Summary
Qui, due saggi di medio-velocità effettiva per la valutazione degli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sono descritti. Queste analisi possono essere utilizzate per rapidamente e facilmente a schermo grandi quantità di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano.
Abstract
CA2 +-segnalazione è essenziale per la funzione normale delle cellule dello sperma e la fertilità maschile. Allo stesso modo, la reazione acrosomiale è vitale per la capacità di una cellula di sperma umana di penetrare la zona pellucida e fecondare l'uovo. È quindi di grande interesse per testare composti (per esempio, sostanze chimiche ambientali o candidati farmaci) per il loro effetto su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sia per esaminare i potenziali effetti negativi sulla funzione delle cellule dello sperma umano o per indagare su un possibile ruolo come contraccettivo. Qui sono descritti due saggi di media-velocità di trasmissione: 1) un'analisi di fluorescenza-basata per la valutazione degli effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano e 2) un'analisi cytometric di immagine per la valutazione della reazione acrosomiale in sperma umano. Queste analisi possono essere utilizzate per lo screening di un gran numero di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano. Inoltre, l'analisi possono essere utilizzate per generare le curve dose-risposta altamente specifici dei singoli composti, determinare il potenziale additività/sinergismo per due o più composti e per studiare il modo farmacologico di azione attraverso l'inibizione competitiva esperimenti con gli inibitori CatSper.
Introduction
Lo scopo dei due saggi qui descritto è quello di esaminare gli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano, come è stato dimostrato per molteplici composti in diverse pubblicazioni che impiegano questi dosaggi1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-segnalazione e la reazione acrosomiale sono entrambi funzione vitale al normale umano delle cellule dello sperma e fertilità maschile.
L'obiettivo generale di uno spermatozoo umano è quella di fecondare l'uovo. Per poter correttamente e naturalmente fecondare l'uovo, le funzioni della cellula dello sperma devono essere regolate strettamente durante il viaggio della cellula dello sperma attraverso il tratto riproduttivo femminile8,9. Molte delle funzioni delle cellule dello sperma sono regolati tramite intracellulare Ca2 +-concentrazione [Ca2 +]i (ad es., spermatozoi motilità, chemiotassi e acrosomiale reazione)10. Inoltre, un processo di maturazione chiamato capacitazione, che rende la cellula dello sperma in grado di fecondare l'uovo, è parzialmente regolamentato da [Ca2 +]i10. CA2 +-estrusione Ca2 +-ATPase pompe11 mantenere una piega circa 20.000 Ca2 +-gradiente sopra la membrana delle cellule dello sperma umano, con un riposo [Ca2 +]io di 50-100 nM. Se Ca2 + è consentito di attraversare la membrana cellulare (ad esempio, attraverso l'apertura di Ca2 +-canali), si verifica un considerevole afflusso di Ca2 + , dando luogo a un'altitudine di [Ca2 +]i. Tuttavia, la cellula dello sperma inoltre trasporta intracellulare di Ca2 +-negozi, che possono liberare Ca2 + e, di conseguenza, anche il danno luogo un'elevazione della [Ca2 +]i12. Interessante, tutti i canali-mediata Ca2 +-afflusso in cellule dello sperma umane finora è stato trovato per accadere via CatSper (gattocanale ionico di rm Spe), che è espresso solo in cellule spermatiche11. In cellule umane di sperma, CatSper viene attivato dal progesterone ligandi endogeni e prostaglandine attraverso distinto ligando vincolanti siti13,14,15, portando a un rapido Ca2 +-afflusso in le cellule di sperma. Due principali fonti vicino l'uovo forniscono alti livelli di questi ligandi endogeni. Uno è il liquido follicolare che contiene alti livelli di progesterone16. Il liquido follicolare viene rilasciato da follicoli maturi insieme con l'uovo all'ovulazione e si mescola con il liquido all'interno del ovidotti17. L'altra fonte principale è le cellule del cumulo che circondano l'uovo e il rilascio di alti livelli di progesterone e prostaglandine. Il progesterone-indotto Ca2 +-afflusso in cellule dello sperma è stato indicato per mediare chemiotassi verso l'uovo9,18, controllo della motilità dello sperma19,20 e stimolare l'acrosomiale reazione a21. Attivazione di questi singoli [Ca2 +]i-funzioni di sperma regolamentato nell'ordine corretto e al momento giusto è fondamentale per la fecondazione dell' uovo8. In linea con questo, suboptimale indotta da progesterone Ca2 +-afflusso è stato trovato per essere associato con ridotta fertilità maschile22,23,24,25,26 ,27,28,29 e CatSper funzionale è essenziale per la fertilità maschile26,30,31,32, 33,34,35,36.
Come gli spermatozoi raggiungere l'uovo, una sequenza di eventi deve avvenire per avvenire la fertilizzazione: 1) le cellule dello sperma deve penetrare lo strato di cellule cumulus circostante, 2) associare alla zona pellucida, 3) exocytose il contenuto acrosomale, la reazione acrosomiale cosiddetto 37, 4) penetrare la zona pellucida e 5) si fondono con la membrana dell'uovo per completare la fecondazione38. Per essere in grado di passare attraverso questi passaggi e fecondare l'ovulo, la cellula dello sperma deve prima subire capacitazione11, che comincia come cellule dello sperma lasciare il liquido seminale contenente "decapacitating" fattori39 e nuotare nei fluidi della femmina tratto riproduttivo con alti livelli di bicarbonato e l'albumina37. Capacitazione rende gli spermatozoi in grado di subire iperattivazione, una forma di motilità con un battente vigorosa del flagello e di reazione acrosomiale37. Motilità iperattivata è necessaria per la penetrazione della zona pellucida40e acrosomiale contiene vari enzimi idrolitici che gli aiuti di questo processo di penetrazione41. Inoltre, la reazione acrosomiale rende gli spermatozoi capaci di fondere con l'uovo esponendo proteine specifiche della membrana sulla superficie degli spermatozoi necessaria per sperma-uovo fusione42. Di conseguenza, la capacità di subire la reazione acrosomiale iperattivazione sono entrambi necessari per la fecondazione dell'uovo40,42. Contrariamente a quanto visto per mouse spermatozoi43,44,45, solo umano delle cellule dello sperma che sono acrosomiale intatta possibile associare alla zona pellucida46. Quando le cellule di sperma umane sono limitate alla zona pellucida devono subire la reazione acrosomiale sia per penetrare la zona pellucida41 ed esporre proteine di membrana specifici che sono necessari per la fusione con l' uovo38. La tempistica della reazione acrosomiale in sperma umano è così critica per avvenire la fertilizzazione.
Come descritto in precedenza, Ca2 +-segnalazione è vitale per spermatozoi normali delle cellule funzione8, ed è, quindi, di grande interesse per essere in grado di grandi numeri di schermo di composti per effetti su Ca2 +-segnalazione in cellule di sperma umane. Allo stesso modo, solo umano delle cellule dello sperma che subiscono reazione acrosomiale al momento giusto e nel luogo può penetrare la zona pellucida e fecondare l'uovo46,47, è anche di grande interesse per essere in grado di testare composti per la loro capacità di influenzare la reazione acrosomiale in sperma umano. A tal fine, sono descritti due saggi di screening medio-resa: 1) un test per effetti su Ca2 +-segnalazione in cellule dello sperma umane e 2) un test per la capacità di indurre la reazione acrosomiale in cellule umane di sperma.
Dosaggio 1 è un mezzo-rendimento Ca2 +-saggio di segnalazione. Questa tecnica basata su lettore di fluorescenza piastra controlla le modifiche in fluorescenza in funzione del tempo contemporaneamente in pozzi multipli. Il Ca2 +-sensibili colorante fluorescente, Fluo-4 ha un Kd per Ca2 +≈ 335 nM ed è cellula-permeante sotto forma di estere AM (acetossimetil). Utilizzando Fluo-4, è possibile misurare le variazioni di [Ca2 +]i , nel corso del tempo e dopo l'aggiunta di composti di interesse per le cellule dello sperma. Il dosaggio è stato sviluppato dal laboratorio di Timo Strünker nel 201113 e da allora è stato utilizzato in parecchi studi ai composti di schermo per effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano1,2,3, 4,5. Inoltre è stato utilizzato un metodo simile allo schermo più droga candidati48. Inoltre, questo test è anche utile per valutare la modalità farmacologica dell'azione1,2,3,4,5, di curve dose-risposta1, 2,3,4,5, inibizione competitiva1,2, additività1,2e sinergismo3 di composti di interesse.
Metodo 2 è un reazione acrosomiale medio-velocità di trasmissione. Questa tecnica di immagine basati su citometro misura la quantità di vitali acrosomiale ha reagito spermatozoi in un campione, utilizzando tre coloranti fluorescenti: ioduro di propidio (PI), accoppiati a FITC lectina di Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. Il dosaggio è stato modificato da un simile metodo basato su cytometry di flusso da Zoppino et al.49 ed è stato utilizzato in diversi studi6,7. Per quanto riguarda il Ca2 +-segnalazione test, questo saggio di reazione acrosomiale potrebbe essere utilizzato anche per valutare le curve dose-risposta, inibizione, additività e sinergismo di composti di interesse.
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Protocol
La raccolta e l'analisi di campioni di liquido seminale umano nei protocolli segue le linee guida del comitato etico di ricerca della regione di Hovedstaden. Tutti i campioni di seme sono stati ottenuti dopo consenso informato da donatori volontari. Dopo la consegna, i campioni sono stati completamente anonimi. Per loro disagi ogni donatore ha ricevuto un compenso di 500 DKK (circa $75 dollari USA) per campione. I campioni sono stati analizzati il giorno della consegna e poi distrutti immediatamente dopo gli esperimenti di laboratorio.
Nota: La velocità effettiva media Ca2 +-segnalazione test è descritto in passaggi 4-5 e l'analisi di reazione acrosomiale medie velocità effettiva nei passaggi 6-7. Il protocollo per preparare mezzo fluido tubarico umano (HTF+) è descritto nel passaggio 1 e la purificazione delle cellule dello sperma per le analisi è descritto nei passaggi 2-3.
1. preparazione del mezzo fluido tubarico umano (HTF+)
Nota: Uso matracci tarati di dimensioni appropriate, un 1 L misura cilindro, un agitatore magnetico, sali come elencato nella tabella 1 e tabella 2, acqua purificata, un 0,2 µm pori filtro e tubi di plastica di 50 mL.
-
Preparare soluzioni di riserva di sali in acqua purificata (tabella 1).
- Aggiungere la quantità di sale elencate nella tabella 1 in un matraccio di dimensioni adeguate, aggiungere acqua purificata per un po' sotto il volume desiderato e mescolare bene con un agitatore magnetico.
- Quando il sale si è sciolto completamente, rimuovere il magnete e il riempimento con acqua purificata al volume finale desiderato.
- Trasferire la soluzione di riserva a una bottiglia e conservare fino all'utilizzo.
Nota: Soluzioni di riserva possono essere conservate e riutilizzate per lunghi periodi di tempo: glucosio e HEPES a-20 ° C e le altre soluzioni di riserva a temperatura ambiente (TA). -
Preparare 1 L di+ preparato HTF dalle soluzioni di riserva (tabella 2).
- Assicurarsi che tutte le soluzioni di riserva sono completamente sciolto e ben mescolate prima dell'uso.
- Aggiungere la quantità di soluzione di riserva e sale elencate in tabella 2 per una L 1 cilindro graduato e acqua purificata a 900 mL.
- Mescolare bene con un agitatore magnetico e regolare il pH a 7.35 con soluzione di NaOH.
- Rimuovere il magnete e aggiungere acqua purificata a 1.000 mL.
- Mezzo di HTF+ sterile filtrato attraverso un 0,2 µm poro filtro, aliquotare HTF+ medio-provette in plastica da 50 mL e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Appena prima di eseguire un esperimento, aggiungere 165 µ l di Na-piruvato ad l'aliquota di 50 mL per ottenere una concentrazione finale di Na-piruvato di 0,33 mM.
Nota: Mezzo fluido tubarico umano sono ottenibili anche da vari fornitori commerciali. Quando si utilizza il mezzo di 4mm HCO3– , i campioni possono essere incubati con palpebre chiuse in un incubatore senza supplementare di CO2 nell'aria senza grandi cumuli di pH. Se un incubatore a CO2 è disponibile, la corrispondente quantità di CO2 è calcolabile utilizzando l'equazione di Henderson-Hasselbalch e utilizzato. Se si utilizza il mezzo di 25mm HCO3– , i campioni vanno incubati con coperchi aperti in incubatore a CO2 con aria contenente una corrispondente quantità di CO2 (dipende dalla pressione atmosferica, di solito tra 5-10%) per evitare una deriva di pH. L'esatta quantità di CO2 può essere calcolata utilizzando l'equazione di Henderson-Hasselbalch.
2. purificazione degli spermatozoi motili tramite Swim-up (Figura 1)
Nota: Utilizzare un contenitore di plastica pulito largo-mouthed per il campione di sperma, un incubatore, provette in plastica da 50 mL, un rack per l'immissione di provette in plastica da 50 mL in un angolo di 45°, il preparato HTF+ (preparato nel passaggio 1 o ottenuto dal provider commerciale), centrifuga e siero umano albumina umana (HSA).
- Ottenere un campione di liquido seminale umano appena donato prodotto attraverso la masturbazione ed eiaculato in un contenitore di plastica pulito largo-mouthed. Utilizzare solo campioni di liquido seminale che soddisfano i parametri stabiliti nel manuale di laboratorio del WHO per l'esame e il trattamento dello sperma umano.
- Incubare il campione a 37 ° C per 15-30 min consentire a liquefare.
- Scaldare 50 mL di HTF+ con 4 mM HCO3– a 37 ° C.
- Posto pulito mL 50 tubi di plastica in un rack da un'angolazione di 45° (per aumentare la superficie tra liquidi). Utilizzare 1 tubo per mL di sperma grezzo.
- Aggiungere 4 mL di terreno HTF+ preriscaldato a ciascuna delle provette.
- Attentamente e dispensare 1 mL del campione lo sperma liquefatto il fondo di ogni provetta contenente 4 mL di HTF preriscaldato+. Evitare la fuoriuscita di bolle d'aria.
- Chiudere i coperchi e incubare le provette a 37 ° C per 1 h.
- Delicatamente aspirare e trasferire così tanto della frazione superiore (HTF+ con spermatozoi motili) come possibile ad un nuovo tubo di plastica da 15 mL, prestando attenzione che niente dalla frazione inferiore (lo sperma con cellule immotile e morte) è incluso. In genere, è sicuro di trasferire 3,5 mL della frazione superiore, senza disturbare la frazione di fondo. Per evitare turbolenze aspirazione, tagliato il più esterno 1-2mm della punta della pipetta ad un angolo di 45° per ottenere una maggiore apertura.
- Riempire il tubo di plastica da 15 mL con HTF+ per lavare le cellule e centrifugare la provetta a 700 x g per 10 minuti a TA.
- Delicatamente aspirare e rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule di sperma in 2 mL di HTF+.
- Trasferimento di 20 µ l della sospensione di sperma per due piccoli tubi di plastica per la valutazione della concentrazione di spermatozoi (vedi passo 3).
- Riempire il tubo di plastica da 15 mL con HTF+ per lavare le cellule e centrifugare la provetta a 700 x g per 10 minuti a TA.
-
Delicatamente aspirare e rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di spermatozoi cellulare a 10 x 106 cellule/mL (basato sulla concentrazione cellulare valutata al punto 2.11).
- Per gli esperimenti utilizzando spermatozoi ONU-capacitati (routine Ca2 +-saggio di segnalazione)
- Risospendere le cellule in HTF+ con 4 mM HCO3–.
- Aggiungere 30 µ l di albumina sierica umana (HSA) (100 mg/mL) per millilitro HTF+ per ottenere una concentrazione finale di 3 mg/mL.
- Chiudere i coperchi e incubare per ≥ 1 h a 37 ° C.
- Per gli esperimenti usando capacitated delle cellule dello sperma (analisi di reazione acrosomiale)
- Risospendere le cellule in HTF+ con 25 mM HCO3–.
- Aggiungere 30 µ l di HSA (100 mg/mL) per millilitro HTF+ per ottenere una concentrazione finale di 3 mg/mL.
- Fissare coperchi senza bloccare e incubare per ≥ 3 ore a 37 ° C con la corrispondente quantità di CO2 (Vedi punto 1, di solito tra 5-10% CO2).
- Per gli esperimenti utilizzando spermatozoi ONU-capacitati (routine Ca2 +-saggio di segnalazione)
3. conteggio delle cellule dello sperma
Nota: Delle cellule dello sperma può neanche contare manualmente50 o utilizzando un citometro immagine51, come descritto qui. Utilizzare un citometro di immagine, un Vortex, S100 buffer, una musicassetta di SP1, acquabar purificato delle cellule dello sperma (preparate al punto 2).
- Diluire un'aliquota ad un fattore di 10, 20, 30, 50 o 90 a S100 buffer utilizzando una provetta da 2 mL fondo tondo secondo la concentrazione attesa (valutata mediante ispezione manuale del pellet nel passaggio 2.10) 20 µ l. Uso la diluizione che è più vicina alla concentrazione previsto (ad esempio, se una concentrazione di 15 x 106 spermatozoi / mL dopo sommerso è previsto poi diluire il 20 µ l di campione di sperma con 380 µ l di tampone di S100 [fattore di diluizione 20]).
- Mescolare bene per 10 s usando un miscelatore vortex a massima 700 rpm, immergere la SP1-cassetta nel campione e premere lo stantuffo bianco completamente verso il basso per aspirare un'aliquota del campione nel cassetto.
- Aprire il citometro di immagine, inserire la cassetta nel vassoio ed eseguire il dosaggio Conte di PI macchiato delle cellule dello sperma analisi umana secondo il fattore di diluizione applicato (scelto nel passaggio 3.1).
- Ripetere il passaggio 3.1-3.3 con un altro 20 µ l di campione, usando un fattore di diluizione più vicino alla concentrazione misurata ottenuta dai primi 20 µ l di campione.
- Calcolare la concentrazione cellulare media di sperma da due misurazioni.
- Si moltiplicano dire sperma concentrazione di cellule con il volume originale per ottenere il numero totale delle cellule dello sperma (nel passaggio 2, questo volume originale è di 2 mL).
4. misurazione delle variazioni nella libera intracellulare Ca2 +-concentrazione ([Ca2 +]i) utilizzando Ca2 +- fluorimetria (Figura 2)
Nota: Utilizzare un lettore di fluorescenza, 384 piastre multi-pozzetto, Fluo-4 AM, sull'acqua purificata delle cellule dello sperma (preparato in passaggio 2), composti di interesse come i controlli negativi e positivi, una pipetta a ripetizione automatica e una pipetta di 12 canali.
- Preparare un 2mm Fluo-4 stock AM aggiungendo 22,7 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) in un flaconcino di 50 µ g Fluo-4 AM e mescolare bene il tubo.
- Aggiungere un'aliquota di sospensione di 700 µ l-sommerso recuperati sperma (capacitato o ONU-capacitato come indicato nel passaggio 2) in una nuova provetta. 700 µ l di campione di sperma è la quantità necessaria per analizzare una fila di 24 pozzetti in micropozzetti di 384 (usare nel test 3 controlli e 9 composti in doppietti).
- Aggiungere 3,5 µ l di Fluo-4 soluzione di riserva AM per il 700 µ l della sospensione di sperma per ottenere una concentrazione finale di 10 µM Fluo-4 AM.
- Incubare il campione per 45 min a 37 ° C, al riparo dalla luce.
- Centrifugare il campione a 700 x g per 10 min, aspirare e scartare il surnatante per rimuovere l'eccesso Fluo-4.
- Risospendere il pellet macchiato in HTF+ a 5 x 106 cellule/mL (cioè, uso 2 x il volume della sospensione cellulare preso in fase 4.2)
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Preparare le diluizioni dei composti e i controlli (che può essere fatto durante i periodi di incubazione e centrifugazione nel passaggio 4.4 e 4.5, rispettivamente).
- Diluire composti, nonché un controllo negativo (buffer con veicolo) e un controllo positivo (progesterone) in HTF+. Diluire composti e i controlli per 3 volte la concentrazione finale desiderata, come essi sono diluiti 1:3 quando vengono aggiunte a cellule dello sperma nel passaggio 4,16.
- Disporre le provette con diluizioni in un rack con una distanza tra i tubi corrispondenti alla distanza tra le punte di pipetta della pipetta 12 canali utilizzato nel passaggio 4,16.
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Utilizzare una pipetta a ripetizione automatica (24 passi di 50 µ l).
- Mix Fluo-4 macchiato il campione di sperma dolcemente pipettando l'intero importo su e giù una volta.
- Aggiungere le aliquote di 50 µ l a 24 pozzetti di una riga in micropozzetti di 384.
- Posizionare la piastra microtiter in un lettore di fluorescenza a 30 ° C e chiudere il cassetto.
- Selezionare il protocollo appropriato per Fluo-4. Eccitare la fluorescenza a 480 nm e record emissione a 520 nm. Utilizzare il tempo di ciclo più veloce possibile con l'impostazione.
Nota: Utilizzare almeno 10 lampi al pozzo e fondo ottica, se possibile. - Selezionare un pozzo nella riga e regolare il guadagno per un valore di destinazione del 20%.
- Avviare la misurazione.
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Controllo della linea di base durante i primi 5 cicli.
- Se la lettura fluorescente è aumentando o diminuendo nel corso del tempo, fermare l'esperimento, regolare il guadagno di nuovo e ricominciare l'esperimento.
- Se la linea di base varia molto tra singoli pozzetti in una riga, o il pipettaggio nel passaggio 4.8 è stato impreciso o il campione non è stato mescolato abbastanza bene prima di pipettaggio. Scartare l'esperimento.
- Se la lettura fluorescente è comparabile tra i pozzetti nella riga e costante durante i primi 5 cicli, continuare al passaggio successivo.
- Dopo 10 cicli (utilizzati per la linea di base), mettere in pausa l'esperimento.
- Espellere il cassetto con la piastra microtiter.
- Usando una pipetta a 12 canali (2 passi di 25 µ l), rapidamente aggiungere 25 µ l delle soluzioni preparate di composti e i controlli (dal punto 4.7) per i duplicati di ben 12 (24 pozzetti) di una riga. Soluzioni sarà diluito 1:3, come i pozzi già contengono 50 µ l di campione di sperma macchiato.
- Continuare la misurazione nel minor tempo possibile (cassetto si chiuderà automaticamente) per evitare di perdere qualsiasi segnali fluorescenti indotti dai composti aggiunto e controlli. Modifiche in fluorescenza (ΔF) dopo l'aggiunta di composti e i controlli ora sarà catturato.
- Eseguire l'esperimento fino a segnali fluorescenti sono stati registrati da controllo positivo e i composti di interesse.
- Interrompere l'esperimento ed esportare i dati grezzi di fluorescenza per analizzarlo come nel passaggio 5.
Nota: Generalmente Fluo-4 del mattino è stato usato come il Ca2 +-sensibile fluoroforo nel dosaggio, ma altri Ca2 +-fluorofori sensibili potrebbero essere utilizzato anche se eccitazione e spettri di emissione adatta con filtri nel lettore della piastra di fluorescenza. A seconda della scelta di fluoroforo, assicurarsi che il livello di guadagno è impostato su un livello "sicuro" dove i picchi fluorescenti indotti sono nell'intervallo di misura dello strumento. Questo può essere testato aggiungendo ionomicina per un singolo pozzo con un'impostazione di guadagno specifico. Se ciò ha indotto un segnale fluorescente sopra la soglia, abbassare il guadagno e riprovare. Alcuni usano Pluronic F-127 per facilitare il caricamento di Fluo-41,13, ma è stato trovato che questo non è necessario2. Il numero massimo di righe misurati simultaneamente dipende da due fattori. 1) il tempo di ciclo dello strumento: se il tempo di ciclo è troppo lungo, indotti [Ca2 +]i picchi potrebbero essere tralasciate. Misurare un massimo di due righe contemporaneamente di mantenere il tempo di ciclo basso; 2) la velocità di pipettaggio nel passaggio 4,16: utilizzando la pipetta di 12 canali, è possibile aggiungere rapidamente 12 diverse soluzioni 12 pozzetti duplicati (24 pozzetti) di 1 o 2 righe (ad esempio, una riga pre-incubate con veicolo e una riga pre-incubate con un inibitore) , senza perdere il Ca2 + cime indotte. Tuttavia, non è consigliabile tentare di aggiungere 24 diverse soluzioni a due righe per la misurazione simultanea, come consigli di pipettaggio dovrà essere sostituito tra i due passaggi di pipettaggio sequenziali, per cui potrebbero essere mancati indotto Ca2 + picchi.
5. analisi dei dati da Ca2 +- fluorimetria
- Aprire i dati raw fluorescenza ottenuto ed esportati nel passaggio 4.
- Calcolare la media da pozzetti duplicati. Se esistono grandi differenze tra i duplicati, eliminare i dati dai pozzetti specifici.
- Definire la linea di base come i primi 10 cicli.
- Calcolare ΔF/F0 (%) come la percentuale cambia in fluorescenza (ΔF) nel corso del tempo dopo l'aggiunta di composti e i controlli per quanto riguarda la media basale di fluorescenza (F0) durante i primi 10 cicli (baseline).
- Se utilizza i dati per la generazione di curve dose-risposta, sottrarre la lettura di controllo negativo da altri pozzi, per rimuovere gli artefatti di pipettaggio.
6. misurazione della reazione acrosomiale
Nota: Utilizzare un citometro di immagine, un incubatore, tinture fluorescenti: PI, FITC-PSA e Hoechst-33342, composti di interesse così come controlli positivi e negativi, una soluzione immobilizzante contenenti 0,6 M NaHCO3 e formaldeide 0,37% (v/v) in acqua distillata, una diapositiva di A2 e capacitate-sommerso purificate cellule spermatiche (preparate al punto 2).
- Preparare una soluzione colorante contenente PI (5 µ g/mL), FITC-PSA (50 µ g/mL) e Hoechst 33342 (100 µ g/mL) in HTF+, mescolarlo bene usando un miscelatore vortex e proteggerlo dalla luce fino all'utilizzo.
- Preparare soluzioni di composti e i controlli a 10x la concentrazione finale desiderata, come sono diluiti 01:10 al punto 6.5. Includere sempre un controllo negativo (veicolo) e due controlli positivi: concentrazione finale di Progesterone 10 µM e ionomicina 2 µM concentrazione finale.
- Trasferire le aliquote di 240 µ l di spermatozoi capacitati (preparata al punto 2) tubi di plastica.
- Aggiungere 30 µ l di soluzione per ogni tubo di colorazione. Concentrazione finale di macchie sarà: 0,5 µ g/mL PI 5 µ g/mL FITC-PSA e 10 µ g/mL Hoechst 33342.
- Aggiungere 30 µ l delle soluzioni con controlli o composti ad ogni provetta (01:10 diluizione).
- Mescolare delicatamente i campioni pipettando su e giù per un paio di volte o lieve nel Vortex. Sollecitazioni meccaniche, evitare eccessiva mescolazione.
- Incubare a 37 ° C per 30 min.
- Preparare nuove provette di plastica con 100 µ l di soluzione immobilizzante contenente 0,6 M NaHCO3 e formaldeide 0,37% (v/v) in acqua distillata, uno per ogni provetta.
- Dopo l'incubazione, miscelare i campioni ben pipettando e aggiungere 50 µ l di campione in una provetta con 100 µ l di soluzione immobilizzante.
- Prima di caricare gli alloggiamenti di una diapositiva di A2, mescolare il campione ben pipettando. Riempire le camere attentamente con circa 30 µ l senza creare bolle d'aria.
Nota: Durante l'incubazione, le cellule degli spermatozoi motili tendono ad aggregare. Grumi di cellule possono disturbare le misure (anche se sono esclusi). Pertanto, un'accurata miscelazione pipettando dopo incubazione è molto importante. Allo stesso modo, le bolle d'aria nelle camere possono disturbare le misurazioni. Quindi, riempire lentamente la camera e cambiare l'angolo della pipetta se i bordi del liquido stanno per incontrare e creare una bolla d'aria. - Porre il vetrino caricato sul vassoio del citometro immagine e chiudere il vassoio.
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Selezionare il protocollo FlexiCyte e premere il tasto Run.
- Scegliete le seguenti impostazioni per il protocollo FlexiCyte: numero di canali analitici: 2; Canale di mascheramento: UV (LED365), questo è il canale utilizzato per la segmentazione di immagini; Canale 1: Blu (LED475), tempo di esposizione 3.000 ms, filtro di emissione 560/35; Canale 2: Verde (LED530), tempo di esposizione 500 ms, filtro di emissione 675/75; Numero minimo di cellule analizzate: 5000; Escludere le cellule aggregate: Sì.
- Ripetere il passaggio 6,9-6.12 fino a quando tutti i campioni sono stati misurati.
7. analisi dei dati dall'immagine Cytometry
- Apri dati ottenuti nel passaggio 6.
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Creare le due trame seguenti per valutare le misure.
- Creare un grafico a dispersione di Hoechst 33342 intensità rispetto all'area di Hoechst 33342 sulle scale biesponenziale. Questo grafico può essere utilizzato per cancello fuori Hoechst 33342 oggetti positivi che sono o troppo piccolo o troppo grande per essere umano delle cellule dello sperma.
- Creare un grafico a dispersione di FITC-PSA intensità e PI intensità sulle scale biesponenziale. Questo grafico può essere utilizzato per valutare la quantità di acrosomiale ha reagito spermatozoi mediante uso di un cancello di quadrante che separa i gruppi di quattro sulla trama (Figura 3): 1) un PI positivo e il gruppo positivo FITC-PSA: acrosomiale ha reagito spermatozoi non vitali; 2) un PI negativo e positivo gruppo FITC-PSA: acrosomiale ha reagito spermatozoi vitali; 3) un PI positive e FITC-PSA negative gruppo: acrosomiale intatte spermatozoi non vitali; e 4) un PI negativo e FITC-PSA negative gruppo: acrosomiale intatte spermatozoi vitali.
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Representative Results
Rappresentante risultati da un esperimento per verificare l'effetto di 4 composti (A, B, C e D) unitamente ad una positiva (progesterone) e un controllo negativo (buffer) sulla [Ca2 +]i in sperma umano utilizzando la velocità media effettiva Ca2 +-segnalazione dosaggio può essere visto in Figura 4a. In Figura 4b, viene visualizzata una curva dose-risposta di progesterone, che è stato derivato da picco ΔF/F0 (%) dati indotti da concentrazioni in serie diluite di progesterone, testato in un altro esperimento utilizzando la velocità media effettiva Ca2 +-saggio di segnalazione. L'analisi dei dati di Ca2 +-segnalazione di analisi è spiegato nel passaggio 5. Risultati rappresentativi da un esperimento test l'induzione della reazione acrosomiale in cellule spermatozoi capacitate umane utilizzando un controllo negativo (DMSO) o i due controlli positivi (progesterone e ionomicina) sul reazione acrosomiale medio-rendimento dosaggio può essere visto nel pannello superiore della Figura 3. Grafici a dispersione quadrante gated dalle 3 condizioni di prova sono visti. L'analisi dei dati di reazione acrosomiale è spiegato nel passaggio 7.
Tabella 1: soluzioni per la preparazione di HTF di riserva + . Soluzioni di riserva possono essere conservate e riutilizzate per lunghi periodi di tempo, glucosio e HEPES a-20 ° C e le altre soluzioni di riserva a temperatura ambiente. Assicurarsi che tutte le soluzioni sono completamente sciolto e ben mescolate prima dell'uso.
Tabella 2: preparazione di HTF + con 4 o 25 mM HCO 3 - dalle soluzioni di riserva di sali (preparati in tabella 1). Na-lattato possa essere aggiunti come sciroppo, 60% (w/w), o in polvere. NaHCO3 viene aggiunto come polvere.
Figura 1: purificazione di Swim-up degli spermatozoi motili umani. A sinistra: Tubo con il preparato HTF+ e un'aliquota del campione di sperma liquefatto pipettati sotto il preparato HTF+ . A destra: Dopo 1 h di semi-sommerso a 37 ° C, spermatozoi motili hanno nuotato fino nel mezzo di HTF+ . Spermatozoi immotile e morti, come pure delle cellule dello sperma rimangono nello sperma sotto il preparato HTF+ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del medio-rendimento Ca2 +-saggio di segnalazione. (un) delle cellule dello sperma sono caricati con Ca2 +-sensibile fluoroforo, lavato e aliquote sono placcate dei pozzetti di una piastra a 384 pozzetti. piastra 384 pozzetti (b) è posizionata in un lettore di fluorescenza a 30 ° C. (c), fluorescenza viene registrato prima e dopo l'aggiunta di composti, controllo positivo (progesterone) ed il controllo negativo (buffer con veicolo). Letture in ΔF/F0 (%) dopo l'aggiunta (frecce) del controllo negativo e positivo sono illustrati nella parte inferiore del (c). Illustrazione utilizzati con il permesso da Christian Schiffer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: valutazione della reazione acrosomiale mediante citometria a image. (Pannello superiore) Quadrante gated dispersione da un controllo del veicolo negativo (DMSO) e i controlli positivi progesterone (Prog, 10 µM) e ionomicina (Iono, 2 µM). Un incremento nelle cellule nel quadrante inferiore destro (acrosomiale reagito cellule vitali) è visto quando si confrontano i controlli positivi per il controllo di DMSO. (Pannello inferiore) Immagini al microscopio delle cellule dello sperma fluorescente identificate, comprese le cellule da tutti i gruppi di quattro. BF = campo chiaro, Hoechst = Hoechst-33342, PSA = Pisum Sativum agglutinina, PI = ioduro di propidio. Barra della scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da Egeberg Palme et al 20187. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di dati da Ca2 +- fluorimetria. (un) [Ca2 +]i cambiamenti indotti da controllo negativo, progesterone e compound A, B, C e D. (b) curva dose-risposta di Progesterone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La velocità effettiva media Ca2 + segnalazione di analisi è basata sulla misura della fluorescenza da singoli pozzetti ogni contenente circa 250.000 cellule dello sperma. Il segnale acquisito è in media da tutte le singole celle di sperma nel pozzo. Il dosaggio fornisce così che non spaziali informazioni su dove in particolare la cellula dello sperma [Ca2 +]i sono modificati, in quanto grande una proporzione delle cellule dello sperma avviene un cambiamento in [Ca2 +]i , o come eterogenei è la risposta tra le singole celle. Per ottenere tali informazioni, esperimenti con risoluzione di singola cellula (ad es., come descritto in50,52) devono essere impiegati. Un altro inconveniente della tecnica è la risoluzione temporale, che è nell'ordine di secondi. Anche se i campioni di sperma 50 µ l sono ben miscelati quando 25 µ l delle soluzioni vengono aggiunti, le misurazioni possono essere avviate in primo luogo dopo il cassetto con la piastra multi-pozzetto è tornato all'interno del lettore di piastra di fluorescenza. Per ottenere maggiore risoluzione temporale, è indispensabile impiegare altre tecniche (per esempio, un flusso interrotto fluorimetria13,50). Il vantaggio del medio-rendimento Ca2 +-dosaggio, rispetto ai metodi di cella singola o singolo-pozzo di segnalazione è che la misura simultanea di più pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre permette facile e veloce test di più side-by-side con controlli positivi e negativi di composti (Figura 4)1,2, facile generazione di curve dose-risposta di singoli composti (Figura 4)1,2,3 , 4 , 5, valutazione di additività1,2 e sinergismo3 per due o più composti, così come gli studi del modo di azione degli esperimenti di inibizione competitiva anche se composti e l'uso di specifici inibitori farmacologici (ad es., CatSper inibitori1,2,3,4,5). Inoltre, modificando il fluoroforo, il dosaggio può essere impiegato per esaminare altri cambiamenti intracellulari (ad es., pHi1,2). Infine, più di un fluoroforo può essere utilizzato contemporaneamente per misurare simultaneamente molteplici cambiamenti intracellulari. In futuro, la velocità media effettiva Ca2 +-segnalazione dosaggio potrebbe essere usato per composti di schermo di interesse per effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano (ad esempio, prodotti chimici ambientali o candidati farmaci) per esaminare il potenziale negativo effetti sulla funzione delle cellule dello sperma umano, o per indagare su un possibile ruolo come contraccettivo.
L'analisi di reazione acrosomiale medio-velocità di trasmissione è basato su immagine cytometry, che costituisce un sostituto attraente per valutare la reazione acrosomiale umano rispetto alla valutazione manuale utilizzando un microscopio a fluorescenza. Pattern di colorazione di acrosomes intatto o reagendo/ha reagito non sono sempre chiari, e una grande variazione intra-individuale può essere la conseguenza del presente documento. Con immagine cytometry, immagini sono acquisiti e analizzati automaticamente. Il canale di mascheramento, in questo caso Hoechst-33342, definisce le cellule e solo i segnali fluorescenti da questi settori specifici sono inclusi nell'analisi dei dati. Quindi, la colorazione dei corpi enucleated che contengono citoplasma residuo non è incluso nell'analisi dei dati. Inoltre, le statistiche di conteggio sono superiore alla microscopia a fluorescenza. Per contare 200 cellule attraverso gli oculari del microscopio è un compito impegnativo e dispendioso ma con immagine cytometry l'analisi di almeno 5.000 cellule richiede meno di pochi minuti. Tuttavia, dovuto l'ingrandimento basso del citometro immagine, la capacità di valutare le misure viene persa e uno dovrà portare il campione macchiato per il microscopio a fluorescenza. Pertanto, l'inclusione dei controlli è di fondamentale importanza per convalidare le misurazioni. Se i controlli non reagiscono come previsto, i risultati da un esperimento devono essere eliminati. Il protocollo descritto qui è stato ispirato dal lavoro svolto da Zoppino et al.49, che valutati reazione acrosomiale umana tramite flusso cytometry. Hanno ulteriormente descritto da microscopia di fluorescenza del tempo reale come PSA entra il vano acrosomiale quando i pori della membrana-fusione appaiono all'induzione della reazione acrosomiale. Una volta all'interno del vano acrosomiale, PSA zoccoli e costituisce un segno stabile per lunghi periodi di tempo. Nessuna fissazione o permeabilizzazione viene applicato nel protocollo e pertanto l'interpretazione del risultato è chiaro: PSA all'interno del vano acrosomale di uno spermatozoo vitale è uguale a reazione acrosomiale. Per quanto riguarda il Ca2 +-segnalazione test, il test di reazione acrosomiale potrebbe essere utilizzato anche per valutare le curve dose-risposta, inibizione, additività e sinergismo di composti di interesse. In futuro, l'analisi di reazione acrosomiale medio-rendimento potrebbe anche composti di schermo di interesse per gli effetti su sperma umano di reazione acrosomiale (ad es., prodotti chimici ambientali o candidati farmaci) per esaminare i potenziali effetti negativi su questo umano la funzione delle cellule dello sperma o di indagare un possibile ruolo come contraccettivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori si desidera ringraziare il laboratorio di Timo Strünker per supervisione di AR e DLE durante i loro soggiorni presso il suo laboratorio. Inoltre, vorremmo ringraziare i nostri colleghi presso il dipartimento di crescita e la riproduzione, ospedale universitario di Copenhagen, Rigshospitalet per la loro assistenza con l'impostazione di questi due test. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da parte del fondo per l'innovazione Danimarca (numeri di grant 2010-005-3 e 14-2013-4).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
| 1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
| 1, 4, and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
| 12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
| 384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
| 15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
| A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
| Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
| CaCl2 | |||
| Centrifuge | |||
| Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
| FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
| Glucose anhydrous | |||
| HEPES | |||
| Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
| Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
| Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
| Incubator | |||
| KCl | |||
| KH2PO4 | |||
| Magnetic stirrer | |||
| MgSO4 | |||
| Na-Lactate | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
| Pipettes and piptting tips | |||
| propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
| Purified water | |||
| Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
| S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
| SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
| Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
| Vortexer |
References
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