रोगग्रस्त और घातक कोशिकाओं के लिए exosome-व्युत्पंन biomarkers के नैदानिक अनुवाद तेजी से और सटीक परिमाणन तरीकों की कमी से रुकावट है । यह रिपोर्ट कम-आवर्धन वाले डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप छवियों के उपयोग का वर्णन करती है, जिससे कि छोटे वॉल्यूम सीरम या प्लाज्मा नमूनों में विशिष्ट exosome के उपप्रकारों की मात्रा निर्धारित की जा सके ।
संक्रमित या घातक कोशिकाओं अक्सर अधिक exosomes स्राब, परिसंचरण में रोग से जुड़े exosomes के स्तर को ऊंचा करने के लिए अग्रणी । इन exosomes रोग निदान के लिए biomarkers के रूप में सेवा करने के लिए और रोग प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता है. हालांकि, सबसे exosome विश्लेषण प्रक्रियाओं exosome अलगाव और शुद्धि कदम है, जो आम तौर पर समय लेने वाली और श्रम गहन, और इस तरह नैदानिक सेटिंग्स में सीमित उपयोगिता की आवश्यकता होती है । इस रिपोर्ट का वर्णन एक त्वरित प्रक्रिया अलग अलगाव और शुद्धि कदम की आवश्यकता के बिना exosomes की बाहरी झिल्ली पर विशिष्ट biomarkers का विश्लेषण करने के लिए । इस विधि में एक्सोकुछ-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा एक स्लाइड की सतह पर exosomes पर कब्जा कर लिया है और फिर नैनोकणों के साथ संकरीकृत-एक रोग के लिए विशिष्ट conjugated एंटीबॉडी जांच । संकरण के बाद, लक्ष्य exosome आबादी की बहुतायत के लिए बाध्य नैनोकणों के कम आवर्धन डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप (LMDFM) छवियों का विश्लेषण करके निर्धारित किया जाता है । इस दृष्टिकोण को आसानी से अनुसंधान और नैदानिक उपयोग के लिए अपनाया जा सकता है झिल्ली से जुड़े exosome biomarkers रोग से जुड़े विश्लेषण ।
Exosomes सबसे अधिक प्रकार के सेल से जारी कर रहे है और सेल करने के लिए सेल संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विभिंन रोगों के साथ जुड़े pathophysiological प्रक्रियाओं सहित, क्योंकि वे विशिष्ट ऊतकों या कोशिका प्रकार के लिए घर हो सकता है, और न्यूक्लिक एसिड की एक किस्म शामिल , प्रोटीन, और लिपिड है कि मूल के अपने सेल को प्रतिबिंबित और उनके प्राप्तकर्ता कोशिकाओं1,2,3,4पर नियामक प्रभाव डालती कर सकते हैं । Exosomes अक्सर रोग राज्यों में ऊंचा स्तर पर स्रावित कर रहे हैं, दोनों आसंन और दूर की कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं, और परिसंचरण में अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता में पाए जाते है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सबसे अंय शरीर तरल पदार्थ, लार सहित, मूत्र, अग्नाशय और पित्त रस, और bronchoalveolar लेवेज द्रव5,6,7,8,9,10,11। यह बहुतायत और मानव शरीर के तरल पदार्थ में exosomes की स्थिरता, उनकी जानकारी संपंन प्रकृति के साथ युग्मित, उंहें रोग निदान और उपचार की निगरानी के लिए आदर्श biomarkers बनाता है ।
यह ट्यूमर से व्युत्पंन exosomes (TDEs) शामिल हैं, जो ट्यूमर विशिष्ट या चयनात्मक कारक है, जो रोग biomarkers, ट्यूमर से जुड़े उत्परिवर्ती alleles सहित के रूप में सेवा कर सकते हैं । TDEs ट्यूमर microenvironment के remodeling में भाग लेने के लिए ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की सुविधा कर सकते हैं, और विरोधी को विनियमित-ट्यूमर प्रतिक्रियाओं12। वृद्धि tde स्राव सबसे कैंसर का एक आम फेनोटाइप है और ट्यूमर microenvironment के कई सुविधाओं, hypoxia, अम्लीय पीएच सहित, और सूजन, exosome स्राव को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है. आश्चर्य की बात है, कोशिकाओं है कि exosomes, कुल exosome स्तर में वृद्धि, ही, एक कैंसर biomarker के रूप में कार्य कर सकते है छिपाना की संख्या को देखते हुए । उदाहरण के लिए, एक ताजा अध्ययन में पाया गया कि पित्त रस में कुल EV एकाग्रता १००% सटीकता7के साथ आम पित्त नली स्टेनोसिस रोगियों में घातक और अघातक भेदभाव करता है । इसी तरह के परिणाम प्लाज्मा सहित अन्य शरीर के तरल पदार्थ का उपयोग कर अध्ययन के साथ पाया गया है । हालांकि, विषय भिन्नता के अधीन करने की क्षमता के कारण, और अन्य confounding कारकों, रोग biomarkers के रूप में exosomes की जांच सबसे अध्ययन biomarkers का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है कि चुनिंदा TDEs के बजाय कुल exosome के साथ जुड़े रहे हैं संख्या.
नैदानिक अभ्यास में exosome biomarkers अनुवाद, तथापि, सबसे रिपोर्ट exosome परख दृष्टिकोण समय लेने वाली और श्रम गहन अलगाव प्रक्रियाओं 13की आवश्यकता के बाद से चुनौतीपूर्ण रहता है । वर्तमान में लोकप्रिय exosome अलगाव तरीकों ultracentrifugation, घनत्व gradients, आकार-अपवर्जन, सह वर्षण, आत्मीयता कब्जा, और microfluidic अलगाव दृष्टिकोण शामिल हैं । Ultracentrifugation “स्वर्ण मानक” विधि है, और सबसे अधिक exosome isolations के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन इस प्रक्रिया में समय लेने वाली है और exosome के नुकसान और exosome झिल्ली क्लस्टरिंग में परिणाम है, और exosome के नमूनों कि दूषित कर रहे हैं का उत्पादन प्रोटीन, लाइपोप्रोटीन और अन्य कारक जो बाद के विश्लेषणों को प्रभावित कर सकते हैं14. अधिकांश exosome अलगाव तरीकों, ultracentrifugation सहित, सूक्ष्म vesicles (100-1000 एनएम) और अपोप्तोटिक निकायों (100-5000 एनएम) से exosomes (30-150 एनएम) अलग नहीं कर सकते हैं, जो विभिंन तंत्र के माध्यम से उठता है और विभिंन कार्यों, आकार के कारण इन समूहों के बीच ओवरलैप, और exosome की आबादी की विविधता15. नए तरीकों को संवेदनशीलता और exosome की प्रतिलिपि बनाने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए की जरूरत है एक्साकुछ की वसूली में सुधार के द्वारा assays हैं, जबकि exosome क्षति और संदूषण को कम करने, हालांकि किसी भी assays हैं इस तरह के तरीकों के आधार पर भी उन्हें रेंडर करने के लिए अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता होगी नैदानिक सेटिंग्स में आवेदन करने के लिए अनुवाद के लिए उपयुक्त है ।
हाल के कई अध्ययनों से शरीर के तरल पदार्थ से सीधे exosomes पर कब्जा करने और विश्लेषण करने के लिए एकीकृत प्लेटफार्मों को रोजगार का प्रस्ताव किया है । इन पद्धतियों microfluidic, electrokinetic, आत्मीयता पर कब्जा, और exosome अलगाव के लिए विभिन्न अन्य तरीकों, और इलेक्ट्रोकेमिस्ट्री, सतह plasmon गूंज, और अन्य तरीकों पर कब्जा कर लिया exosomes का पता लगाने के लिए रोजगार. यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे व्यवहार्य इन तरीकों के कई नैदानिक सेटिंग्स में हो जाएगा, उनकी जटिलता, व्यय, कम throughput या अंय मुद्दों के कारण ।
हम एक तेजी से और कम खर्चीली परख है कि कुल exosomes और विशिष्ट exosome के के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है, जैसे रोग से जुड़े exosomes, ऐसे TDEs, जो केवल नमूना की एक छोटी राशि की आवश्यकता है और जो एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह नैदानिक वातावरण के लिए उपयुक्त कार्यरत हैं । इस परख में, एक स्लाइड एंटीबॉडी के साथ लेपित है कि बांध या तो एक exosome-विशिष्ट या रोग विशिष्ट exosome सतह पर व्यक्त मार्कर के क्रम में सीधे लक्ष्य exosomes पर कब्जा करने के लिए छोटे मात्रा प्लाज्मा या सीरम नमूनों पर कुओं को लागू फिसलना. कब्जा कर लिया exosomes तो एक एंटीबॉडी के साथ संकरचित-conjugated नैनोकणों कि इन exosomes पर ब्याज की biomarker पहचानता है, जो या तो एक सामांय exosome मार्कर या ब्याज की एक exosome उपप्रकार के लिए एक विशेष कारक हो सकता है । इन नमूना कुओं की छवियां तो एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोप (dfm) का उपयोग कर कब्जा कर लिया है और प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से6,16,17में कब्जा कर लिया ब्याज की exosomes करने के लिए बाध्य नैनोकणों से बिखरे हुए प्रकाश को मापने के लिए विश्लेषण किया । विशेष रूप से, इमेजिंग एक पूरे नमूना अच्छी तरह से कम वृद्धि DFM द्वारा (LMDFM) एक चयन उच्च इज़ाफ़ा DFM विश्लेषण के साथ सामना करना पड़ा पूर्वाग्रह से बचा जाता है जब उपयोगकर्ताओं को सीधे जो क्षेत्रों के बाद छवि विश्लेषण के लिए कब्जा करने के लिए चुनना होगा । LMDFM छवि विश्लेषण खरोंच और नमूना मलबे सहित सतह अनियमितताओं से प्रकाश बिखरने कलाकृतियों के अधीन है, लेकिन इस पृष्ठभूमि में हम NIH छवि विश्लेषण कार्यक्रम पर चलाने के लिए विकसित एक सरल शोर-कमी एल्गोरिथ्म का उपयोग कर कम किया जा सकता है, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) । यह एल्गोरिथ्म पहले एक इनपुट समोच्च थ्रेशोल्ड लागू करता है जो बाद के विश्लेषण के लिए छवि के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए अच्छी तरह से नमूना की सीमाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । इस क्षेत्र को समोच्च क्षेत्र द्वारा परिभाषित किया जाता है तो छवि के लाल, नीले और हरे रंग के चैनल में मौजूद अलग संकेत करने के लिए विभाजित है और ब्लू चैनल के लिए लाल चैनल से घटाया है सतह कलाकृतियों और nanorod से असमान प्रकाश से उत्पन्न होने वाले संकेत को दूर करने के लिए संकेत.
यह आलेख वर्णन करता है कि कैसे इस परख का उपयोग करने के लिए तेजी से या तो कुल या विशिष्ट exosome प्लाज्मा या सीरम नमूनों में स्तर की मात्रा बढ़ाता है ।
Exosomes बाहरी endosomes का एक विशेष सबसेट है कि बहुत्वीय निकायों का उत्पादन, के विनियमित invaginations से पैदा होता है कि इंट्राएल्युनियल पुटिकाओं की एक बड़ी संख्या है कि प्लाज्मा झिल्ली के साथ संलयन गुजरना परिपक्व जारी extracellular अंतरिक्ष में exosomes । इस बायोजेनेसिस मार्ग के कारण, exosomes झिल्ली के साथ जुड़े कारकों को ले जा सकता है कि शामिल या endosome झिल्ली के साथ फ्यूज, और साथ ही cytosolic घटकों के कई विभिंन प्रकार, और इस तरह प्रोटीन, डीएनए के कारगुजारियों शामिल और विभिन्न आरएनए उपप्रकार (एमआरएनएएस, माइक्रोनास, लंबे गैर कोडिंग rnas) कि20मूल के अपने सेल के फेनोटाइप को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । चूंकि exosomes सबसे अगर नहीं सभी प्रकार के सेल द्वारा स्रावित कर रहे हैं, रोगग्रस्त या घातक कोशिकाओं से वृद्धि हुई स्राव प्रदर्शन कर सकते हैं, और ज्यादातर शरीर के तरल पदार्थ में संचित, exosomes एक होनहार ंयूनतम के रूप में व्यापक और व्यवस्थित जांच का विषय है आक्रामक करने के लिए विशिष्ट रोग की स्थिति का पता लगाने और21उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं की निगरानी का मतलब है ।
Exosome अलगाव है, जो सबसे वर्तमान exosome विश्लेषण के लिए आवश्यक है, एक लंबा और श्रम गहन प्रक्रिया है, exosome के नैदानिक अनुवाद सीमित संभावित चिकित्सा प्रासंगिकता के साथ biomarkers जुड़े । कई आम अलगाव की विधियां (ultracentrifugation, आकार-अपवर्जन, वर्षण, आदि) अक्सर exosomes (30-100 एनएम) माइक्रो-vesicles (100-1000 एनएम) और अपोप्तोटिक निकायों (100-5000 एनएम) से अपने आकार पर्वतमाला में overlaps के कारण या पर्याप्त अंतर नहीं है भौतिक गुण या exosome अखंडता15नुकसान हो सकता है । नए तरीकों के विकास के तहत कर रहे है कि और अधिक तेजी से exosome विश्लेषण की अनुमति हो सकती है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि यह कैसे संभव नैदानिक कारण सेटिंग्स में इन प्लेटफार्मों के कई को लागू करने के लिए हो सकता है ।
इस रिपोर्ट में, हम एक उपंयास दृष्टिकोण है कि नैनोकणों की अनुमति देता है वर्तमान उच्च throughput exosome कम इज़ाफ़ा डार्क फील्ड माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग प्रमात्रीकरण प्रस्तुत करते हैं । इस विधि exosome शुद्धि, महंगा समर्पित उपकरण, या उपंयास तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है और इस प्रकार सबसे अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स में तेजी से अनुवाद करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. हमारे परख ठीक एक लक्ष्य exosome एक विशिष्ट biomarker असर जनसंख्या की एकाग्रता की मात्रा को लागू किया जा सकता है जब परख परिणाम एक मानक वक्र की तुलना में कर रहे हैं, के बाद से हमारे परिणाम प्रदर्शन वहां एक मजबूत रैखिक सहसंबंध है (R2 = ०.९९) ऑप्टिकल प्रतिक्रिया और exosome एकाग्रता के बीच । इस दृष्टिकोण की वास्तविक दुनिया की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, हम डेटा उपलब्ध कराई है, जहां हम इस विधि के साथ और बिना रोगियों से प्राप्त सीरम नमूनों में अग्नाशय के कैंसर के साथ जुड़े एक exosome biomarker की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए अग्नाशय के कैंसर ।
LMDFM में, पूरा नमूना अच्छी तरह से चयन उच्च-आवर्धन DFM विश्लेषण, जहां उपयोगकर्ताओं को सीधे नमूना फ़ील्ड चुनने के लिए बाद में छवि विश्लेषण के लिए कब्जा करना चाहिए में पाया पूर्वाग्रह से बचने के लिए imaged है, लेकिन सतह से प्रकाश बिखरने कलाकृतियों के अधीन है खरोंच और नमूना मलबे सहित अनियमितताओं, । इस पृष्ठभूमि के लिए लक्ष्य exosome का पता लगाने के लिए कम किया जा सकता है-व्युत्पन्न हमारे DSM शोर कमी एल्गोरिथ्म का उपयोग संकेत है कि NIH छवि विश्लेषण कार्यक्रम, ImageJ पर चलाता है, लेकिन देखभाल अभी भी ऐसी कलाकृतियों जो की गतिशील रेंज को कम कर सकते हैं शुरू करने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए परख ।
इस परख में प्रयुक्त सामग्री:
1 μL/well होल्डिंग मल्टी-वेल सुपरप्रोटीन ए/जी स्लाइड् स को आर्रॉयटी कारपोरेशन (AGMSM192BC) से खरीदा गया था । Nanopartz (C12 -650-TN-डीह-50-1, ६.४ x 1012/एमएल) से नैनोकणों प्राप्त किया गया । DFM छवियां एक Nikon DiR2 डिजिटल एक Nikon तिवारी के साथ संलग्न कैमरे के साथ कब्जा कर लिया गया-सूक्ष्मदर्शी ग्रहण, लगातार प्रकाश व्यवस्था और एक 1/220 एस जोखिम समय के साथ । इस स्टडी में इस्तेमाल होने वाली पैनसी-1 सेल लाइन को अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन से खरीदा गया था ।
The authors have nothing to disclose.
काम मुख्य रूप से एनआईएच (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 और R21Al126361-01), एरिज़ोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (ABRC) युवा अन्वेषक पुरस्कार द्वारा प्रदान की अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |