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Biology

Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

Ici, deux essais de débit moyen pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain sont décrites. Ces tests peuvent servir à l’écran rapidement et facilement de grandes quantités de composés aux effets sur la Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain.

Abstract

Ca2 +-signalisation est essentielle à la fonction normale des cellules de sperme et la fertilité masculine. De même, la réaction de l’acrosome est vitale pour la capacité d’une cellule de sperme humaine à pénétrer dans la zone pellucide et féconder l’ovule. Il est donc très intéressant pour tester des composés (par exemple, les produits chimiques environnementaux ou candidats-médicaments) pour leur effet sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain soit à examiner les effets négatifs potentiels sur la fonction des cellules de sperme humain ou d’enquêter sur un possible rôle comme contraceptif. Ici, deux essais de débit moyen sont décrits : 1) un essai pour l’évaluation des effets sur Ca2 +fluorescence-signalisation dans le sperme humain et 2) un dosage de cytométrie en image pour évaluation de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. Ces tests peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés aux effets sur la Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain. En outre, les dosages peuvent être utilisés pour générer des courbes dose-réponse très spécifique des composés individuels, déterminer l’additivité/synergie potentielle pour plusieurs composés et d’étudier le mode pharmacologique d’action par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive expériences avec des inhibiteurs de la revendication.

Introduction

Les deux essais décrits ici vise à étudier les effets sur Ca2 +-réaction de signalisation et de l’acrosome dans le sperme humain, comme l’a montré pour plusieurs composés dans plusieurs publications qui emploient ces dosages1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalisation et la réaction de l’acrosome sont fonction des cellules de sperme humain vital à la normale et la fertilité masculine.

L’objectif général d’une cellule de sperme humaine consiste à féconder l’ovule. Pour pouvoir correctement et naturellement féconder l’ovule, les fonctions de la cellule de sperme doivent être réglementées étroitement pendant le trajet des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur féminin8,9. Les fonctions de la cellule de sperme sont réglementées via l’intracellulaire Ca2 +-concentration [Ca2 +]j’ai (par exemple, selon la réaction acrosome, chimiotactisme et la motilité de sperme)10. En outre, un processus de maturation, appelé la capacitation, qui rend les spermatozoïdes capables de féconder l’ovule, est partiellement réglementé par [Ca2 +]j’ai10. Ca2 +-extrusion Ca2 +-ATPase pompes11 maintenir un pli environ 20.000 Ca2 +-dégradé sur la membrane de la cellule de sperme humain, avec un repos [Ca2 +]j’ai de 50 à 100 nM. Si Ca2 + est autorisé à traverser la membrane cellulaire (par exemple, par le biais de l’ouverture du Ca2 +-canaux), un afflux considérable de Ca2 + se produit, donnant lieu à une altitude de [Ca2 +]i. Toutefois, le spermatozoïde porte également intracellulaire Ca2 +-magasins, qui peuvent libérer Ca2 + et, par conséquent, également donner lieu d’altitude [Ca2 +]i12. Fait intéressant, tous médiée par les canaux Ca2 +-afflux dans les spermatozoïdes humains constate jusqu'à présent à se produire par l’intermédiaire de CatSper (chatde canal ionique de Sperm), qui n’est exprimée dans les cellules spermatiques11. Dans les spermatozoïdes humains, CatSper est activé par la progestérone ligands endogènes et les prostaglandines par distincte ligand binding sites13,14,15, conduisant à une rapide Ca2 +-afflux dans la cellule de sperme. Deux principales sources près de le œuf fournissent des niveaux élevés de ces ligands endogènes. L’un est le liquide folliculaire contenant des niveaux élevés de progestérone16. Le liquide folliculaire est libéré des follicules à maturité ainsi que de le œuf à l’ovulation et les mélanges avec le fluide dans les oviductes17. L’autre source principale est les cellules du cumulus qui entourent le œuf et émettent des niveaux élevés de progestérone et les prostaglandines. La progestérone induite par Ca2 +-afflux dans les cellules de sperme s’est avéré de médiation chimiotactisme vers l’oeuf9,18, contrôler la motilité de sperme19,20 et stimuler l’acrosome 21de réaction. Déclenchement de ces individuels [Ca2 +]i-fonctions de sperme réglementé dans le bon ordre et au bon moment est crucial pour la fécondation de l' oeuf8. Dans ce cadre, un sous-optimale induite par la progestérone Ca2 +-afflux a été trouvé pour être associé à réduit la fertilité mâle22,23,24,25,26 ,27,28,29 et fonctionnelle CatSper est essentiel pour la fertilité masculine26,30,31,32, 33,34,35,36.

Comme les spermatozoïdes atteignent l’ovule, une séquence d’événements doit avoir lieu pour la fécondation se produise : 1) les spermatozoïdes doivent pénétrer la couche de cellules de cumulus environnantes, 2) lier à la zone pellucide, 3) exocytose le contenu acrosome, la réaction de ce que l'on appelle acrosome 37, 4) pénétrer dans la zone pellucide et 5) fusionnent avec la membrane de l’oeuf pour compléter la fertilisation38. Pour pouvoir passer par ces étapes et féconder l’ovule, le spermatozoïde doit tout d’abord subir capacitation11, qui commence comme les spermatozoïdes laisser le liquide séminal contenant « decapacitating » facteurs39 et nager dans les fluides de la femelle appareil reproducteur avec des niveaux élevés de bicarbonate et albumine37. Capacitation rend les spermatozoïdes capables de subir une hyperactivation, une forme de mobilité avec une raclée vigoureuse du flagelle et acrosome réaction37. Hyperactivé motilité est requise pour la pénétration de la zone pellucide40et l’acrosome contient diverses enzymes hydrolytiques qui facilitent ce processus de pénétration41. En outre, la réaction de l’acrosome restitue les spermatozoïdes capables de fusionner avec l’oeuf en exposant des protéines membranaires spécifiques sur la surface de sperme nécessaire pour la fusion de spermatozoïde-ovule42. Par conséquent, la possibilité de subir une réaction hyperactivation et acrosome sont tous deux requis pour la fécondation réussie de l’oeuf40,42. Contrairement à ce qui a été vu pour la souris spermatozoïdes43,44,45, spermatozoïdes seulement humains qui sont acrosome intacte peut lier à la zone pellucide46. Lorsque les spermatozoïdes humains sont liés à la zone pellucide, ils devront subir la réaction de l’acrosome fois à pénétrer dans la zone pellucide41 et d’exposer des protéines membranaires spécifiques qui sont nécessaires pour la fusion avec l' oeuf38. Le moment de la réaction de l’acrosome dans le sperme humain est donc critique pour la fécondation se produise.

Comme décrit plus haut, Ca2 +-signalisation est vitale pour la fonction8de cellules de sperme normal, et c’est donc un grand intérêt pour être en mesure à l’écran un grand nombre de composés aux effets sur la Ca2 +-la signalisation dans les spermatozoïdes humains. De même, comme des spermatozoïdes seulement humains qui subissent une réaction de l’acrosome au bon moment et au lieu peut pénétrer la zone pellucide et féconder l’ovule46,47, il est également très intéressant pour pouvoir tester les composés pour leur capacité à influent sur la réaction de l’acrosome dans le sperme humain. À cette fin, deux essais de criblage à moyen débit sont décrits : 1) une analyse des effets sur Ca2 +-signalisation dans les spermatozoïdes humains et 2) un test de la capacité d’induire de réaction de l’acrosome dans les spermatozoïdes humains.

Essai 1 est un moyen débit Ca2 +-dosage de signalisation. Cette technique d’axée sur le lecteur sur la plaque de la fluorescence surveille les changements de fluorescence en fonction du temps simultanément dans plusieurs puits. Le Ca2 +-colorant fluorescent sensible, Fluo-4 a un Kd pour Ca2 +≈ 335 nM et est perméable à la cellule sous la forme d’ester de AM (acétoxyméthyl). À l’aide de Fluo-4, il est possible de mesurer les changements [Ca2 +]i au fil du temps et après l’ajout de composés d’intérêt pour les spermatozoïdes. Le test a été développé par le laboratoire de Timo Strünker 201113 et a depuis été utilisé dans plusieurs études aux composés de l’écran pour les effets sur Ca2 +-signalisation dans le sperme humain1,2,3, 4,5. Aussi, une méthode similaire a servi à plusieurs médicaments candidats48de l’écran. En outre, ce test est également utile pour évaluer le mode pharmacologique de l’action1,2,3,4,5, relation dose-effet courbes1, 2,3,4,5, inhibition compétitive1,2, additivité1,2et synergie3 de composés d’intérêt.

Dosage 2 est un test de réaction moyen débit acrosome. Cette technique de base cytomètre image mesure la quantité de viable acrosome réagi spermatozoïdes dans un échantillon à l’aide de trois colorants fluorescents : iodure de propidium (PI), couplé à la FITC lectine de Pisum sativum (FITC-PSA) et Hoechst 33342. Le test a été modifié d’une méthode similaire d’axée sur la cytométrie de flux par Zoppino et al.,49 et a été utilisé dans plusieurs études6,7. En ce qui concerne le Ca2 +-signalisation dosage, ce test de réaction acrosome pourrait également servir à évaluer les courbes dose-réponse, inhibition, additivité et la synergie des composés d’intérêt.

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Protocol

La collecte et l’analyse des échantillons de sperme humain dans les protocoles suit les directives de la Research Ethics Committee de la région de la capitale du Danemark. Tous les échantillons de sperme ont été obtenus après consentement éclairé des donneurs volontaires. Après l’accouchement, les échantillons ont été totalement anonymisées. Pour leurs inconvénients chaque donateur reçoit une taxe de 500 couronnes danoises (environ $75 dollars US) par exemple. Les échantillons ont été analysés le jour de la livraison, puis détruits immédiatement après les expériences de laboratoire.

Remarque : Le débit moyen Ca2 +-test est décrite dans les étapes 4-5 et le test de réaction acrosome débit moyen dans les étapes 6 et 7 de la signalisation. Le protocole de préparer le milieu liquide tubaire humain (FASS+) est décrit à l’étape 1 et la purification des spermatozoïdes pour les tests est décrit dans les étapes 2 et 3.

1. préparation du milieu liquide tubaire humain (FASS+)

Remarque : Utilisation des fioles jaugées de dimensions appropriées, un 1 L mesure du cylindre, un agitateur magnétique, sels comme indiqué au tableau 1 et tableau 2, eau purifiée, un 0,2 µm pore de filtre et de tubes en plastique de 50 mL.

  1. Préparer les solutions de sels dans l’eau purifiée (tableau 1).
    1. Ajouter la quantité de sel énuméré au tableau 1 dans une fiole jaugée de taille appropriée, ajouter d’eau purifiée à un peu sous le volume désiré et mélanger bien à l’aide d’un agitateur magnétique.
    2. Lorsque le sel est entièrement dissous, enlever l’aimant et le remplir d’eau purifiée au volume final désiré.
  2. Transférer la solution mère dans une bouteille et stockez jusqu'à utilisation.
    Remarque : Solutions mères peuvent être conservées et réutilisées pour des périodes plus longues : glucose et HEPES à-20 ° C et les autres solutions mères à température ambiante (RT).
  3. Préparer 1 L de milieu HTF+ de solutions mères (tableau 2).
    1. S’assurer que toutes les solutions mères sont complètement dissous et bien mélangées avant utilisation.
    2. Ajouter la quantité de solution mère et figurant au tableau 2 pour un 1 L éprouvette cylindrique de sel et ajouter de l’eau purifiée à 900 mL.
    3. Mélangez bien à l’aide d’un agitateur magnétique et ajuster le pH à 7,35 avec une solution de NaOH.
    4. Retirer l’aimant et ajouter de l’eau purifiée à 1 000 mL.
  4. Milieu HTF+ filtrat stérile grâce à 0,2 µm pore filtre, aliquot milieu HTF+ pour tubes en plastique de 50 mL et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  5. Juste avant d’exécuter une expérience, ajouter 165 µL de Na-pyruvate dans l’aliquote de 50 mL pour obtenir une concentration finale de Na-pyruvate de 0,33 mM.
    Remarque : Milieu liquide tubaire humaine peut également provenir de divers fournisseurs commerciaux. Lorsque vous utilisez le support de3– 4 mM HCO, échantillons peuvent être incubés avec couvercle fermé dans un incubateur sans appoint CO2 dans l’air sans grandes dérives pH. Si un incubateur à CO2 est disponible, le montant correspondant du CO2 peut être calculé à l’aide de l’équation de Henderson-Hasselbalch et utilisé. Si vous utilisez le 25 mM HCO3– moyen, les échantillons doivent être incubés avec couvercles ouverts dans un incubateur à CO2 avec de l’air contenant une quantité correspondante de CO2 (dépend de la pression atmosphérique, généralement entre 5 à 10 %) pour éviter une dérive du pH. Le montant exact du CO2 peut être calculé à l’aide de l’équation de Henderson-Hasselbalch.

2. la purification des spermatozoïdes motiles via Swim-up (Figure 1)

Remarque : Utiliser un récipient en plastique propre large goulot pour l’échantillon de sperme, un incubateur, tubes en plastique de 50 mL, un rack pour le placement des tubes en plastique de 50 mL à un angle de 45°, le milieu HTF+ (préparée dans étape 1 ou obtenu de fournisseur commercial), une centrifugeuse et sérum humain albumine (HSA).

  1. Obtenir un échantillon de sperme humain fraîchement donnés produites par la masturbation et éjaculé dans un récipient en plastique à large goulot. N’utilisez que des échantillons de sperme qui remplissent les limites fixées par le manuel de laboratoire OMS pour examen et traitement du sperme humain.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15-30 min pour lui permettre de se liquéfier.
  3. Faire chauffer 50 mL de milieu HTF+ avec 4 mM HCO3– à 37 ° C.
  4. Lieu propre de 50 mL de tubes en plastique dans un rack à un angle de 45° (pour augmenter la surface entre les liquides). Utiliser 1 tube par mL de sperme brute.
  5. Ajouter 4 mL de milieu HTF+ préchauffé à chacun des tubes.
  6. Soigneusement pipette 1 mL de l’échantillon de sperme liquéfié au fond de chaque tube contenant 4 mL de HTF préchauffé+. Éviter le rejet de bulles d’air.
  7. Fermez les couvercles et incuber les tubes à 37 ° C pendant 1 h.
  8. Doucement, aspirer et transférer autant de la fraction supérieure (FASS+ avec spermatozoïdes motiles) que possible dans un nouveau tube en plastique de 15 mL, en faisant attention que rien de la fraction de fond (sperme cellules immobiles et morts) est inclus. En règle générale, il est sûr de transférer de 3,5 mL de la fraction supérieure, sans déranger la fraction inférieure. Pour éviter la turbulence de l’aspiration, coupez le plus externe 1 à 2 mm de l’embout de la pipette à un angle de 45° pour obtenir une plus grande ouverture.
  9. Remplir le tube en plastique de 15 mL avec FASS+ pour laver les cellules et centrifuger le tube à 700 x g pendant 10 min à température ambiante.
  10. Doucement, aspirer et éliminer le surnageant et resuspendre le culot de spermatozoïde dans 2 mL de FASS+.
  11. Transférer 20 µL de la suspension de sperme pour deux petits tubes en plastique pour l’évaluation de la concentration des spermatozoïdes (voir étape 3).
  12. Remplir le tube en plastique de 15 mL avec FASS+ pour laver les cellules et centrifuger le tube à 700 x g pendant 10 min à température ambiante.
  13. Doucement, aspirer et éliminer le surnageant et resuspendre le culot de spermatozoïde à 10 x 106 cellules/mL (basé sur la concentration en cellules évaluée à l’étape 2.11).
    1. Pour les expériences utilisant des cellules de sperme non capacitated (routine Ca2 +-dosage de signalisation)
      1. Remettre en suspension les cellules en FASS+ avec 4 mM HCO3–.
      2. Ajouter 30 µL d’albumine sérique humaine (Ash) (100 mg/mL) par mL FASS+ pour obtenir une concentration finale de 3 mg/mL.
      3. Fermer les couvercles et laisser incuber à moins de 1 h à 37 ° C.
    2. Pour les expériences utilisant capacitated spermatozoïdes (test de réaction acrosome)
      1. Remettre en suspension les cellules en FASS+ avec 25 mM HCO3–.
      2. Ajouter 30 µL de HSA (100 mg/mL) par mL FASS+ pour obtenir une concentration finale de 3 mg/mL.
      3. Serrer les couvercles et laisser incuber ≥3 heures à 37 ° C avec le montant correspondant de CO2 (voir l’étape 1, habituellement entre 5-10 % CO2).

3. comptage des spermatozoïdes

Remarque : Spermatozoïdes peut soit être comptés manuellement50 ou en utilisant une image cytomètre51, comme décrit ici. Utiliser un cytomètre en image, un vortexer, S100 tampon, une cassette SP1, swim-up purifié des spermatozoïdes (préparés à l’étape 2).

  1. Diluer une aliquote à un facteur de 10, 20, 30, 50 ou 90 dans S100 tampon à l’aide d’un tube fond rond de 2 mL selon la concentration attendue (évalué par l’inspection manuelle de la pastille à l’étape 2.10) de 20 µL. Utilisation la dilution qui est plus proche de la concentration attendue (par exemple, si une concentration de 15 x 106 spermatozoïdes / mL après que remontée devrait ensuite diluer l’échantillon de sperme 20 µL avec 380 µL de tampon S100 [facteur de dilution 20]).
  2. Mélange bien pour 10 s à l’aide d’un agitateur vortex à la maximale 700 tr/min, plonger la SP1-cassette dans l’échantillon et appuyez sur le poussoir blanc entièrement vers le bas pour aspirer une partie aliquote de l’échantillon dans la cassette.
  3. Ouvrez le cytomètre de l’image, placez la cassette dans le bac et exécutez le test Comte de PI teint humain cellules spermatiques analyse selon le facteur de dilution appliquée (choisie à l’étape 3.1).
  4. Répétez l’étape 3.1 à 3.3 avec un autre échantillon 20 µL, en utilisant un facteur de dilution le plus proche de la concentration mesurée obtenue à partir de l’échantillon d’abord 20 µL.
  5. Calculer la concentration moyenne de spermatozoïde de deux mesures.
  6. Multipliez signifie sperme concentration cellulaire avec le volume d’origine pour obtenir le nombre total de spermatozoïdes (à l’étape 2, cet ouvrage original est de 2 mL).

4. mesure des variations de la libre intracellulaire Ca2 +-concentration ([Ca2 +]i) à l’aide de Ca2 +- fluorimétrie (Figure 2)

Remarque : Utilisez un lecteur de plaque fluorescence, 384 plaques multipuits, Fluo-4 AM, swim-up spermatozoïdes purifiées (document établi en étape 2), composés d’intérêt comme des contrôles ainsi que positives et négatives, une pipette automatique répéteur et une pipette de 12 canaux.

  1. Préparer une Fluo-4 de 2 mM stock AM en ajoutant 22,7 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un flacon de 50 µg de Fluo-4 AM et bien mélanger le tube.
  2. Une partie aliquote de 700 µL de suspension remontée des spermatozoïdes récupérés (capacitated ou non capacitated comme indiqué dans étape2) s’ajoute un nouveau tube à essai. 700 µL de l’échantillon de sperme est le montant nécessaire pour analyser une ligne de 24 puits de la plaque de 384 puits (utilisé pour tester les 3 contrôles et 9 composés dans les doublets).
  3. Ajouter 3,5 µL de Fluo-4 AM solution stock à la 700 µL de suspension de sperme pour obtenir une concentration finale de 10 µM Fluo-4 AM.
  4. Incuber les échantillons pendant 45 min à 37 ° C, abri de la lumière.
  5. Centrifuger les échantillons à 700 x g pendant 10 min, aspirer et jeter le surnageant pour enlever l’excès de Fluo-4.
  6. Remettre en suspension les granulés colorés en FASS+ à 5 x 106 cellules/mL (c'est-à-dire, utiliser 2 x le volume de suspension cellulaire pris l’étape 4.2)
  7. Préparer des dilutions de composés et de contrôles (peut être fait pendant les périodes d’incubation et de la centrifugation à l’étape 4.4 et 4.5, respectivement).
    1. Diluer les composés, ainsi qu’un contrôle négatif (tampon avec véhicule) et un témoin positif (la progestérone) dans FASS+. Diluer les composés et les contrôles à 3 x la concentration finale souhaitée, comme ils sont dilués 1:3, lorsqu’ils sont ajoutés pour les spermatozoïdes à l’étape 4.16.
    2. Placer les tubes avec des dilutions dans un rack avec une distance entre tubes correspondant à la distance entre les pointes de pipette de la pipette de 12 canaux utilisé à l’étape 4.16.
  8. Utiliser une pipette à répétition automatique (24 pas de 50 µL).
    1. Échantillon de sperme teinté mix Fluo-4 doucement en pipettant également, la totalité du montant haut et en bas une fois.
    2. Ajouter des parties aliquotes de 50 µL à 24 puits d’une ligne dans la plaque 384 puits.
  9. Placer la plaque de microtitration dans un lecteur de fluorescence à 30 ° C et fermer le tiroir.
  10. Sélectionnez le protocole approprié pour Fluo-4. Exciter la fluorescence à 480 nm et émission record à 520 nm. Utilisez le plus rapide possible de temps de cycle avec le réglage.
    Remarque : Utiliser au moins 10 clignotements / optique bien et en bas, si possible.
  11. Sélectionnez un puits dans la rangée et ajuste le gain d’une valeur cible de 20 %.
  12. Démarrer la mesure.
  13. Contrôle du niveau de base pendant les 5 premiers cycles.
    1. Si l’affichage fluorescent augmente ou diminue avec le temps, arrêter l’expérience, réajuster le gain et recommencer l’expérience.
    2. Si la ligne de base diffère beaucoup entre les puits individuels d’affilée, soit le pipetage dans étape 4.8 a été imprécis ou l’échantillon est mélangé pas assez bien avant le pipetage. Jeter l’expérience.
    3. Si l’affichage fluorescent est comparable entre les puits de la ligne et stable pendant les 5 premiers cycles, passez à l’étape suivante.
  14. Après 10 cycles (utilisées pour référence), mettre en pause l’expérience.
  15. Éjecter le tiroir avec la plaque de microtitration.
  16. À l’aide d’une pipette de 12 canaux (2 échelons de 25 µL), rapidement ajouter 25 µL des solutions préparées des composés et des contrôles (de l’étape 4.7) au 12 reproduit bien (24 puits) d’une ligne. Des solutions sera dilué 1:3, car les puits contiennent déjà 50 µL de l’échantillon de sperme teinté.
  17. Continuer la mesure aussi rapidement que possible (tiroir fermera automatiquement) pour éviter le manque tout signal fluorescent induite par les composés ajoutés et contrôles. Changements de fluorescence (ΔF) après que l’ajout de composés et les contrôles est désormais capturée.
  18. Exécutez l’expérience jusqu'à ce que les signaux fluorescents ont été enregistrées depuis le contrôle positif et les composés d’intérêt.
  19. Arrêter l’expérience et exporter les données brutes de fluorescence pour l’analyser comme à l’étape 5.
    Remarque : Généralement Fluo-4 AM a été utilisé comme le Ca2 +-fluorophore sensible dans le test, mais les autres Ca2 +-fluorophores sensibles pourraient aussi servir si les spectres d’excitation et d’émission équipés de filtres dans le lecteur de fluorescence. Selon le choix du fluorophore, assurez-vous que le niveau de gain est fixé à un niveau « sûr » où les pics fluorescents induits sont dans la gamme de mesure de l’instrument. Cela peut être testé en ajoutant ionomycine à un puits unique à un réglage de gain spécifiques. Si cela induit un signal fluorescent au-dessus du seuil, abaisser le gain et réessayez. Certains utilisent Pluronique F-127 pour faciliter le chargement de Fluo-41,13, mais il a été constaté que ce n’est pas nécessaire2. Le nombre maximal de lignes mesurées simultanément dépend de deux facteurs. 1) le temps de cycle de l’instrument : si la durée du cycle est trop longue, pics induites dans [Ca2 +]je pourraient manquer. Mesurer un maximum de deux lignes en même temps de maintenir la durée du cycle bas ; 2) la vitesse de pipetage à l’étape 4.16 : à l’aide de la pipette de 12 canaux, il est possible d’ajouter rapidement des 12 différentes solutions pour les puits dédoublés 12 (24 puits) de 1 ou 2 lignes (par exemple, une ligne préalablement incubées avec véhicule et une ligne préalablement incubées avec un inhibiteur) , sans manquer de Ca2 + pics induites. Cependant, il n’est pas recommandé d’essayer d’ajouter 24 différentes solutions à deux rangées pour la mesure simultanée, car pipetage conseils devront être remplacés entre les deux étapes séquentielles pipetage, auquel cas Ca2 + pics induites pourraient manquer.

5. analyse des données de Ca2 +- fluorimétrie

  1. Ouvrir les données brutes de fluorescence obtenue et exporté à l’étape 4.
  2. Calculer la moyenne de puits dédoublés. Si des différences importantes existent entre les doublons, ignorer les données provenant des puits spécifiques.
  3. Qualifier les 10 premiers cycles de base.
  4. Calculer ΔF/F0 (%) comme le pourcentage change en fluorescence (ΔF) au fil du temps après addition des composés et des contrôles en ce qui concerne la fluorescence basale moyenne (F0) durant les 10 premiers cycles (de base).
  5. Si vous utilisez les données pour la génération des courbes dose-réponse, soustraire l’affichage de contrôle négatif des autres puits, pour supprimer les artefacts de pipetage.

6. mesures de réaction de l’Acrosome

Remarque : Utiliser un cytomètre en image, un incubateur, colorants fluorescents : PI, FITC-PSA et Hoechst 33342-, composés d’intérêt ainsi que les contrôles positifs et négatifs, une immobilisation solution contenant 0,6 M NaHCO3 et 0,37 % (v/v) de formaldéhyde dans l’eau distillée, une diapositive A2 et remontée capacitated purifiée cellules spermatiques (préparés à l’étape 2).

  1. Préparer une solution de coloration contenant PI (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) et Hoechst 33342 (100 µg/mL) en FASS+, mélangez-le bien à l’aide d’un agitateur vortex et protéger de la lumière jusqu'à l’utilisation.
  2. Préparer des solutions de composés et de contrôles à 10 fois la concentration finale souhaitée, car ils sont dilués 01:10 dans étape 6.5. Toujours inclure un contrôle négatif (véhicule) et deux contrôles positifs : concentration finale de progestérone 10 µM et la concentration finale d’ionomycine 2 µM.
  3. Transfert des parties aliquotes de 240 µL de spermatozoïdes capacitated (préparé à l’étape 2) pour tubes en plastique.
  4. Ajouter 30 µL de solution dans chaque tube de coloration. Concentration finale de taches seront : 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA et 10 µg/mL-Hoechst 33342.
  5. Ajouter 30 µL des solutions avec des contrôles ou des composés à chaque tube (01:10 dilution).
  6. Mélanger doucement les échantillons de pipetage et descendre quelques fois ou doux mélangé au vortex. En raison de contraintes mécaniques, éviter de mélanger excessive.
  7. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  8. Préparer les nouveaux tubes en plastique avec 100 µL d’une solution d’immobilisation contenant 0,6 M NaHCO3 et 0,37 % (v/v) de formaldéhyde dans l’eau distillée, un par tube à essai.
  9. Après incubation, mélanger les échantillons bien en pipettant également et ajouter 50 µL de l’échantillon dans un tube contenant 100 µL de solution d’immobilisation.
  10. Avant de charger les chambres d’une diapositive de A2, mélanger l’échantillon bien de pipetage. Remplir les chambres soigneusement avec environ 30 µL sans créer de bulles d’air.
    Remarque : Pendant l’incubation, les spermatozoïdes motiles tendent à agréger. Amas de cellules peuvent perturber les mesures (même si elles sont exclues). Par conséquent, il est très important d’un mélange intime de pipetage après incubation. De même, des bulles d’air dans les chambres peuvent perturber les mesures. Par conséquent, remplir la chambre lentement et changer l’angle de la pipette si les bords du liquide sont sur le point de rencontrer et de créer une bulle d’air.
  11. Placez le chariot chargé sur le plateau du cytomètre de l’image et fermer le tiroir.
  12. Sélectionnez le protocole FlexiCyte et appuyer sur Run.
    1. Choisissez les paramètres suivants pour le protocole FlexiCyte : nombre de canaux analytique : 2 ; Canal de masquage : UV (LED365), c’est le canal utilisé pour la segmentation d’images ; Canal 1 : Bleu (LED475), temps d’exposition 3 000 ms, filtre d’émission 560/35 ; Canal 2 : Vert (LED530), l’exposition le temps 500 ms, filtre d’émission 675/75 ; Nombre minimum de cellules analysées : 5000 ; Exclure les cellules agrégées : Oui.
  13. Répétez l’étape 6,9-6.12 jusqu'à ce que tous les échantillons ont été mesurés.

7. analyse des données d’image Cytometry

  1. Données obtenues à l’étape 6.
  2. Créez les deux parcelles suivantes pour évaluer les mesures.
    1. Créer un diagramme de dispersion de Hoechst 33342 intensité vs Hoechst 33342 zone bi-exponentielle échelles. Ce terrain peut être utilisé pour porte-Hoechst 33342 objets positifs qui sont trop petits ou trop grands pour être des spermatozoïdes humains.
    2. Créer un diagramme de dispersion de l’intensité de la FITC-PSA et intensité PI bi-exponentielle échelles. Cette parcelle peut servir à évaluer le montant de l’acrosome réagi spermatozoïdes par l’utilisation d’une barrière de quadrant qui sépare les quatre groupes sur le terrain (Figure 3) : 1) un PI positif et le groupe positive FITC-PSA : Acrosome réagi spermatozoïdes viables ; 2) un PI négatif et le groupe positive FITC-PSA : Acrosome réagi spermatozoïdes viables ; 3) un PI positif et FITC-PSA négatif groupe : Acrosome non viables sperme des cellules intactes ; et 4) un PI négatif et FITC-PSA négatif groupe : Acrosome intacts spermatozoïdes viables.

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Representative Results

Représentant résulte d’une expérience de tester l’effet de 4 composés (A, B, C et D) avec un positif (la progestérone) et le contrôle négatif (tampon) sur [Ca2 +]i dans le sperme humain en utilisant le débit moyen Ca2 +-signalisation test peut être vu dans la Figure 4 a. Dans la Figure 4 b, une courbe dose-réponse de la progestérone est montrée, qui a été dérivé de pic ΔF/F0 (%) données induites par des concentrations en série diluées de la progestérone, testé dans une autre expérience à l’aide de la Ca de débit moyen2 +-dosage de signalisation. L’analyse des données du Ca2 +-signalisation dosage est expliquée à l’étape 5. Représentant résulte d’une expérience test l’induction de la réaction de l’acrosome dans les spermatozoïdes humains capacitated en utilisant un contrôle négatif (DMSO) ou les deux contrôles positifs (progestérone et ionomycine) sur le moyen-débit acrosome réaction test peut voir dans le panneau supérieur de la Figure 3. Diagrammes de dispersion du quadrant dépendant de 3 conditions d’essai sont visibles. L’analyse des données de réaction acrosome est expliquée à l’étape 7.

Tableau 1 : solutions pour la préparation de FASS en Stock + . Solutions mères peuvent être conservées et réutilisées pour longues périodes de temps, Glucose et HEPES à-20 ° C et les autres solutions mères à température ambiante. S’assurer que toutes les solutions sont complètement dissous et bien mélangées avant utilisation.

Tableau 2 : préparation de FASS + avec 4 ou 25 mM HCO 3 - de solutions mères de sels (préparées dans le tableau 1). Na-Lactate peut être ajouté sous forme de sirop, 60 % (p/p), ou en poudre. NaHCO3 est ajouté sous forme de poudre.

Figure 1
Figure 1 : purification Swim-up de la motilité des spermatozoïdes humains. A gauche : Tube avec milieu HTF+ et une partie aliquote d’échantillon de sperme liquéfié éjectant au-dessous de la moyenne de FASS+ . A droite : Après 1 h de remontée à 37 ° C, des spermatozoïdes motiles ont nagé vers le haut dans le milieu de FASS+ . Les spermatozoïdes immobiles et morts ainsi que les spermatozoïdes restent dans le sperme sous le milieu de la HTF+ . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma du débit moyen Ca2 +-dosage de signalisation. (un) cellules spermatiques sont chargés avec un Ca2 +-sensible fluorophore, lavés et les parties aliquotes sont plaqués sur les puits d’une plaque 384 puits. plaque 384 puits (b) est placé dans un lecteur de fluorescence à 30 ° C. (c), à la Fluorescence est enregistré avant et après l’ajout de composés, témoin positif (la progestérone) et le contrôle négatif (tampon avec véhicule). Lectures en ΔF/F0 (%) après l’addition (flèches) du contrôle positif et négatif sont illustrées dans le fond de (c). Illustration, utilisé avec la permission de Christian Schiffer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : évaluation de la réaction de l’acrosome utilisant l’image cytometry. (Panneau supérieur) Quadrant dépendant des intrigues d’un contrôle négatif véhicule (DMSO) et la progestérone témoins positifs (Prog, 10 µM) et ionomycine (Iono, 2 µM). Une augmentation des cellules dans le quadrant inférieur droit (acrosome réagi cellules viables) est vu lorsque l'on compare les contrôles positifs au contrôle DMSO. (Panneau inférieur) Images microscopiques de spermatozoïdes fluorescent étiquetés, y compris les cellules de tous les groupes de quatre. BF = champ lumineux, Hoechst = Hoechst-33342, PSA = Pisum Sativum agglutinine, PI = l’iodure de Propidium. Echelle = 10 µm. Ce chiffre a été modifié par Egeberg Palme et coll. 20187. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemple de données de Ca2 +- fluorimétrie. (a) changements dans [Ca2 +]j’ai induite par le témoin négatif, progestérone et le composé A, B, C et D. (b), courbe de dose-réponse de progestérone. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le débit moyen Ca2 + signalisation est basé sur des mesures de fluorescence des micropuits unique chaque contenant environ 250 000 spermatozoïdes. Le signal capturé est en moyenne de toutes les cellules de sperme individuels dans le puits. Le test fournit donc qu'aucune information spatiale sur l’endroit où plus précisément dans la cellule de sperme [Ca2 +]j’ai n’est changée, comment grand une proportion des spermatozoïdes [Ca2 +]i un changement a lieu, ou comment hétérogènes la réponse est entre les cellules individuelles. Pour obtenir ces informations, expériences avec résolution de cellule unique (tel que décrit dans50,52) doivent être employés. Un autre inconvénient de cette technique est la résolution temporelle, qui est de l’ordre des secondes. Même si les échantillons de sperme 50 µL sont bien mélangés, lorsque 25 µL des solutions sont ajoutés, les mesures d’abord peuvent être lancées après que le tiroir avec la plaque multipuit est à l’intérieur du lecteur de plaque de fluorescence. Pour obtenir la meilleure résolution temporelle, les autres techniques doivent être utilisées (par exemple, un flux stoppé fluorimétrie13,50). L’avantage du débit moyen Ca2 +-dosage, par rapport aux méthodes monocellulaires ou puits de signalisation, c’est que la mesure simultanée de plusieurs puits à l’aide d’un lecteur de microplaques permet de rapidement et facilement tester de multiples side-by-side avec les contrôles positifs et négatifs des composés (Figure 4)1,2, génération facile des courbes dose-réponse de composés individuels (Figure 4)1,2,3 , 4 , 5, évaluation d’additivité1,2 et synergie3 pour plusieurs composés, ainsi que des études de mode d’action des expériences d’inhibition compétitive bien composés et l’usage du particulier inhibiteurs pharmacologiques (par exemple, CatSper inhibiteurs1,2,3,4,,5). En outre, en changeant le fluorophore, l’essai peut être utilisée pour analyser les autres changements intracellulaires (par exemple, pHj’ai1,2). Enfin, plus d’un fluorophore peut servir à la fois de mesurer simultanément plusieurs modifications intracellulaires. À l’avenir, le débit moyen Ca2 +-dosage pourrait être utilisé pour préliminaire des composés d’intérêt pour les effets sur Ca2 +de signalisation-signalisation dans les spermatozoïdes humains (par exemple, les produits chimiques environnementaux ou candidats-médicaments) examiner le potentiel indésirable effets sur la fonction des cellules de sperme humain ou pour enquêter sur un possible rôle comme contraceptif.

Le test de réaction moyen débit acrosome est basé sur la cytométrie en image, ce qui constitue un substitut attrayant pour évaluer la réaction de l’acrosome humaine par rapport à l’évaluation manuelle à l’aide d’un microscope à fluorescence. Colorations des acrosomes intacts ou réaction/réagi ne sont pas toujours claires, et une grande variation intra-individuelle peut être la conséquence présentes. Avec image cytométrie en flux, les images sont acquises et analysés automatiquement. Le canal de masquage, dans cette affaire Hoechst-33342, définit les cellules et seulement des signaux fluorescents provenant de ces zones spécifiques sont inclus dans l’analyse des données. Par conséquent, la coloration des organes énucléés contenant du cytoplasme résiduel n’est pas incluse dans l’analyse des données. En outre, statistiques de comptage est supérieure à la microscopie de fluorescence. Pour compter 200 cellules par les oculaires du microscope est une tâche difficile et laborieuse, mais avec image cytometry l’analyse d’au moins 5 000 cellules prend moins de quelques minutes. Toutefois, en raison de la faible grossissement de l’image cytomètre, la possibilité d’évaluer les mesures est perdue et il faudra amener l’échantillon coloré à la microscopie à fluorescence. Par conséquent, l’inclusion des contrôles est de la plus haute importance pour valider les mesures. Si les commandes ne réagissent pas comme prévu, les résultats d’une expérimentation devraient être jetés. Le protocole décrit ici a été inspiré par le travail effectué par Zoppino et al.49, qui a évalué la réaction humaine acrosome par cytométrie en flux. Il a décrit par ailleurs la microscopie de fluorescence en temps réel comment PSA entre dans le compartiment acrosomique lorsque les pores de la membrane-fusion apparaissent lors de l’induction de la réaction de l’acrosome. Une fois dans le compartiment de l’acrosome, PSA s’obstrue et forme un mark stable pendant de longues périodes de temps. Aucune fixation ou la perméabilisation n’est appliquée dans le protocole et par conséquent l’interprétation du résultat est claire : PSA dans le compartiment acrosomique d’une cellule de sperme viable est égale à la réaction de l’acrosome. En ce qui concerne le Ca2 +-signalisation test, le test de réaction acrosome pourrait également servir à évaluer les courbes dose-réponse, inhibition, additivité et la synergie des composés d’intérêt. À l’avenir, le test de réaction moyen débit acrosome pourrait également servir à préliminaire des composés d’intérêt pour les effets sur les spermatozoïdes humains des réaction acrosome (p. ex., les produits chimiques environnementaux ou candidats-médicaments) pour examiner les effets négatifs potentiels sur cet homme la fonction des cellules de sperme ou d’enquêter sur un possible rôle comme contraceptif.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs aimerait remercier le laboratoire de Timo Strünker contrôle des AR et DLE lors de leurs séjours dans son laboratoire. En outre, nous tenons à remercier nos collègues au ministère de la croissance et la Reproduction, hôpital universitaire de Copenhague, Rigshospitalet, pour leur contribution à la mise en place de ces deux essais. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Danemark du fonds d’Innovation (numéros de subvention 3-005-2010 et 2013-14-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie numéro 145 sperme sperme CatSper Calcium Acrosome fertilité
Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca<sup>2 +</sup>-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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