) وهدف 4x استخدام الوقت التعرض 1/220 s.
- افتح برنامج التقاط الصور.
ملاحظه: نحن نستخدم NIS-عناصر المجهر التصوير البرمجيات (انظر جدول المواد) للبروتوكول الموضح أدناه ، ولكن من الممكن استخدام برامج أخرى التي يمكن ان تتطابق مع المعلمات التقاط الصورة. برنامج التصوير لعارضات NIS هو برنامج مستقل مجاني لعرض ملفات الصور ومجموعات البيانات التي تحتوي علي أدوات التحليل والتصور والارشفه. المعلمات أدناه هي أيضا لمجهر مع التركيز البؤري التلقائي والمرحلة المؤتمتة التي تسمح صور متعددة ليتم التقاطها تلقائيا ومخيط في صوره واحده. - وضع الشريحة راسا علي عقب علي مرحله المجهر ، وضبط موقف الشريحة وتطبيق قطره صغيره من النفط الغمر علي الجانب الخلفي من الشريحة ، حيث عدسه مكثف الاتصالات الشريحة.
- انقر فوق الزر live في واجهه البرنامج ، واضبط وقت التعريض الضوئي علي مستوي التركيز العالي بشكل جيد لضمان عدم تشبع الصورة.
- فتح اطار " صوره كبيره المسح الضوئي " من علامة التبويب الحصول علي وتعيين معلمات واجهه البرنامج علي النحو التالي: صوره ماكرو البصرية conf = الحالي; الهدف: 2:10x ، المسح الضوئي conf = الحالية ، الهدف: 2:10x ؛ خياطه التراكب = 20 ٪ ؛ خياطه عبر = المسار الأمثل.
- اختر إنشاء صوره كبيره، اغلق الغالق النشط اثناء حركه المرحلة، انتظر قبل كل التقاط: 20 مللي ثانيه، التركيز يدويا عند البدء، واستخدام التركيز خطوه بخطوه كل 20 حقل. سيتم حفظ هذه الإعدادات باستخدام الصور الممسوحة ضوئيا.
- انقل مرحله المجهر لتحديد الحدود السفلية اليمني العلوية اليسرى لحقل المسح المستهدف. اضبط التركيز لتحقيق صوره واضحة علي الشاشة واضبط إعدادات المكثف والاضاءه البيئية حسب الضرورة لتقليل اي مخالفات للاضاءه في الصورة المركزة.
- اسم ملف إخراج الصورة في البرنامج. انقر فوق زر المسح الضوئي والسماح لمجهر لمسح وإنشاء وحفظ صوره مخيط من الشريحة بأكملها.
- افتح الصورة المحفوظة مع برنامج التقاط الصور الذي تستخدمه واحفظه علي مقياس 1/8 للتحليل اللاحق علي المكون المساعد DSM في ImageJ.
7. تحليل صور سوق دبي السينمائي
- قم بتنزيل برنامج ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). تثبيت المساعد خوارزميه DSM في ImageJ باستخدام الإرشادات المذكورة في https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
- فتح برنامج ImageJ ، ثم تعيين معلمات الإدخال التالية داخل خوارزميه DSM: عتبه كفاف (Ct) = 253.020 ، نوع = الأحمر ، مقياس المركز (ق) = 0.8 ، منخفض (Lt)/عاليه (Ht) الحد الكمي = 0/62.
- افتح الصورة المحفوظة من القسم 6.8 مع ImageJ. اختر زر المسح الضوئي DSM من علامة التبويب الإضافات ، ثم حدد عدد الاعمده والصفوف وفقا للصورة المفتوحة. يمكن للبرنامج التعرف علي المناطق الكشف وتحليل كثافة مبعثر من جسيمات متناهي في المناطق وفقا تلقائيا. تعيين معلمات الإدخال التالية داخل اطار المسح الضوئي DSM : تغيير حجم النسبة المئوية = 25 ، بقعه القطر (بالبكسل) = 190-200 ، قطر النطاق = 32 ، زيادة قطر (بالبكسل) = 8 ، DSM التكوين-منخفض الحد = 0 ، الحد الأعلى = 62 ، المسافة المتاخمة = 100 ، طرح التحيز = 0.
ملاحظه: تعكس نتائج كثافة مبعثر من جسيمات متناهي كميه المجلدات المنضمة علي الشريحة.
Representative Results
متعددة الآبار البروتين A/G الشرائح المغلفة (الشكل 1A) كانت وظيفية مع الأجسام المضادة لEphA2 ومن ثم تستخدم للتقاط علي وجه التحديد EphA2 التماثيل الايجابيه من عينات المصل من المرضي الذين يعانون من سرطان البنكرياس ودون (1 μl/well) وحضن مع nanorods الذهب مترافق مع الأجسام المضادة لCD9 (الشكل 1B). وقد تم تحليل صور سوق دبي السينمائي للضوء المتناثرة من هذه الجسيمات النانويه باستخدام البرنامج المساعد DSM في ImageJ البرمجيات لقياس المبيدات الموجبة EphA-2 الايجابيه في كل بئر. خوارزميه DSM يحدد تلقائيا حدود عينه جيدا ، وتصفيه الضوضاء من التحف ، ويحسب اشاره متناثرة من كل بئر ، وإخراج هذه المعلومات (الشكل 2). خوارزميه DSM يخفف بقوة التحف تشتت الضوء من الخدوش أو الحطام الموجودة في العينة ويحسن حساسية واستنساخ الكشف عن جسيمات متناهي ويمكن معالجه تلقائيا دفعه من الصور الشريحة لارتفاع الانتاجيه استخدام. تستخدم هذه الخوارزميه الأوامر ImageJ والمعلمات المدخلات من قبل المستخدم لطرح خلفيه الصورة ، وحساب اشاره تشتت من كل بئر ، وإخراج ملف البيانات والصور (الشكل 3). يتم تعريف مناطق الاهتمام من خلال حدود البئر عاليه الكثافة في صوره التقاط باستخدام داله العتبة المحيطة لبرنامج ImageJ الماكرو. تستخدم تحليلات الصور عتبه كفاف محدده مسبقا ومعلمات الصورة لحساب شده تشتت جسيمات متناهي لكل بئر.
كما ذكر في عملنا السابق (معلومات تكميليه من ليانغ وآخرون6) ، exosomes معزولة من الثقافات خليه panc-1 تتميز بالمجهر الكترون الإرسال ولطخه الغربية عرضت نطاق الحجم ، المورفولوجية ، وعلامة البروتين التعبير متسقة مع عينه exosome نقاء عاليه. و PANC-1 exosomes ، أعدت مع نفس الاجراء كما عملنا السابق ، واستخدمت هنا للتحقق من صحة لدينا فحص nPES للقياس الكمي exosomes. استخدم هذا الفحص أضداد مضاده لEphA2 للتقاط عدد كبير من المجموعات الضخمة من السكان الأكثر إفرازا والأضداد ضد بروتين exosomes العام CD9 للكشف عن التماثيل الملتقطة. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام عينات من البروتينات المخففة المتسلسلة PANC-1 ، مع تركيزات بروتينيه تتراوح بين 0.24 إلى 1.2 ميكروغرام/μL ، استنساخ جيده في تكرار الآبار (الشكل 4A) وعلاقة خطيه قويه بين الاستجابة المبعثرة تركيز البروتين exosome (الشكل 4B).
لإثبات التطبيق المحتمل لهذه الطريقة ، تم تحليل عينات المصل من المرضي الذين يعانون من سرطان البنكرياس وبدونه للكشف عن وفره المصل الذي يعبر عن الEphA2 البيولوجية المرتبطة بالسرطان ، وذلك باستخدام أضداد مضاده لEphA2 التقاط مباشره التماثيل الهدف من المصل والجسيمات النانويه مترافق مع الأجسام المضادة لCD9 للكشف عن التماثيل المربوطة. وكشف هذا التحليل ان عينات المصل من مرضي سرطان البنكرياس لديها مستويات اعلي بكثير من EphA2 + exosomes (الشكل 5) من الضوابط الخاصة بهم.
الشكل 1: مخطط القياس الكمي لبرنامج Exosome. (ا) مخطط للشرائح المتعددة الآبار من البروتينات A/G (192 بئر) المستخدمة في هذا الفحص. (ب) يتم الاستيلاء مباشره علي التماثيل المستهدفة من العينات ، بما في ذلك المصل والبلازما ، عن طريق التجميد السطحي علي الأجسام المضادة للتقاط (علي سبيل المثال مكافحه الأضداد EphA2) المنضمة إلى الشريحة ، ثم حضن مع nanorods الذهب مترافق مع كشف الأجسام المضادة (علي سبيل المثال مكافحه الأضداد CD9) قبل تحليل الصورة في سوق دبي السينمائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: القياس الكمي Exosome عن طريق تطبيق خوارزميه DSM إلى صور LMDFM. يتم معالجه الصور ذات التكبير المنخفض مع خوارزميه DSM للقضاء علي اشاره الخلفية والتحف اشاره التي يمكن ان تنشا من الخدوش ، وخلط الفراغات ، والحطام ، والاضاءه عينه متفاوتة للسماح الكشف القوي للاشاره nanorod الذهب ، والتي يرتبط مع تركيز exosome. وقد تم تكييف هذا الرقم باذن من Sun, d. et al. طريقه الحد من الضوضاء لقياس تشتت الضوء جسيمات متناهي في التكبير منخفضه المجهر الحقل المظلم الصور الميدان البعيد. الكيمياء التحليلية. 88 (24) ، 12001-12005 (2016). حقوق التاليف والنشر (2016) الجمعية الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تخطيطي لأوامر خوارزميه DSM والمخرجات. الخطوات المشار اليها تستخدم الأوامر الاصليه من ImageJ ويتم تحديد جميع معلمات الإدخال وفقا لمتطلبات التجارب عبر واجهه المستخدم الرسوميه. وقد تم تكييف هذا الرقم باذن من Sun, d. et al. طريقه الحد من الضوضاء لقياس تشتت الضوء جسيمات متناهي في التكبير منخفضه المجهر الحقل المظلم الصور الميدان البعيد. الكيمياء التحليلية. 88 (24) ، 12001-12005 (2016). حقوق التاليف والنشر (2016) الجمعية الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تمثيلي nPES LMDFM الصور وبيانات الإخراج DSM. (ا) صوره lmdfm لفحص npes يحلل تدرج تركيز المكونات الاوليه من panc-1 و (ب) الارتباط الخطي للاشاره البصرية وتركيز exosomes من هذه الشريحة (من اليسار إلى اليمين: 0.24 ، 0.356 ، 0.53 ، 0.80 ، 1.20 ميكروغرام/μl علي التوالي لكل عمود). وتقدم البيانات كما يعني ± SE, n = 6, مع معامل الارتباط بيرسون R2 = 0.99 ومعامل الاختلاف لنسخ متماثلة من كل تركيز < 0.2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اشاره LMDFM منEphA2 + exosomes تماثيل يختلف في المصل من المرضي الذين يعانون من وبدون سرطان البنكرياس. عينات المصل تحليلها من قبل nPES باستخدام مضاد لEphA2 القبض علي الأضداد (المرتبطة بالسرطان) والمضادة لCD9 الأضداد الكشف (علامة exosome العامة) أظهرت فرقا كبيرا في تركيز EphA2 + exosome في عينات المصل من المرضي الذين يعانون من دون سرطان البنكرياس (N = 7/المجموعة). يتم عرض النتائج كمتوسط ± SE. * *p = 0.002 بواسطة مان-ويتني U-اختبار (علي الوجهين). وقد تم تعديل هذا الرقم من [Sun, d. et al. طريقه الحد من الضوضاء لقياس تشتت الضوء جسيمات متناهي في التكبير منخفضه المجهر الحقل المظلم الصور الميدان البعيد. الكيمياء التحليلية. 88 (24) ، 12001-12005 (2016)]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
التماثيل تنشا من اينفاجينيشنز المنظمة من الغشاء الباطني الخارجي الذي ينتج الهيئات متعددة الحويصلات ، مجموعه فرعيه متخصصة من التنظير الباطني التي تحتوي علي عدد كبير من الحويصلات داخل الجسم التي تخضع للاندماج مع غشاء البلازما للإفراج ناضجه التماثيل في الفضاء خارج الخلية. بسبب هذا المسار التكوين الحيوي ، يمكن ان تحمل التماثيل عوامل الغشاء المرتبطة الكسور الغشاء التي تتكون أو الصمامات مع غشاء التنظير الباطني ، فضلا عن أنواع مختلفه من مكونات عصاري خلوي متعددة ، التالي تحتوي علي شحنات من البروتينات والحمض النووي والأنواع الفرعية المختلفة RNA (mRNAs ، ميكرورناس ، طويلة غير الترميز RNAs) التي يمكن ان تعكس النمط الظاهري للخلية من أصل20. منذ يتم إفراز التماثيل من قبل معظم ان لم يكن جميع أنواع الخلايا ، ويمكن ان يحمل زيادة إفراز من الخلايا المريضة أو الخبيثة ، وتتراكم في معظم سوائل الجسم ، والتماثيل هي موضوع التحقيق الشامل والمنهجي باعتبارها الحد الأدنى الواعدة وسائل الغازية للكشف عن حالات امراض محدده ورصد استجاباتها للعلاج21.
العزلة exosome ، وهو مطلوب لمعظم التحليلات exosome الحالية ، هو اجراء طويلة وكثيفه العمالة ، وتقييد الترجمة السريرية من المؤشرات الحيوية المرتبطة exosome مع الاهميه الطبية المحتملة. الخصائص الفيزيائية أو قد تضر النزاهة exosome15. النهج الجديدة قيد التطوير التي قد تسمح بتحليلات exosome أسرع ، ولكن ليس من الواضح كيف يمكن ان يكون من الممكن تنفيذ العديد من هذه المنصات في الإعدادات السريرية المستحقة.
في هذا التقرير ، نقدم نهجا جديدا يسمح بالقياس الكمي لجسيمات متناهي عالي الانتاجيه باستخدام التكبير المنخفض للصور المجهر الميداني الداكن. هذا الأسلوب لا يتطلب تنقيه exosome ، معدات مخصصه مكلفه ، أو الخبرة الفنية الجديدة ، وينبغي بالتالي ان تكون قابله للترجمة السريعة في معظم البحوث والإعدادات السريرية. ويمكن تطبيق الفحص لدينا علي وجه التحديد كميه تركيز السكان exosome المستهدفة التي تحمل الحيوية محدده عندما يتم مقارنه نتائج الفحص إلى منحني قياسي ، لان لدينا نتائج معرض هناك ارتباط خطي قوي (R2 = 0.99) بين الاستجابة البصرية وتركيز exosome. ولإظهار الإمكانات الحقيقية لهذا النهج ، قدمنا بيانات استخدمنا فيها هذه الطريقة لقياس تركيز المؤشرات البيولوجية المصاحبة لسرطان البنكرياس في عينات المصل التي تم الحصول عليها من المرضي الذين يعانون من وبدون سرطان البنكرياس.
في LMDFM ، يتم تحديد العينة بأكملها بشكل جيد لتجنب تحيز الاختيار الموجود في تحليلات بورصة دبي عاليه التكبير ، حيث يجب علي المستخدمين اختيار الحقول العينة مباشره للتقاط لتحليل الصورة اللاحقة ، ولكن يخضع لتشتت الضوء التحف من سطح مخالفات ، بما في ذلك الخدوش والحطام عينه. ويمكن تقليل هذه الخلفية للكشف عن الهدف المستمدة exosome الاشاره باستخدام لدينا DSM خفض الضوضاء خوارزميه التي تعمل علي برنامج تحليل الصور المعاهد القومية للصحة, ImageJ, ولكن يجب الحرص لا يزال يتعين اتخاذها لتجنب إدخال مثل هذه التحف التي قد تقلل من المدى الديناميكي الفحص.
المواد المستخدمة في هذا الفحص:
وقد تم شراء الشرائح المتعددة البروتينات A/G التي تحمل 1 μL/well من شركه Arrayit (AGMSM192BC). تم الحصول علي جسيمات نانويه من نانوبارتز (C12-25 -650-TN-DIH-50-1 ، 6.4 x 1012/مل). تم التقاط صور سوق دبي السينمائي مع كاميرا نيكون DiR2 الرقمية الملحقة بمجهر تي-اكليبس من نيكون ، مع أضاءه متناسقة ووقت التعرض ل1/220 s. تم شراء خط الخلية PANC-1 المستخدم في هذه الدراسة من مجموعه الثقافة الامريكيه النوع.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم العمل في المقام الأول من خلال تمويل البحوث التي تقدمها المعاهد القومية للصحة (U01CA214254 ، R01HD090927 ، R01AI122932 ، R01AI113725 و R21Al126361) ، وجائزه المحقق الشاب في ولاية اريزونا (ABRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
