Biology

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212

Anders Rehfeld^1,2, Dorte Louise Egeberg Palme^1,2, Kristian Almstrup^1,2, Anders Juul^1,2, Niels Erik Skakkebaek^1,2

¹Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, ²International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca^{2 +}de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Abstract

CA^{2 +}-sinalização é essencial para a função celular normal do esperma e a fertilidade masculina. Da mesma forma, a reação do acrossoma é vital para a capacidade de uma célula de esperma humana para penetrar a zona pelúcida e fecundar o óvulo. Portanto, é de grande interesse para testar compostos (por exemplo, produtos químicos ambientais ou candidatos a fármacos) para seu efeito no Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano ou para examinar os potenciais efeitos adversos sobre a função da célula de esperma humano ou para investigar um possível papel como um contraceptivo. Aqui, dois ensaios de rendimento médio são descritos: 1) um ensaio baseado em fluorescência para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}-sinalização no esperma humano e 2) um ensaio de cytometric de imagem para avaliação de Reacção acrossómica no esperma humano. Estes ensaios podem ser usados para um grande número de compostos para efeitos na Ca^{2 +}de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano. Além disso, os ensaios podem ser usados para gerar as curvas dose-resposta altamente específica de compostos individuais, determinar potencial aditividade/sinergismo para dois ou mais compostos e estudar o modo farmacológico de ação através da inibição competitiva experimentos com inibidores de CatSper.

Introduction

O objetivo dos dois ensaios aqui descritos é examinar efeitos na Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano, como foi demonstrado por vários compostos em diversas publicações, empregando estes ensaios¹^,²^, ³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷. CA^{2 +}-sinalização e a reacção acrossómica são função da célula de esperma humano vital ao normal e a fertilidade masculina.

O objectivo geral de uma célula de esperma humano é para fecundar o óvulo. Para ser capaz de com êxito e, naturalmente, fecundar o óvulo, as funções da célula de esperma devem ser reguladas firmemente durante a viagem da célula de esperma através do trato reprodutivo feminino⁸^,⁹. Muitas das funções de células de esperma são regulamentadas através do intracelular Ca^{2 +}-concentração [Ca^{2 +}]_eu (por exemplo, esperma motilidade, quimiotaxia e acrossoma reação)¹⁰. Também, um processo de maturação chamado capacitação, o que torna a célula de esperma capaz de fertilizar o óvulo, é parcialmente regulamentado pelo [Ca^{2 +}]_eu¹⁰. CA^{2 +}-extrusão de Ca^{2 +}-ATPase bombas¹¹ manter um Ca dobra aproximadamente 20.000^{2 +}-gradiente ao longo da membrana da célula de esperma humano, com um descanso [Ca^{2 +}]_eu de 50-100 nM. Se Ca^{2 +} é permitido atravessar a membrana celular (por exemplo, através da abertura de Ca^{2 +}-canais), ocorre um afluxo considerável de Ca^{2 +} , dando origem a uma altitude de [Ca^{2 +}]_eu. No entanto, o espermatozoide que carrega também intracelular Ca^{2 +}-lojas, que podem liberar Ca^{2 +} e, portanto, também dá-se uma elevação de [Ca^{2 +}]_i¹². Curiosamente, todos mediada por canal Ca^{2 +}-influxo em células de esperma humanas até agora foi encontrado para ocorrer através de CatSper (gatocanal iônico de Sperm), que só é expressa em células de esperma¹¹. Nas células de esperma humanas, CatSper é ativado pela progesterona ligantes endógenos e prostaglandinas através de distinta ligand binding sites¹³^,¹⁴^,¹⁵, levando a uma rápida Ca^{2 +}-afluxo em a célula de esperma. Duas fontes principais perto do ovo fornecem altos níveis destes ligantes endógenos. Um é o fluido folicular que contém altos níveis de progesterona¹⁶. O fluido folicular é liberado do folículo maduro juntamente com o óvulo na ovulação e se mistura com o fluido dentro os ovidutos¹⁷. A outra fonte principal é as células do cumulus que cercam o ovo e liberar a altos níveis de progesterona e prostaglandinas. A progesterona induzida por Ca^{2 +}-influxo nas células de esperma tem sido mostrado para mediar a quimiotaxia para o ovo de⁹^,¹⁸, controlar esperma motilidade¹⁹^,²⁰ e estimular a acrossoma reação de²¹. Acionamento destes individuais [Ca^{2 +}]_eu-funções de esperma regulamentado na ordem correta e no momento correto é crucial para a fertilização do ovo⁸. Dessa forma, uma qualidade inferior induzida pela progesterona Ca^{2 +}-influxo foi encontrado ser associado com reduzida fertilidade masculina²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶ ^,,²⁷^,²⁸^,²⁹ e CatSper funcional é essencial para a fertilidade masculina²⁶^,³⁰^,³¹^,³²^, ³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶.

Como as células de esperma alcançar o ovo, uma sequência de eventos deve ocorrer para fertilização ocorra: 1) as células de esperma deve penetrar a camada de células cumulus circundante, 2) ligar a zona pelúcida, 3) exocytose o conteúdo acrossomal, a reação do acrossoma chamados ³⁷, 4) penetrar a zona pelúcida e 5) se fundem com a membrana do ovo para completar a fertilização³⁸. Para ser capaz de passar por estas etapas e fecundar o óvulo, o espermatozoide que primeiro devem ser submetidos a capacitação¹¹, que começa como as células de esperma sair o líquido seminal que contém "decapacitating" fatores³⁹ e nadam para os fluidos da fêmea trato reprodutivo com altos níveis de bicarbonato e albumina³⁷. Capacitação processa as células de esperma capazes de submeter-se hyperactivation, uma forma de mobilidade com uma surra vigorosa do flagelo e de reação do acrossoma³⁷. Hiperactivos motilidade é necessária para a penetração da zona pelúcida⁴⁰, e a acrossoma contém várias enzimas hidrolíticas que auxiliam neste processo de penetração⁴¹. Além disso, a reacção acrossómica processa os espermatozoides capazes de fundir-se com o ovo, expondo-as proteínas específicas da membrana na superfície de esperma necessária para a fusão de esperma-ovo⁴². Consequentemente, a capacidade de sofrer reação hyperactivation e acrossoma são ambos necessários para uma fecundação bem sucedida do ovo⁴⁰^,⁴². Ao contrário do que tem sido visto por rato espermatozoides⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵, apenas humanos espermatozoides que são acrossoma intacto pode ligar para a zona pelúcida⁴⁶. Quando as células de esperma humanas são vinculadas a zona pelúcida têm que submeter-se a reacção acrossómica tanto para penetrar a zona pelúcida⁴¹ e expor as proteínas de membrana específicos que são necessários para a fusão com o ovo,³⁸. O momento da reacção acrossómica no esperma humano, portanto, é fundamental para fertilização ocorra.

Conforme descrito acima, Ca^{2 +}-sinalização é vital para a célula de esperma normal função⁸, e é, portanto, de grande interesse para ser capaz de grandes números de tela de compostos para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização em células de esperma humanas. Da mesma forma, como células de esperma humanas só que se submetem a reacção acrossómica no momento certo e no lugar pode penetrar a zona pelúcida e fertilizar o ovo⁴⁶^,⁴⁷, é também de grande interesse para poder testar compostos por sua capacidade de afecta a reacção acrossómica no esperma humano. Para este fim, são descritos dois ensaios de rastreio com throughput médio: 1) um ensaio para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização em células de esperma humanas e 2) um ensaio para a capacidade de induzir a reacção acrossómica em células de esperma humanas.

Ensaio 1 é médio-taxa de transferência Ca^{2 +}-ensaio de sinalização. Esta técnica de baseado no leitor de placa de fluorescência monitora alterações em fluorescência em função do tempo simultaneamente em vários poços. O Ca^{2 +}-tintura fluorescente sensível, Fluo-4 tem um K_d de Ca^{2 +}≈ 335 nM e é célula-permeant sob a forma de éster de AM (acetoximetil). Usando Fluo-4, é possível medir mudanças na [Ca^{2 +}]_i, ao longo do tempo e após a adição de compostos de interesse para as células de esperma. O ensaio foi desenvolvido pelo laboratório de Timo Strünker em 2011¹³ e desde então tem sido utilizado em diversos estudos para compostos de tela para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização no esperma humano¹^,²^,³^, ⁴^,⁵. Também utilizou-se um método semelhante para a tela de múltiplas drogas candidatos⁴⁸. Além disso, este ensaio também é útil para avaliar o modo farmacológico de ação¹^,²^,³^,⁴^,⁵, de curvas dose-resposta¹^, ²^,³^,⁴^,⁵, inibição competitiva¹^,², aditividade¹^,²e sinergismo³ de compostos de interesse.

Ensaio 2 é um ensaio de reação do acrossoma médio-taxa de transferência. Esta técnica de imagem baseada em citômetro mede a quantidade de viável acrossoma reagiu espermatozoides em uma amostra, usando três corantes fluorescentes: iodeto de propidium (PI), FITC-acoplado lectina de Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. O ensaio foi modificado de um método similar de baseados em citometria de fluxo por Zoppino et al.⁴⁹ e tem sido utilizado em diversos estudos⁶^,⁷. Quanto ao Ca^{2 +}-sinalização ensaio, este ensaio de reação do acrossoma também poderia ser utilizado para avaliar as curvas dose-resposta, inibição, aditividade e sinergismo de compostos de interesse.

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Protocol

A recolha e análise de amostras de sêmen humano nos protocolos segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa da região Capital da Dinamarca. Todas as amostras de sêmen foram obtidas após consentimento informado de doadores voluntários. Após o parto, as amostras foram totalmente anónimos. Por sua inconveniência cada doador recebeu uma taxa de 500 coroas dinamarquesas (cerca US $75 dólares americanos) por amostra. As amostras foram analisadas no dia da entrega e então destruídas imediatamente após os experimentos de laboratório.

Nota: O rendimento médio Ca^{2 +}-sinalização ensaio é descrito em etapas 4-5 e o ensaio de reação do acrossoma caudal médio em passos 6-7. O protocolo para preparar meio fluido Tubário humano (HTF⁺) é descrito na etapa 1 e a purificação dos espermatozoides para os ensaios é descrita nos passos 2-3.

1. preparação do meio fluído Tubário humano (HTF⁺)

Nota: Uso de balões volumétricos de tamanhos adequados, um 1L de medição cilindro, um agitador magnético, sais conforme listado na tabela 1 e tabela 2, água purificada, um 0,2 µm poro filtro e tubos de plástico de 50 mL.

Prepare as soluções de sais em água purificada (tabela 1).
1. Adicione a quantidade de sal, listado na tabela 1 , para um balão volumétrico de tamanho apropriado, adicionar água purificada para um pouco abaixo o volume desejado e misture bem, utilizando um agitador magnético.
2. Quando o sal é totalmente dissolvido, remova o ímã e encha com água filtrada até o volume final desejado.
Transferir a solução para um frasco e armazenar até o uso.
Nota: As soluções podem ser mantidas e reutilizadas por longos períodos de tempo: glicose e HEPES a-20 ° C e as outras soluções estoque à temperatura ambiente (RT).
Prepare 1 L de meio HTF⁺ de soluções estoque (tabela 2).
1. Certifique-se de que todas as soluções estoque são completamente dissolvidas e bem misturadas antes do uso.
2. Adicione a quantidade de solução-mãe e listados na tabela 2 para uma L 1 cilindro de medição de sal e adicione água purificada para 900 mL.
3. Misturar bem utilizando um agitador magnético e ajustar o pH a 7,35 com solução de NaOH.
4. Remover o Magneto e adicionar água filtrada até 1.000 mL.
Meio HTF⁺ de filtrado estéril através um 0,2 µm poro filtro alíquota HTF⁺ , médio, para tubos de plástico de 50 mL e a loja a 4 ° C até o uso.
Apenas antes de executar um experimento, adicione µ l 165 de at-piruvato para a alíquota de 50 mL, para obter uma concentração final de at-piruvato de 0,33 mM.
Nota: Meio fluido Tubário humano também pode ser obtido de diversos fornecedores comerciais. Quando usando o meio de₃^– HCO 4mm, amostras podem ser incubadas com tampas fechadas na incubadora sem extra de CO₂ no ar sem grandes desvios do pH. Se numa incubadora de CO₂ está disponível, a quantidade correspondente de CO₂ pode ser calculada utilizando a equação de Henderson-Hasselbalch e usado. Se usando o meio de₃^– de HCO de 25 mM, as amostras devem ser incubadas com tampas abertas numa incubadora de CO₂ com ar, contendo uma quantidade correspondente de CO₂ (depende da pressão atmosférica, geralmente entre 5-10%) para evitar uma deriva em pH. A quantidade exata de CO₂ pode ser calculada utilizando a equação de Henderson-Hasselbalch.

2. purificação de células de esperma Motile através de submerso (Figura 1)

Nota: Use um recipiente plástico de boca larga limpo para a amostra de sêmen, uma incubadora, tubos plásticos de 50 mL, um rack para colocação de tubos plásticos de 50 mL em um ângulo de 45°, meio HTF⁺ (preparado no passo 1 ou obtido de provedor comercial), uma centrífuga e soro humano albumina (HSA).

Obter uma amostra de sêmen humano doado recentemente produzido através da masturbação e ejaculado em um recipiente de plástico limpo de boca larga. Utilize apenas amostras de sêmen que cumprir os parâmetros estabelecidos pelo manual de laboratório do WHO para análise e processamento de sêmen humano.
Incube a amostra a 37 ° C por 15-30 min para permiti-lo para liquefazer.
Aqueça 50 mL de meio HTF⁺ com 4mm HCO₃^– a 37 ° C.
Lugar limpar tubos plásticos de 50 mL em um rack em um ângulo de 45° (para aumentar a área de superfície entre líquidos). Use 1 tubo por mL de sêmen cru.
Adicione 4 mL de meio de pré-aquecido HTF⁺ a cada um dos tubos.
Cuidadosamente, pipete 1 mL da amostra do esperma liquido no fundo de cada tubo contendo 4 mL de pré-aquecido HTF⁺. Evite a liberação de bolhas de ar.
Feche as tampas e incubar os tubos a 37º C por 1h.
Delicadamente, Aspire e transferir tanto da fração superior (HTF⁺ com células de esperma motile) possível para um novo tubo plástico de 15 mL, prestando atenção que nada da fracção inferior (sêmen com células mortas e fixa) está incluído. Geralmente, é seguro transferir 3,5 mL da fração superior, sem perturbar a fração inferior. Para evitar a turbulência da sucção, corte a ultraperiférica 1-2 mm da ponta da pipeta em um ângulo de 45° para obter uma maior abertura.
Encha o tubo plástico de 15 mL com HTF⁺ de células de lavar e centrifugar o tubo a 700 x g durante 10 minutos a RT
Delicadamente, aspirar e remover o sobrenadante e ressuspender o espermatozoide em 2 mL de HTF⁺.
Transferência de 20 µ l de suspensão de esperma para dois tubos de plástico pequenos para avaliação da concentração de espermatozoides (ver passo 3).
Encha o tubo plástico de 15 mL com HTF⁺ de células de lavar e centrifugar o tubo a 700 x g durante 10 minutos a RT
Delicadamente, aspirar e remover o sobrenadante e ressuspender o espermatozoide de 10 x 10⁶ células/mL (baseada-se a concentração de células avaliada na etapa 2.11).
1. Para experimentos usando un-capacitados espermatozoides (rotina Ca^{2 +}-ensaio de sinalização)
  1. Ressuspender as células em HTF⁺ com 4mm HCO₃^–.
  2. Adicione 30 µ l de albumina de soro humano (HSA) (100mg/mL) por mL HTF⁺ para obter uma concentração final de 3 mg/mL.
  3. Feche as tampas e incube por ≥ 1 h a 37 ° C.
2. Para experimentos usando capacitada espermatozoides (ensaio de reação do acrossoma)
  1. Ressuspender as células em HTF⁺ com 25mm HCO₃^–.
  2. Adicione 30 µ l de HSA (100mg/mL) por mL HTF⁺ para obter uma concentração final de 3 mg/mL.
  3. Prenda as tampas frouxamente e incubar ≥3 horas a 37 ° C, com a correspondente quantidade de CO₂ (consulte a etapa 1, geralmente entre 5-10% CO₂).

3. a contagem de espermatozoides

Nota: Espermatozoides podem também ser contadas manualmente⁵⁰ ou usando uma imagem citômetro⁵¹, conforme descrito aqui. Use um citômetro de imagem, um reaccional, S100 reserva, um SP1-gaveta, submerso purificado espermatozoides (preparados na etapa 2).

Dilua uma alíquota para um fator de 10, 20, 30, 50 ou 90 no S100 buffer usando um tubo de 2 mL de fundo redondo de acordo com a concentração esperada (avaliada pela inspeção manual da pelota em passo 2.10) 20 µ l. Uso a diluição mais próximo à concentração esperado (ou seja, se uma concentração de 15 x 10⁶ espermatozoides / mL após submerso é esperado, então, diluir a amostra de esperma 20 µ l com 380 µ l de tampão S100 [fator de diluição 20]).
Misture bem para 10 s usando um misturador do vortex o máximo 700 rpm, imergir a amostra com o SP1-gaveta e pressione o êmbolo branco totalmente até aspirado uma alíquota da amostra na gaveta.
Abra o citômetro de imagem, coloque a fita na bandeja e executar o ensaio de Contagem de PI manchado humana espermatozoides do ensaio de acordo com o fator de diluição aplicada (escolhida na etapa 3.1).
Repita o passo 3.1-3.3 com outra 20 µ l da amostra, usando um fator de diluição mais próximo para a concentração medida obtida a partir do primeiro 20 µ l da amostra.
Calcule a concentração média de espermatozoide de duas medições.
Multiplicar significa esperma concentração celular com o volume original para obter a contagem de células de esperma total (na etapa 2, este volume original é de 2 mL).

4. medição de mudanças na livre intracelular de Ca^{2 +}-concentração ([Ca^{2 +}]_eu) usando Ca^{2 +}- fluorimetria (Figura 2)

Nota: Use um leitor de placas fluorescência, 384 placas multi bem, Fluo-4 AM, submerso espermatozoides purificados (preparado no passo 2), compostos de interesse como uma pipeta de 12 canais, uma pipeta automática repetidor e controles bem como positivos e negativos.

Preparar um 2mm Fluo-4 estoque AM adicionando 22,7 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) para um frasco de 50 µ g Fluo-4 AM e misture o tubo bem.
Adicione uma alíquota de suspensão de espermatozoides recuperados submerso 700 µ l (capacitada ou un-capacitada como descrito na etapa 2) para um novo tubo de ensaio. 700 µ l de amostra de esperma é o montante necessário para analisar uma linha de 24 poços da placa de 384-microplacas (usado para testar 3 controles e 9 compostos em Parelhas).
Adicionar 3,5 µ l de Fluo-4 solução estoque de AM para a 700 µ l de suspensão de esperma para obter uma concentração final de 10 µM Fluo-4 estou.
Incube a amostra por 45 min a 37 ° C, protegido da luz.
Centrifugar a amostra a 700 x g durante 10 minutos, aspirar e desprezar o sobrenadante para remover o excesso de Fluo-4.
Resuspenda o pellet manchada no HTF⁺ a 5 x 10⁶ células/mL (ou seja,, uso 2 x o volume da suspensão de células tomada na etapa 4.2)
Prepare diluições de compostos e controles (pode ser feito durante os períodos de incubação e centrifugação na etapa 4.4 e 4.5, respectivamente).
1. Dilua os compostos, bem como um controle negativo (buffer com veículo) e um controle positivo (progesterona) no HTF⁺. Dilua os compostos e controles para 3 x a concentração final desejada, como eles são diluídos 1:3, quando eles são adicionados para as células de esperma na etapa 4.16.
2. Coloque os tubos com diluições em um rack com uma distância entre tubos correspondentes à distância entre as pontas de pipeta da pipeta 12 canais usado na etapa 4.16.
Use uma pipeta automática repetidor (24 passos de 50 µ l).
1. Mix Fluo-4 manchado a amostra de esperma suavemente pipetando a totalidade do montante acima e para baixo uma vez.
2. Adicione alíquotas de 50 µ l de 24 poços de uma linha na placa de microplacas-384.
Coloque a placa de micropoços em um leitor de placa de fluorescência a 30 ° C e fechar a gaveta.
Seleccione o protocolo apropriado para Fluo-4. Excitar a fluorescência a 480 nm e emissão recorde em 520 nm. Use o mais rápido possível de tempo de ciclo com a configuração.
Nota: Use pelo menos 10 flashes por óptica bem e fundo, se possível.
Selecionar um poço na linha e ajustar o ganho de um valor-alvo de 20%.
Inicie a medição.
Controle da linha de base durante os 5 primeiros ciclos.
1. Se a leitura fluorescente está aumentando ou diminuindo com o tempo, parar o experimento, reajustar o ganho e recomeçar a experiência.
2. Se a linha de base difere muito entre poços individuais em uma linha, ou a pipetagem na etapa 4.8 tem sido imprecisa ou a amostra não foi misturada bem o suficiente antes de pipetagem. Descarte o experimento.
3. Se a leitura fluorescente é comparável entre os poços na linha e constante durante os 5 primeiros ciclos, continue para a próxima etapa.
Após 10 ciclos (usados para a linha de base), pausar o experimento.
Ejete a gaveta com a placa de micropoços.
Utilizando uma pipeta de 12 canais (2 passos de 25 µ l), rapidamente adicionar 25 µ l das soluções preparadas de compostos e controles (da etapa 4.7) para as 12 duplicatas bem (24 poços) de uma linha. Soluções será diluída 1:3, como os poços já contenham 50 µ l de amostra de esperma manchada.
Continue a medição tão rapidamente quanto possível (gaveta fechará automaticamente) para evitar perder quaisquer sinais fluorescentes induzidas pelos compostos adicionados e controles. Alterações na fluorescência (ΔF) após a adição de compostos e controles agora será capturada.
Execute o experimento até sinais fluorescentes foram registrados de controlo positivo e os compostos de interesse.
Parar o experimento e exportar os dados brutos da fluorescência para analisá-lo como na etapa 5.
Nota: Geralmente Fluo-4 AM tem sido usado como o Ca^{2 +}-sensível fluoróforo no ensaio, mas outros Ca^{2 +}-fluorophores sensível também pode ser usada se excitação e espectros de emissão se ajustam com filtros no leitor de placa de fluorescência. Dependendo da escolha de fluoróforo, certifique-se que o nível de ganho é definido em um nível "seguro", onde os picos fluorescentes induzidos estão dentro do intervalo de medição do instrumento. Isto pode ser testado pela adição de ionomycin para um único poço de uma configuração específica de ganho. Se isto induziu um sinal fluorescente acima do limiar, abaixe o ganho e tente novamente. Alguns usam Pluronic F-127 para auxiliar o carregamento de Fluo-4¹^,¹³, mas verificou que este não é necessário². O número máximo de linhas medido simultaneamente depende de dois fatores. 1) o tempo de ciclo do instrumento: se o tempo de ciclo é muito longo, picos induzidos em [Ca^{2 +}]_eu podem ser perdidos. Medir um máximo de duas linhas ao mesmo tempo para manter o tempo de ciclo de baixa; 2) a velocidade de pipetagem na etapa 4.16: usando a pipeta de 12 canais, é possível adicionar rapidamente 12 diferentes soluções aos 12 poços duplicados (24 poços) de 1 ou 2 linhas (por exemplo, uma linha pré-incubadas com o veículo e uma linha pré-incubados com um inibidor) , sem perder os Ca^{2 +} picos induzidos. No entanto, não é aconselhável tentar adicionar 24 diferentes soluções para duas linhas para medição simultânea, como dicas de pipetagem terá de ser substituído entre as duas etapas sequenciais pipetagem, pelo qual induzida por Ca^{2 +} picos poderiam ser perdidos.

5. análise de dados de Ca^{2 +}- fluorimetria

Abra os dados brutos de fluorescência obtidos e exportado na etapa 4.
Calcule a média dos poços duplicados. Se existem grandes diferenças entre duplicatas, descarte dados de poços específicos.
Defina linha de base como os 10 primeiros ciclos.
Calcular ΔF/F₀ (%) como a porcentagem mudar na fluorescência (ΔF) ao longo do tempo após a adição de compostos e controles em relação a média basal da fluorescência (F₀) durante os 10 primeiros ciclos (linha de base).
Se usar os dados para geração de curvas dose-resposta, subtrai a leitura do controlo negativo dos poços, para remover artefatos de pipetagem.

6. medida da reacção acrossómica

Nota: Use um citômetro de imagem, uma incubadora, corantes fluorescentes: PI, FITC-PSA e Hoechst 33342-, compostos de interesse, bem como controles positivos e negativos, uma imobiliza solução contendo 0,6 M NaHCO₃ e formol 0,37% (v/v) em água destilada, um slide de A2 e capacitados submerso purificadas espermatozoides (preparados na etapa 2).

Preparar uma solução de coloração contendo PI (5 µ g/mL), FITC-PSA (50 µ g/mL) e Hoechst 33342 (100 µ g/mL) no HTF⁺, misturar bem utilizando um misturador do vortex e protegê-lo contra a luz até o uso.
Prepare soluções de compostos e controles em 10 x a concentração final desejada, como eles são diluídos 01:10 etapa 6.5. Sempre inclua um controle negativo (veículo) e dois controles positivos: concentração final de progesterona 10 µM e a concentração final de ionomycin 2 µM.
Transferi alíquotas de 240 µ l de células de esperma capacitadas (preparado na etapa 2) para tubos de plástico.
Adicione 30 µ l de solução para cada tubo de coloração. Concentração final de manchas será: 0,5 µ g/mL PI, FITC-PSA de 5 µ g/mL e 10 µ g/mL Hoechst 33342.
Adicionar 30 µ l de soluções com controles ou compostos para cada tubo (01:10 diluição).
Misture delicadamente as amostras pipetando e descer algumas vezes ou num Vortex suave. Devido ao estresse mecânico, evite excesso de mistura.
Incube a 37 ° C por 30 min.
Prepare novos tubos de plástico com 100 µ l de uma solução de imobiliza contendo 0,6 M NaHCO₃ e formol 0,37% (v/v) em água destilada, um por um tubo de ensaio.
Após a incubação, misturar as amostras bem pipetando e adicionar 50 µ l da amostra para um tubo com 100 µ l de solução de imobiliza.
Antes de carregar as câmaras de um slide de A2, misture a amostra bem pipetando. Encha as câmaras cuidadosamente com aproximadamente 30 µ l sem criar bolhas de ar.
Nota: Durante a incubação, as células de esperma motile tendem a agregar. Aglomerados de células podem perturbar as medições (mesmo que eles são excluídos). Portanto, a mistura pipetando após incubação é muito importante. Da mesma forma, as bolhas de ar nas câmaras podem perturbar as medições. Portanto, encha a câmara lentamente e mudar o ângulo da pipeta, se as bordas do líquido estão prestes a conhecer e criar uma bolha de ar.
Coloque o slide carregado na bandeja do citômetro de imagem e fechar a bandeja.
Selecione o protocolo FlexiCyte e tiragem.
1. Escolha as configurações a seguir para o protocolo de FlexiCyte: número de canais analíticas: 2; Canal de mascaramento: UV (LED365), este é o canal usado para segmentação de imagens; Canal 1: Azul (LED475), tempo de exposição 3.000 ms, filtro de emissão 560/35; Canal 2: Verde (LED530), exposição tempo 500 ms, filtro de emissão 675/75; Número mínimo de células analisadas: 5000; Excluir células agregadas: Sim.
Repita a etapa 6,9-6.12 até que todas as amostras foram medidas.

7. análise de dados de imagem citometria

Aberto dados obtidos na etapa 6.
Crie as duas parcelas seguintes para avaliar as medidas.
1. Crie um gráfico de dispersão da Hoechst 33342 intensidade vs Hoechst 33342 área em escalas biexponential. Este plano pode ser usado para portão Hoechst 33342 objetos positivos que são também muito pequeno ou muito grande para ser células de esperma humanas.
2. Crie um gráfico de dispersão de intensidade FITC-PSA e intensidade de PI em escalas biexponential. Este plano pode ser usado para avaliar a quantidade de acrossoma reagiu espermatozoides pelo uso de uma porta de quadrante que separa os quatro grupos sobre o enredo (Figura 3): 1) uma PI positivo e grupo positivo FITC-PSA: acrossoma reagiu espermatozoides viáveis; 2) um PI negativo e positivo grupo FITC-PSA: acrossoma reagiu espermatozoides viáveis; 3) um PI positivo e FITC-PSA negativo Grupo: acrossoma intactos espermatozoides viáveis; e 4) grupo de negativo de um PI negativo e FITC-PSA: acrossoma intactas células de esperma viáveis.

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Representative Results

Representante resulta de uma experiência para testar o efeito de 4 compostos de (A, B, C e D) juntamente com um positivo (progesterona) e negativo (tampão) na [Ca^{2 +}]_i no esperma humano usando médio-taxa de transferência Ca^{2 +}-sinalização ensaio pode ser visto na figura 4a. Na figura 4b, uma curva de resposta de dose de progesterona é mostrada, que foi derivado de pico ΔF/F₀ (%) dados induzidos por serialmente diluídas concentrações de progesterona, testado em outro experimento usando médio-taxa de transferência Ca^{2 +}-ensaio de sinalização. A análise dos dados do Ca^{2 +}-sinalização ensaio é explicado no passo 5. Resultados representativos de um experimento para testar a indução de Reacção acrossómica em células de esperma humanas capacitadas usando um controle negativo (DMSO) ou os dois controles positivos (progesterona e ionomycin) na reação médio-produção acrossoma do ensaio pode ser visto no painel superior da Figura 3. Gráficos de dispersão quadrante condomínio fechado das 3 condições de teste são vistos. A análise dos dados de reação do acrossoma é explicada no passo 7.

Tabela 1: estoque de soluções para a preparação de HTF ⁺ . As soluções podem ser mantidas e reutilizadas por longos períodos de tempo, glicose e HEPES a-20 ° C e as outras soluções estoque à temperatura ambiente. Certifique-se de que todas as soluções são completamente dissolvidas e bem misturadas antes do uso.

Tabela 2: preparação do HTF ⁺ com 4 ou 25 mM HCO ₃ ^- de estoque soluções de sais (preparados na tabela 1). At-lactato pode ser adicionado como xarope, 60% (w/w), ou em pó. NaHCO₃é adicionado como pó.

Figura 1: purificação submerso de células humanas de esperma motile. Esquerda: Tubo com meio HTF⁺ e uma alíquota da amostra de esperma liquido pipetado abaixo o meio HTF⁺ . Direita: Após 1 h de submerso a 37 ° C, as células de esperma motile ter nadado até no meio de HTF⁺ . Espermatozoides mortos e fixa, bem como não-espermatozoides permanecem no sêmen abaixo o meio HTF⁺ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama do rendimento médio Ca^{2 +}-ensaio de sinalização. (um) células de esperma são carregados com uma Ca^{2 +}-fluoróforo sensível, lavado e alíquotas são banhadas aos poços de uma placa de 384. (b) 384-placa é posicionada em um leitor de placa de fluorescência a 30 ° C. (c), fluorescência é gravado antes e depois da adição de compostos, controle positivo (progesterona) e o controlo negativo (buffer com veículo). Leituras em ΔF/F₀ (%) depois da adição (setas) do controle negativo e positivo estão ilustradas na parte inferior da (c). Ilustração usada com permissão do Christian Schiffer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: avaliação de Reacção acrossómica usando citometria de imagem. (Painel superior) Condomínio fechado de quadrante dispersão plota de um controle de veículo negativo (DMSO) e a progesterona controlos positivos (Prog, 10 µM) e ionomycin (Iono, 2 µM). Um incremento nas células no quadrante inferior direito (células viáveis de Reacção acrossómica) é visto quando comparando os controles positivos para o controle de DMSO. (Painel inferior) Imagens microscópicas de espermatozoides fluorescente etiquetadas, incluindo células de todos os grupos de quatro. BF = campo claro, Hoechst = Hoechst 33342-, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = iodeto de Propidium. Barra de escala = 10 µm. Esta figura foi modificada de Egeberg Palme et al 2018⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de dados de Ca^{2 +}- fluorimetria. (um) alterações no [Ca^{2 +}]_eu induzida pelo controlo negativo, a progesterona e a composto, a B, a C e a D. (b) curva de dose-resposta de progesterona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A taxa de transferência média Ca^{2 +} sinalização ensaio baseia-se em medições da fluorescência do único micropoços cada contendo cerca de 250.000 células de esperma. O sinal capturado é em média de todas as células de esperma individuais no poço. O ensaio fornece, portanto, que nenhuma informação espacial sobre onde especificamente na célula de esperma [Ca^{2 +}] é alterada, como grandes numa proporção das células de esperma, uma mudança no [Ca^{2 +}]_i toma lugar, ou como heterogêneos a resposta é entre as células individuais. Para obter essas informações, experimentos com resolução de célula única (por exemplo, conforme descrito em⁵⁰^,⁵²) devem ser empregados. Outra desvantagem da técnica é a resolução temporal, que é da ordem de segundos. Mesmo que as amostras de esperma 50 µ l são bem misturadas quando 25 µ l das soluções são adicionados, as medições primeiro podem ser iniciadas após a gaveta com a placa de multi bem é para dentro o leitor de placa de fluorescência. Para obter maior resolução temporal, outras técnicas devem ser empregadas (por exemplo, um fluxo parou fluorimétrico¹³^,⁵⁰). A vantagem do rendimento médio Ca^{2 +}-sinalização do ensaio, em comparação com métodos de célula única ou single-bem é que a medição simultânea de múltiplos micropoços usando um leitor de microplacas permite fácil e rápido teste de múltipla lado a lado com controles positivos e negativos de compostos (Figura 4)^1,2, fácil geração de curvas dose-resposta de compostos individuais (Figura 4)¹^,²^,³ ^, ⁴ ^, ⁵, avaliação de aditividade¹^,² e sinergismo³ para dois ou mais compostos, bem como estudos de modo de ação dos experimentos de inibição competitiva apesar de compostos e o uso de determinado inibidores farmacológicos (por exemplo, CatSper inibidores¹^,²^,³^,⁴^,⁵). Além disso, alterando o fluoróforo, o ensaio pode ser empregado para examinar outras alterações intracelulares (por exemplo, pH_eu¹^,²). Finalmente, mais de um fluoróforo pode ser utilizado uma vez para medir simultaneamente várias alterações intracelulares. No futuro, o rendimento médio Ca^{2 +}-sinalização ensaio poderia ser usado para compostos de tela de interesse para efeitos de Ca^{2 +}-sinalização no esperma humano (por exemplo, produtos químicos ambientais ou candidatos a fármacos) para analisar o potencial adverso efeitos na função da célula de esperma humano ou para investigar um possível papel como um contraceptivo.

O ensaio de reação do acrossoma médio-produção baseia-se na citometria de imagem, o que constitui um substituto atraente para avaliar a reação do acrossoma humano comparada a avaliação manual usando um microscópio de fluorescência. Padrões de coloração de acrosomes intactas ou reagindo/reagiu nem sempre são claros, e uma grande variação intra individual pode ser a consequência deste contrato. Com citometria de imagem, imagens são adquiridas e analisadas automaticamente. O canal de mascaramento, neste caso Hoechst-33342, define as células e só fluorescentes sinais provenientes dessas zonas específicas são incluídos na análise dos dados. Daí, a coloração dos organismos sem núcleo contendo citoplasma residual não está incluído na análise dos dados. Além disso, a contagem de estatísticas é superior à microscopia de fluorescência. Para contar 200 células através da oculares do microscópio é uma tarefa difícil e demorada, mas com citometria de imagem, a análise de pelo menos 5.000 células leva menos de alguns minutos. No entanto, devido a baixa ampliação de citômetro a imagem, a capacidade de avaliar as medições está perdida e um terá de levar a amostra manchada para o microscópio de fluorescência. Portanto, a inclusão de controles é de extrema importância para validar as medições. Se os controles não reage como esperado, os resultados de um experimento devem ser descartados. O protocolo descrito aqui foi inspirado pelo trabalho realizado por Zoppino et al.⁴⁹, que avaliaram a reacção acrossómica humana por citometria de fluxo. Eles ainda mais descritos por microscopia de fluorescência em tempo real como a PSA entra o compartimento acrossomal quando os poros da membrana-fusão aparecem após indução de Reacção acrossómica. Uma vez dentro do compartimento de acrossomal, PSA entope e forma uma marca estável por longos períodos de tempo. Sem fixação ou permeabilização é aplicada no protocolo e, por conseguinte, a interpretação do resultado é clara: PSA no interior do compartimento acrossomal de uma célula de esperma viável é igual a reacção acrossómica. Quanto ao Ca^{2 +}-sinalização de ensaio, o ensaio de reação do acrossoma também poderia ser utilizado para avaliar as curvas dose-resposta, inibição, aditividade e sinergismo de compostos de interesse. No futuro, o ensaio de reação do acrossoma médio-taxa de transferência pode também ser usado para compostos de tela de interesse para efeitos no esperma humano do acrossoma reação (por exemplo, produtos químicos ambientais ou candidatos a fármacos) para examinar os potenciais efeitos adversos sobre este humano função da célula de esperma ou para investigar um possível papel como um contraceptivo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer o laboratório de Timo Strünker para supervisão de AR e DLE durante suas estadias em seu laboratório. Além disso, gostaríamos de agradecer aos nossos colegas do departamento de crescimento e reprodução, Hospital Universitário de Copenhaga, Rigshospitalet por sua ajuda com a criação destes dois ensaios. Este trabalho foi financiado por doações da Dinamarca fundo de inovação (concessão números 005-2010-3 e 4-14-2013).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl₂
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO₃ and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH₂PO₄
Magnetic stirrer
MgSO₄
Na-Lactate
NaCl
NaHCO₃
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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Biology

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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