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Biology

Ca पर प्रभाव के आकलन के लिए मध्यम throughput स्क्रीनिंग assays2 +-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में acrosome प्रतिक्रिया

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

यहां, Ca 2 पर प्रभाव के आकलन के लिए दो मध्यम-थ्रप्ट assays+-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया वर्णित हैं । इन assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जल्दी और आसानी से के लिए यौगिकों की बड़ी मात्रा में स्क्रीन Ca पर प्रभाव2 +-संकेतन और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया.

Abstract

Ca2 +-संकेतन सामांय शुक्राणु सेल समारोह और पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है । इसी तरह, अग्रपिंडक प्रतिक्रिया एक मानव शुक्राणु कोशिका की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है zona पेल्यूसिडा घुसना और अंडे खाद । इसलिए यह महान ब्याज के यौगिकों का परीक्षण करने के लिए है (जैसे, पर्यावरणीय रसायनों या दवा उंमीदवारों) Ca पर उनके प्रभाव के लिए2 +-संकेतन और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया या तो मानव शुक्राणु सेल समारोह पर संभावित प्रतिकूल प्रभाव की जांच करने के लिए या गर्भनिरोधक के रूप में संभावित भूमिका की जांच करना । यहां, दो मध्यम-थ्रप्ट assays वर्णित हैं: 1) एक प्रतिदीप्ति-Ca पर प्रभाव के मूल्यांकन के लिए परख2 +-मानव शुक्राणु में संकेतन, और 2) मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के आकलन के लिए एक छवि cytometric परख । इन assays Ca पर प्रभाव के लिए यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है2 +-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया. इसके अलावा, assays अत्यधिक विशिष्ट खुराक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-व्यक्तिगत यौगिकों की प्रतिक्रिया घटता, दो या अधिक यौगिकों के लिए संभावित additivity/synergism का निर्धारण, और प्रतिस्पर्धी निषेध के माध्यम से कार्रवाई की औषधीय मोड का अध्ययन करने के लिए catsper inhibitors के साथ प्रयोग ।

Introduction

दो assays यहां वर्णित के प्रयोजन के लिए 2 पर प्रभाव की जांच कर रहा है+-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया, के रूप में कई यौगिकों के लिए दिखाया गया है अनेक इन assays को रोजगार प्रकाशनों1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-संकेतन और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया दोनों सामांय मानव शुक्राणु सेल समारोह और पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

एक मानव शुक्राणु कोशिका के समग्र लक्ष्य के लिए अंडे खाद है । को सफलतापूर्वक और स्वाभाविक रूप से अंडा खाद करने में सक्षम हो, शुक्राणु कोशिका के कार्य कसकर मादा प्रजनन पथ के माध्यम से शुक्राणु कोशिका की यात्रा के दौरान विनियमित किया जाना चाहिए8,9. शुक्राणु कोशिका कार्यों के कई इंट्रासेलर Ca के माध्यम से विनियमित रहे हैं2 +-एकाग्रता [Ca2 +]मैं (जैसे, शुक्राणु गतिशीलता, chemotaxis, और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया)10. इसके अलावा, एक परिपक्वता प्रक्रिया संधारित्र कहा जाता है, जो अंडा निषेचित करने में सक्षम शुक्राणु कोशिका renders, आंशिक रूप से विनियमित है [Ca2 +]मैं10. ca2 +-extruding ca2 +-atpase पंपों11 बनाए रखने के एक लगभग २०.००० गुना ca2 +-मानव शुक्राणु कोशिका झिल्ली पर ढाल, एक आराम के साथ [Ca2 +]i of 50-100 nM. यदि ca2 + सेल झिल्ली को पार करने की अनुमति दी है (जैसे, ca के उद्घाटन के माध्यम से2 +-चैनल), ca 2 की एक खासी आमद+ होता है, की एक पदोंनति को जंम दे [ca2 +]i। हालांकि, शुक्राणु कोशिका भी इंट्रासेलुलर ca2 +-भंडार है, जो ca2 जारी कर सकते है + और, इसलिए भी वृद्धि एक [ca2 +]मैं12की तरक्की दे । दिलचस्प है, सभी चैनल-मध्यस्थता Ca2 +-मानव शुक्राणु कोशिकाओं में आमद अब तक catsper (कैटईओण चैनल के एसपेrm), जो केवल शुक्राणु कोशिकाओं11में व्यक्त किया जाता है के माध्यम से घटित करने के लिए पाया गया है । मानव शुक्राणु कोशिकाओं में, catsper अंतर्जात लिगन्स प्रोजेस्टेरोन और उपलब्ध अलग संलग्नी बाध्यकारी साइटों के माध्यम से सक्रिय है13,14,15, एक तेजी से Ca करने के लिए अग्रणी2 +-में तांता शुक्राणु कोशिका । अंडे के पास दो मुख्य स्रोत इन अंतर्जात लिगन्स के उच्च स्तर प्रदान करते हैं । एक कूपिक द्रव है कि प्रोजेस्टेरोन के उच्च स्तर में शामिल है16. कूपिक द्रव ovulation पर अंडे के साथ एक साथ परिपक्व कूप से जारी किया गया है और अंडवाहिनी17के भीतर तरल पदार्थ के साथ घोला जा सकता है । अंय मुख्य स्रोत है मेघपुंज कोशिकाओं है कि अंडे के चारों ओर और प्रोजेस्टेरोन और prostaglandins के उच्च स्तर जारी है । प्रोजेस्टेरोन-प्रेरित Ca2 +-शुक्राणु कोशिकाओं में आमद9,18, नियंत्रण शुक्राणु गतिशीलता19,20 की ओर chemotaxis मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है और अग्रपिंडक उत्तेजित प्रतिक्रिया२१. इन व्यक्ति के ट्रिगर [Ca2 +]मैंविनियमित शुक्राणु सही क्रम में कार्य करता है और सही समय पर अंडा8के निषेचन के लिए महत्वपूर्ण है । इस के साथ लाइन में, एक सबऑप्टिमल प्रोजेस्टेरोन प्रेरित Ca2 +-तांता कम पुरुष प्रजनन के साथ जुड़ा हुआ पाया गया है22,23,24,25,26 ,27,28,29 और कार्यात्मक catsper पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है26,30,31,३२, ३३,३४,३५,३६.

के रूप में शुक्राणु कोशिकाओं के अंडे तक पहुंचने, घटनाओं के एक अनुक्रम में होने के लिए निषेचन के लिए जगह ले जाना चाहिए: 1) शुक्राणु कोशिकाओं आसपास के मेघपुंज कोशिका परत घुसना चाहिए, 2) zona pellucida के लिए बाध्य, 3) exocytose acrosomal सामग्री, तथाकथित अग्रपिंडक प्रतिक्रिया ३७, 4) zona पेल्यूसिडा घुसना, और 5) अंडे की झिल्ली के साथ फ्यूज३८निषेचन को पूरा करने के लिए । इन कदमों के माध्यम से जाने के लिए और अंडे खाद करने में सक्षम होना करने के लिए, शुक्राणु कोशिका पहले capacitation11से गुजरना होगा, जो शुरू होता है के रूप में शुक्राणु कोशिकाओं "decapacitating" कारकों३९ और महिला के तरल पदार्थ में तैरने युक्त मौलिक द्रव छोड़ बिसारबोनेट और एल्ब्युमिन३७के उच्च स्तर के साथ प्रजनन पथ । capacitation शुक्राणु कोशिकाओं hyperactivation से गुजरना करने में सक्षम renders, एक जोरदार flagellum की धड़कन के साथ गतिशीलता का एक रूप, और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया३७. hyperसक्रियित गतिशीलता zona पेल्यूसिडा४०के प्रवेश के लिए आवश्यक है, और अग्रपिंडक विभिंन hydrolytic एंजाइमों कि इस प्रवेश प्रक्रिया४१सहायता शामिल है । इसके अतिरिक्त, अग्रपिंडक प्रतिक्रिया शुक्राणु के शुक्राणु के लिए आवश्यक सतह पर विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन को उजागर करके अंडे के साथ fusing में सक्षम कोशिकाओं को renders-अंडा फ्यूजन४२। नतीजतन, hyperactivation और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना करने की क्षमता दोनों अंडे४०,४२के सफल निषेचन के लिए आवश्यक हैं । क्या माउस शुक्राणु कोशिकाओं के लिए देखा गया है के विपरीत४३,४४,४५, केवल मानव शुक्राणु कोशिकाओं है कि acrosome हैं-बरकरार zona पेल्यूसिडा४६के लिए बाध्य कर सकते हैं. जब मानव शुक्राणु कोशिकाओं zona पेल्यूसिडा वे अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना करने के लिए दोनों zona पेल्यूसिडा४१ घुसना और विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन है कि३८अंडे के साथ फ्यूजन के लिए आवश्यक हैं बेनकाब करने के लिए बाध्य कर रहे हैं. मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के समय इस प्रकार निषेचन होने के लिए महत्वपूर्ण है ।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, ca2 +-संकेतन सामान्य शुक्राणु सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है8, और यह है, इसलिए, महान ब्याज के लिए Ca पर प्रभाव के लिए यौगिकों की बड़ी संख्या स्क्रीन करने में सक्षम होना2 +-मानव शुक्राणु कोशिकाओं में संकेतन. इसी तरह, के रूप में केवल मानव शुक्राणु कोशिकाओं है कि सही समय और जगह पर अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना zona पेल्सिडा घुसना और अंडे४६,४७खाद कर सकते हैं, यह भी महान ब्याज की अपनी क्षमता के लिए यौगिकों का परीक्षण करने में सक्षम होना करने के लिए मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया को प्रभावित. इस अंत करने के लिए, दो मध्यम throughput स्क्रीनिंग assays वर्णित हैं: 1) Ca 2 पर प्रभाव के लिए एक परख+मानव शुक्राणु कोशिकाओं में संकेतन, और 2) मानव शुक्राणु कोशिकाओं में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया प्रेरित करने की क्षमता के लिए एक परख ।

1 परख एक मध्यम throughput Ca2 +-संकेतन परख है । यह प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक-आधारित तकनीक कई कुओं में एक साथ समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है. ca2 +-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई, fluo-4 ca के लिए एक Kd है2 +≈ ३३५ एनएम और सेल है-AM (acetoxymethyl) एस्टर के रूप में permeant. fluo-4 का उपयोग करना, यह [Ca में परिवर्तन को मापने के लिए संभव है2 +]मैं समय के साथ और शुक्राणु कोशिकाओं के लिए ब्याज के यौगिकों के अलावा के बाद. परख २०११13 में timo strünker की प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था और बाद से कई अध्ययनों में Ca 2 पर प्रभाव के लिए स्क्रीन यौगिकों के लिए इस्तेमाल किया गया है+-मानव शुक्राणु में संकेतन1,2,3, 4,5. इसके अलावा एक ऐसी ही विधि के लिए कई दवा उंमीदवारों४८स्क्रीन का इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, इस परख कार्रवाई के औषधीय मोड का आकलन करने के लिए भी उपयोगी है1,2,3,4,5, खुराक-प्रतिक्रिया घटता1, 2,3,4,5, प्रतिस्पर्धी अवरोध1, 2, योज्यता1,2, और synergism3 of ब्याज के यौगिकों ।

2 परख एक मध्यम थ्र्रपुट अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख है । इस छवि cytometer आधारित तकनीक के उपाय व्यवहार्य अग्रपिंडक एक नमूने में शुक्राणु कोशिकाओं की राशि, तीन फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर: प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई), fitc-युग्मित लेक्टिन पिसम साटिवुम (fitc-पीएसए), और hoechst-३३३४२. परख एक समान प्रवाह cytometry से संशोधित किया गया zoppino एट अल.४९ द्वारा विधि आधारित है और कई अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है6,7। Ca 2 के लिए के रूप में+-संकेतन परख, इस अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख भी खुराक का आकलन किया जा सकता है-प्रतिक्रिया घटता, निषेध, additivity, और ब्याज के यौगिकों के synergism.

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Protocol

प्रोटोकॉल में मानव वीर्य नमूनों का संग्रह और विश्लेषण डेनमार्क के राजधानी क्षेत्र की अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का अनुसरण करता है । सभी वीर्य नमूने स्वयंसेवक दानदाताओं से सूचित सहमति के बाद प्राप्त किए गए हैं. डिलीवरी के बाद नमूनों को पूरी तरह से अनाम कर दिया गया । उनकी असुविधा के लिए प्रत्येक दाता ५०० dkk का एक शुल्क प्राप्त (के बारे में $७५ अमेरिकी डॉलर) नमूना प्रति । नमूनों को डिलीवरी के दिन विश्लेषण किया गया और फिर प्रयोगशाला प्रयोगों के तुरंत बाद नष्ट कर दिया गया.

नोट: मध्यम थ्र्रपुट Ca2 +-सिग्नलिंग परख चरणों में 4-5 और मध्यम थ्र्रपुट अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख 6-7 चरणों में वर्णित है । मानव ट्यूबल द्रव (htf+) मध्यम तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल चरण 1 में वर्णित है और assays के लिए शुक्राणु कोशिकाओं के शुद्धिकरण चरणों में वर्णित है 2-3.

1. मानव ट्यूबल द्रव (htf+) मध्यम की तैयारी

नोट: उपयुक्त आकारों की volumetric बोतल का उपयोग करें, एक 1 एल मापने सिलेंडर, एक चुंबकीय उत्तेजक, नमक तालिका 1 और तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में, शुद्ध पानी, एक ०.२ μm रंध्र फिल्टर, और ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों ।

  1. शुद्ध पानी में लवण के स्टॉक समाधान तैयार (तालिका 1) ।
    1. तालिका 1 में सूचीबद्ध नमक की मात्रा उपयुक्त आकार के एक volumetric फ्लास्क के लिए जोड़ें, वांछित मात्रा से नीचे एक बिट करने के लिए शुद्ध पानी जोड़ने, और एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग अच्छी तरह से मिश्रण.
    2. जब नमक पूरी तरह से घुल जाए, तो चुंबक को हटा दें और शुद्ध पानी के साथ वांछित अंतिम मात्रा में भरें ।
  2. स्थानांतरण स्टॉक समाधान एक बोतल और दुकान के लिए उपयोग तक ।
    नोट: स्टॉक समाधान रखा जा सकता है और समय की लंबी अवधि के लिए पुन: उपयोग:-20 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान पर अंय शेयर समाधान (आरटी) में ग्लूकोज और hepes ।
  3. शेयर समाधान (तालिका 2) से htf+ मध्यम के 1 एल तैयार करें ।
    1. सुनिश्चित करें कि सभी स्टॉक समाधान पूरी तरह से भंग और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाया जाता है ।
    2. तालिका 2 में सूचीबद्ध स्टॉक समाधान और नमक की मात्रा को 1 L मापने वाले सिलेंडर में जोड़ें और शुद्ध पानी को ९०० मिलीलीटर में जोड़ें ।
    3. मिश्रण अच्छी तरह से एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर और naoh समाधान के साथ ७.३५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    4. चुंबक निकालें और १,००० मिलीलीटर में शुद्ध पानी जोड़ें ।
  4. बाँझ छानना htf+ मध्यम के माध्यम से एक ०.२ μm ताकना फिल्टर, aliquot htf+ मध्यम से ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों, और दुकान पर 4 ° c उपयोग तक.
  5. बस एक प्रयोग चलाने से पहले, जोड़ने के १६५ μl na-५० एमएल aliquot को pyruvate के लिए एक अंतिम na-pyruvate एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ०.३३ मिमी ।
    नोट: मानव ट्यूबल द्रव माध्यम भी विभिन्न वाणिज्यिक प्रदाताओं से प्राप्त किया जा सकता है । 4 मिमी hco3- मध्यम का उपयोग करते समय, नमूने पीएच में बड़े drifts बिना हवा में अतिरिक्त सह2 बिना एक इनकोबेटर में बंद lids के साथ incubated किया जा सकता है । यदि एक सह2 इनकोबेटर उपलब्ध है, सह2 की इसी राशि हेंडरसन-hasselbalch समीकरण का उपयोग कर गणना की जा सकती है और इस्तेमाल किया । यदि 25 मिमी hco3- मध्यम का उपयोग कर, नमूनों को सह 2 की इसी राशि युक्त हवा के साथ एक सह2 इनकोबेटर में खुले ढक्कन के साथ incubated किया जाना चाहिए (वायुमंडलीय दबाव पर निर्भर करता है, आमतौर पर के बीच 5-10%) पीएच में एक बहाव से बचने के लिए । सह2 की सटीक राशि हेंडरसन-hasselbalch समीकरण का उपयोग कर गणना की जा सकती है ।

2. तैरना अप के माध्यम से गतिशील शुक्राणु कोशिकाओं की शुद्धि (चित्रा 1)

नोट: वीर्य के नमूने के लिए एक स्वच्छ चौड़े मुंह वाले प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग करें, एक इनकोबेटर, ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों, एक ४५ डिग्री कोण पर ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों को रखने के लिए एक रैक, htf+ मध्यम (चरण 1 में तैयार या वाणिज्यिक प्रदाता से प्राप्त), एक अपकेंद्रित्र, और मानव सीरम एल्ब्युमिन (एचएसए) ।

  1. एक ताजा दान प्राप्त मानव वीर्य नमूना हस्तमैथुन के माध्यम से उत्पादित और एक चौड़े मुंह साफ प्लास्टिक कंटेनर में ejaculated. केवल वीर्य के नमूनों का उपयोग करें जो मानव वीर्य के परीक्षण और प्रसंस्करण के लिए WHO प्रयोगशाला मैनुअल द्वारा स्थापित मापदंडों को पूरा करते हैं ।
  2. 15-30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेने के लिए यह liquefy की अनुमति है ।
  3. htf की ५० मिलीलीटर गर्मी+ 4 मिमी hco3 के साथ मध्यम से ३७ ° c ।
  4. एक ४५ ° कोण पर एक रैक में साफ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों प्लेस (तरल पदार्थ के बीच सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए) । कच्चे वीर्य की प्रति मिलीलीटर 1 ट्यूब का उपयोग करें ।
  5. preheated htf के 4 मिलीलीटर+ ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए मध्यम जोड़ें ।
  6. सावधानी से प्रत्येक ट्यूब के नीचे करने के लिए 10 preheated htf के 4 मिलीलीटर युक्त वीर्य के नमूने के 1 मिलीलीटर पिपेट। हवा के बुलबुले की रिहाई से बचें ।
  7. पलकों को बंद करें और 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं ।
  8. धीरे महाप्राण और ऊपरी अंश (htf+ गतिशील शुक्राणु कोशिकाओं के साथ) के रूप में ज्यादा के रूप में एक नया 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए संभव के रूप में स्थानांतरण, ध्यान दे रही है कि नीचे अंश से कुछ भी नहीं (अचर और मृत कोशिकाओं के साथ वीर्य) शामिल है । आम तौर पर, यह शीर्ष अंश के ३.५ मिलीलीटर हस्तांतरण करने के लिए सुरक्षित है, नीचे अंश परेशान बिना. सक्शन अशांति से बचने के लिए, एक बड़ा खोलने प्राप्त करने के लिए एक ४५ डिग्री कोण पर पिपेट टिप के सबसे ऊपर 1-2 मिमी कट ।
  9. 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब को htf के साथ भरें+ कोशिकाओं को धोने के लिए और आरटी पर 10 मिनट के लिए ७०० एक्स जी पर ट्यूब को सेंट्रेसेज करें ।
  10. धीरे से महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला हटाने और htf के 2 मिलीलीटर में शुक्राणु कोशिका गोली resuspend+.
  11. शुक्राणु की एकाग्रता के आकलन के लिए दो छोटे प्लास्टिक ट्यूबों के लिए शुक्राणु निलंबन के 20 μl स्थानांतरण (चरण 3 देखें).
  12. 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब को htf के साथ भरें+ कोशिकाओं को धोने के लिए और आरटी पर 10 मिनट के लिए ७०० एक्स जी पर ट्यूब को सेंट्रेसेज करें ।
  13. धीरे से महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला को हटाने और शुक्राणु सेल गोली 10 x 106 कोशिकाओं को resuspend/एमएल (सेल एकाग्रता के आधार पर चरण २.११ में मूल्यांकन).
    1. संयुक्त राष्ट्र-संधारित्र शुक्राणु कोशिकाओं का उपयोग कर प्रयोगों के लिए (दिनचर्या Ca2 +-संकेतन परख)
      1. htf में resuspend कोशिकाओं+ 4 मिमी hco3के साथ ।
      2. 3 मिलीग्राम/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मानव सीरम एल्ब्युमिन (एचएसए) (१०० मिलीग्राम/एमएल) प्रति एमएल htf+ के 30 μl जोड़ें ।
      3. बंद lids और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ≥ 1 एच के लिए सेते ।
    2. capacitated शुक्राणु कोशिकाओं का उपयोग कर प्रयोगों के लिए (acrosome प्रतिक्रिया परख)
      1. htf में resuspend कोशिकाओं+ 25 मिमी hco3के साथ-।
      2. 3 मिलीग्राम/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 30 μl के hsa (१०० मिलीग्राम/एमएल) प्रति एमएल htf+ जोड़ें ।
      3. पलकों ढीला और सह2 की इसी राशि के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर ≥ 3 घंटे के लिए सेते देते हैं (चरण 1 देखें, आमतौर पर 5-10% CO2के बीच) ।

3. शुक्राणु कोशिकाओं की गिनती

नोट: शुक्राणु कोशिकाओं को या तो मैंयुअल रूप से गिना जा सकता है५० या एक छवि cytometer५१का उपयोग कर, के रूप में यहां वर्णित है । एक छवि cytometer का प्रयोग करें, एक vortexer, $, एक SP1-कैसेट, तैरना-अप शुद्ध शुक्राणु कोशिकाओं (चरण 2 में तैयार) ।

  1. 10, 20, 30, ५० या ९० के एक कारक के लिए एक 20 μl aliquot को पतला करने के लिए एक दौर नीचे 2 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर की उंमीद एकाग्रता के अनुसार (चरण में गोली के मैनुअल निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन २.१०) । कमजोर पड़ने की संभावना है कि एकाग्रता के लिए निकटतम है का उपयोग करें (यानी, अगर एक एकाग्रता के 15 x 106 शुक्राणु कोशिकाओं के बाद प्रति मिलीलीटर तैरने की उम्मीद है तो 20 μl शुक्राणु का नमूना के साथ पतला है ३८० μl के साथ $100 बफर [तनुकरण कारक 20]).
  2. अधिकतम ७०० आरपीएम पर एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर 10 एस के लिए अच्छी तरह से मिक्स, नमूना में SP1-कैसेट विसर्जित कर दिया और पूरी तरह से नीचे सफेद डुबकी कैसेट में नमूना के एक aliquot महाप्राण दबाएँ.
  3. छवि cytometer खोलो, ट्रे में कैसेट प्लेस और PI दाग मानव शुक्राणु कोशिकाओं परख की परख गिनती लागू कमजोर पड़ने फैक्टर के अनुसार (चरण ३.१ में चुना) चलाते हैं ।
  4. पहले 20 μl नमूना से प्राप्त मापा एकाग्रता के लिए निकटतम एक कमजोर पड़ने कारक का उपयोग कर, एक और 20 μl नमूना के साथ 3.1-3.3 चरण दोहराएँ ।
  5. दो माप से मतलब शुक्राणु कोशिका एकाग्रता की गणना.
  6. कुल शुक्राणु सेल गिनती प्राप्त करने के लिए मूल मात्रा के साथ मतलब शुक्राणु सेल एकाग्रता गुणा (चरण 2 में, इस मूल मात्रा 2 मिलीलीटर है).

4. नि: शुल्क इंट्राकोशिलर ca में परिवर्तन की माप2 +-एकाग्रता ([ca2 +]i) ca का उपयोग2 +-fluorimetry (चित्रा 2)

नोट: एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर, ३८४ मल्टी वेल प्लेटों, fluo-4 AM, तैरना-अप शुद्ध शुक्राणु कोशिकाओं का उपयोग करें (चरण 2 में तैयार), ब्याज के यौगिकों के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, एक स्वत: पुनरावर्तक पिपेट, और एक 12 चैनल pipette.

  1. एक 2 मिमी fluo-4 एक ५० μg fluo-4 am की एक शीशी के लिए डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (dmso) के २२.७ μl जोड़कर शेयर तैयार कर रहा हूं और ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रण ।
  2. ७०० μl तैरना-up बरामद शुक्राणु निलंबन (एक नया परीक्षण ट्यूब करने के लिए चरण 2 में उल्लिखित के रूप में संधारित्र या संयुक्त राष्ट्र-संधारित्र) के एक aliquot जोड़ें । शुक्राणु नमूने के ७०० μl ३८४-microwell थाली में 24 कुओं की एक पंक्ति का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक राशि है (3 नियंत्रण और doublets में 9 यौगिकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया).
  3. जोड़ें ३.५ μl fluo-4 am स्टॉक समाधान के ७०० μl शुक्राणु निलंबन के लिए 10 μm fluo-4 am की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए इंसेबेट नमूना, प्रकाश से संरक्षित ।
  5. 10 मिनट, महाप्राण के लिए ७०० एक्स जी पर सेंट्रेसेज नमूना और अतिरिक्त fluo-4 हटाने के लिए सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  6. htf में resuspend दाग गोली+ करने के लिए 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल (यानी, 2x का उपयोग करें चरण ४.२ में लिया सेल निलंबन की मात्रा)
  7. यौगिकों और नियंत्रणों की dilutions तैयार करें (कदम ४.४ और ४.५ में ऊष्मायन और अपकेंद्रीकरण अवधि के दौरान किया जा सकता है, क्रमशः) ।
    1. पतला यौगिकों, साथ ही एक नकारात्मक नियंत्रण (वाहन के साथ बफर) और एक सकारात्मक नियंत्रण (progesterone) htf+में । पतला यौगिकों और नियंत्रण वांछित अंतिम एकाग्रता 3x करने के लिए, के रूप में वे 1:3 पतला कर रहे हैं जब वे चरण में शुक्राणु कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं ४.१६.
    2. ट्यूबों के बीच दूरी के साथ एक रैक में dilutions के साथ प्लेस ट्यूब 12-चैनल के पिपेट सुझावों के बीच का अंतर करने के लिए इसी से कदम ४.१६ में इस्तेमाल किया पिपेट ।
  8. एक स्वत: पुनरावर्तक पिपेट का उपयोग करें (५० μl के 24 कदम) ।
    1. fluo-4 सना हुआ शुक्राणु नमूना धीरे से पूरी राशि के ऊपर और नीचे एक बार pipetting द्वारा मिश्रण ।
    2. ३८४-microwell थाली में एक पंक्ति के 24 कुओं के लिए ५० μl के aliquots जोड़ें ।
  9. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रतिदीप्ति थाली रीडर में microwell थाली प्लेस और दराज बंद ।
  10. fluo-4 के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन करें । ४८० एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्तेजित करना और ५२० एनएम पर रिकॉर्ड उत्सर्जन । सेटिंग के साथ संभव सबसे तेज चक्र समय का उपयोग करें ।
    नोट: अच्छी तरह से और नीचे प्रकाशिकी, यदि संभव हो तो प्रति कम से 10 चमक का उपयोग करें ।
  11. पंक्ति में एक अच्छी तरह का चयन करें और 20% के लक्ष्य मूल्य के लिए लाभ को समायोजित ।
  12. माप प्रारंभ करें ।
  13. पहले 5 चक्रों के दौरान आधारभूत नियंत्रण ।
    1. यदि फ्लोरोसेंट readout समय के साथ बढ़ रही है या कम हो रही है, प्रयोग बंद करो, लाभ readout और प्रयोग फिर से शुरू करते हैं ।
    2. यदि आधार रेखा एक पंक्ति में व्यक्ति कुओं के बीच एक बहुत अलग है, या तो चरण ४.८ में pipetting किया गया है या गलत नमूना नहीं मिलाया गया था अच्छी तरह से पहले pipetting । प्रयोग छोड़ें.
    3. यदि फ्लोरोसेंट readout पंक्ति में कुओं के बीच तुलनीय है और 5 पहले चक्र के दौरान स्थिर, अगले कदम के लिए जारी है ।
  14. 10 चक्रों के बाद (आधारभूत के लिए प्रयुक्त), प्रयोग रोकें ।
  15. सूक्ष्मकूप थाली के साथ दराज बाहर निकालें ।
  16. एक 12-चैनल पिपेट का उपयोग (25 μl के 2 कदम), जल्दी से यौगिकों और नियंत्रण के तैयार समाधान के 25 μl जोड़ने (चरण ४.७ से) 12 अच्छी तरह से डुप्लिकेट (24 कुओं) एक पंक्ति के लिए. समाधान 1:3 पतला हो जाएगा, के रूप में कुएं पहले से ही सना हुआ शुक्राणु नमूने के ५० μl होते हैं ।
  17. माप के रूप में जल्दी संभव के रूप में जारी रखें (दराज स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा) जोड़ा यौगिकों और नियंत्रण से प्रेरित किसी भी फ्लोरोसेंट संकेतों को याद करने से बचने के लिए. यौगिकों और नियंत्रणों के जोड़ के बाद प्रतिदीप्ति (δ f) में परिवर्तन अब कैप्चर किए जाएंगे ।
  18. प्रयोग चलाएं जब तक फ्लोरोसेंट संकेतों को सकारात्मक नियंत्रण और ब्याज के यौगिकों से दर्ज किया गया है ।
  19. प्रयोग रोकें और इसे चरण 5 में विश्लेषित करने के लिए raw प्रतिदीप्ति डेटा निर्यात करें ।
    नोट: आम तौर पर fluo-4 AM ca के रूप में इस्तेमाल किया गया है2 +-परख में संवेदनशील फ्लोरोफोर, लेकिन अन्य Ca2 +-संवेदनशील fluorophores भी इस्तेमाल किया जा सकता अगर उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्रतिदीप्ति थाली रीडर में फिल्टर के साथ फिट. फ्लोरोफोरे की पसंद के आधार पर, सुनिश्चित करें कि लाभ स्तर एक "सुरक्षित" स्तर पर सेट किया गया है जहां प्रेरित फ्लोरिसेंट चोटियों को मापने की सीमा के भीतर हैं । यह एक एकल अच्छी तरह से एक विशिष्ट लाभ की स्थापना पर ionomycin जोड़कर परीक्षण किया जा सकता है. यदि यह थ्रेशोल्ड के ऊपर एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित, लाभ कम है और फिर से प्रयास करें । कुछ का उपयोग करें pluronic एफ-१२७ fluo-41,13की लोडिंग सहायता करने के लिए, लेकिन यह पाया गया है कि यह आवश्यक नहीं है2. एक साथ मापा पंक्तियों की अधिकतम संख्या दो कारकों पर निर्भर करता है । 1) साधन के चक्र समय: यदि चक्र समय बहुत लंबा है, [Ca2 +] में प्रेरित चोटियोंमैं याद किया जा सकता है. चक्र समय कम रखने के लिए एक साथ दो पंक्तियों की एक अधिकतम उपाय; 2) चरण ४.१६ में पाइपटिंग की गति: 12-चैनल पिपेट का उपयोग करना, 1 या 2 पंक्तियों के 12 डुप्लिकेट कुओं (24 कुओं) के लिए जल्दी से 12 विभिन्न समाधानों को जोड़ना संभव है (उदा., एक पंक्ति पूर्व-वाहन के साथ इनकुबेटेड और एक पंक्ति पूर्व-एक अवरोधक के साथ इनकुबेटेड) , प्रेरित Ca2 + चोटियों लापता बिना । हालांकि, यह एक साथ मापने के लिए दो पंक्तियों के लिए 24 विभिन्न समाधान जोड़ने के लिए प्रयास करने के लिए अनुशंसित नहीं है, के रूप में pipetting सुझावों के बीच में प्रतिस्थापित किया जा करने के लिए होगा दो अनुक्रमिक pipetting चरणों, जिससे प्रेरित Ca2 + चोटियों याद किया जा सकता है.

5. Ca से डेटा का विश्लेषण2 +-fluorimetry

  1. कच्चा प्रतिदीप्ति डेटा प्राप्त और चरण 4 में निर्यात खोलें ।
  2. डुप्लिकेट कुओं से औसत की गणना । यदि डुप्लिकेट के बीच बड़े अंतर मौजूद हैं, तो विशिष्ट कुओं से डेटा छोड़ें ।
  3. 10 पहले चक्र के रूप में आधार रेखा को परिभाषित करें ।
  4. की गणना δ f/एफ0 (%) प्रतिदीप्ति में प्रतिशत परिवर्तन के रूप में समय के साथ यौगिकों और नियंत्रण का मतलब बेसल प्रतिदीप्ति (एफ0) के लिए 10 पहले चक्र (आधारभूत) के दौरान के अलावा के बाद ।
  5. खुराक की पीढ़ी के लिए डेटा का उपयोग कर-प्रतिक्रिया घटता, अन्य कुओं से नकारात्मक नियंत्रण के readout घटाना, pipetting कलाकृतियों को दूर करने के लिए.

6. acrosome प्रतिक्रिया की माप

नोट: एक छवि cytometer, एक incubator, फ्लोरोसेंट रंजक: पीआई, fitc-पीएसए, और hoechst-३३३४२, ब्याज के यौगिकों के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, एक immobilizing समाधान का उपयोग ०.६ एम नहको3 और ०.३७% (v/ एक A2 स्लाइड, और capacitated तैरना-अप शुद्ध शुक्राणु कोशिकाओं (चरण 2 में तैयार).

  1. पीआई युक्त एक धुंधला समाधान तैयार करें (5 μg/एमएल), fitc-पीएसए (५० μg/एमएल) और htf में hoechst-३३३४२ (१०० μg/एमएल), यह अच्छी तरह से एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर मिश्रण और प्रकाश से उपयोग तक इसे बचाने के लिए ।
  2. 10x वांछित अंतिम एकाग्रता में यौगिकों और नियंत्रण के समाधान तैयार है, के रूप में वे 1:10 चरण ६.५ में पतला कर रहे हैं । हमेशा एक नकारात्मक (वाहन) नियंत्रण और दो सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं: प्रोजेस्टेरोन 10 μm अंतिम एकाग्रता और आयनोमाइसिन 2 μm अंतिम एकाग्रता ।
  3. संधारित्र शुक्राणु कोशिकाओं के २४० μl के स्थानांतरण aliquots (चरण 2 में तैयार) प्लास्टिक ट्यूबों के लिए.
  4. प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला समाधान के 30 μl जोड़ें । दाग की अंतिम एकाग्रता हो जाएगा: ०.५ μg/एमएल पीआई, 5 μg/एमएल fitc-पीएसए, और 10 μg/एमएल hoechst-३३३४२ ।
  5. प्रत्येक ट्यूब (1:10 कमजोर पड़ने) के लिए नियंत्रण या यौगिकों के साथ समाधान के 30 μl जोड़ें ।
  6. कुछ समय या हल्के vortexing ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे नमूने मिलाएं । यांत्रिक तनाव के कारण, अत्यधिक मिश्रण से बचें ।
  7. 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
  8. एक immobilizing समाधान के १०० μl के साथ नए प्लास्टिक ट्यूबों को तैयार करें जिसमें ०.६ मीटर नहको3 और ०.३७% (v/v) डिस्टिल्ड वॉटर में formaldehyde, एक प्रति टेस्ट ट्यूब ।
  9. ऊष्मायन के बाद, पाइपटिंग द्वारा नमूनों को अच्छी तरह से मिलाएं, और १०० μl के साथ एक ट्यूब के लिए परीक्षण नमूना के ५० μl जोड़ें समाधान ।
  10. एक A2 स्लाइड के कक्षों को लोड करने से पहले, नमूना को पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं । हवाई बुलबुले बनाने के बिना लगभग 30 μl के साथ सावधानी से कक्षों को भरें ।
    नोट: ऊष्मायन के दौरान, गतिशील शुक्राणु कोशिकाओं को एकीकृत करते हैं । सेल clumps माप परेशान कर सकते है (भले ही वे बाहर रखा गया है) । इसलिए, ऊष्मायन के बाद पिपीटिंग द्वारा एक पूरी तरह से मिश्रण बहुत महत्वपूर्ण है । इसी तरह, कक्षों में हवाई बुलबुले माप परेशान कर सकते हैं । इसलिए, कक्ष को धीरे से भरें और पिपेट के कोण को बदलें यदि तरल के किनारों के बारे में मिलने और एक हवाई बुलबुले बनाने के लिए कर रहे हैं ।
  11. छवि cytometer की ट्रे पर भरी हुई स्लाइड प्लेस और ट्रे बंद करो ।
  12. flexicyte प्रोटोकॉल और प्रेस चलाने का चयन करें ।
    1. flexicyte प्रोटोकॉल के लिए निंनलिखित सेटिंग्स चुनें: विश्लेषणात्मक चैनलों की संख्या: 2; मास्किंग चैनल: यूवी (LED365), यह छवि विभाजन के लिए इस्तेमाल किया चैनल है; चैनल 1: ब्लू (LED475), एक्सपोजर टाइम ३,००० ms, उत्सर्जन फ़िल्टर 560/35; चैनल 2: ग्रीन (LED530), एक्सपोजर टाइम ५०० ms, उत्सर्जन फ़िल्टर 675/75; विश्लेषित कक्षों की न्यूनतम संख्या: ५०००; एग्रीगेट किए गए कक्षों को छोड़ें: हां ।
  13. दोहराएं चरण 6.9-6.12 जब तक सभी नमूनों को मापा जा चुका है ।

7. छवि cytometry से डेटा का विश्लेषण

  1. चरण 6 में प्राप्त डेटा खोलें ।
  2. माप का मूल्यांकन करने के लिए दो निम्नलिखित भूखंडों बनाएँ.
    1. द्विघातांकी तराजू पर hoechst-३३३४२ तीव्रता बनाम होेसेंट-३३३४२ क्षेत्र के एक तितर बितर भूखंड बनाएं । इस भूखंड hoechst बाहर गेट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-३३३४२ सकारात्मक वस्तुओं है कि या तो बहुत छोटे या बहुत बड़े मानव शुक्राणु कोशिकाओं हो रहे हैं ।
    2. द्विघातांकी तराजू पर fitc-पीएसए तीव्रता और पीआई तीव्रता का एक तितर बितर भूखंड बनाएँ । इस साजिश के लिए गधों का इस्तेमाल किया जा सकता है अग्रपिंडक प्रतिक्रिया शुक्राणु कोशिकाओं की राशि का उपयोग करके एक वृत्त का द्वार है कि चार समूहों को अलग भूखंड पर (चित्रा 3): 1) एक PI सकारात्मक और fitc-PSA सकारात्मक समूह: अग्रपिंडक प्रतिक्रिया व्यक्त nonviable शुक्राणु कोशिकाओं; 2) एक PI नकारात्मक और fitc-पीएसए सकारात्मक समूह: acrosome व्यवहार्य शुक्राणु कोशिकाओं प्रतिक्रिया व्यक्त; 3) एक PI सकारात्मक और fitc-पीएसए नकारात्मक समूह: acrosome बरकरार nonviable शुक्राणु कोशिकाओं; और 4) एक PI नकारात्मक और fitc-पीएसए नकारात्मक समूह: acrosome अक्षुण्ण व्यवहार्य शुक्राणु कोशिकाओं ।

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Representative Results

एक प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम परीक्षण 4 यौगिकों के प्रभाव (ए, बी, सी, और डी) एक सकारात्मक के साथ (प्रोजेस्टेरोन) और नकारात्मक (बफर) पर नियंत्रण [ca2 +]मैं मानव शुक्राणु में माध्यम का उपयोग कर-throughput Ca2 +-सिग्नलिंग परख चित्रा 4aमें देखा जा सकता है । चित्र 4bमें, प्रोजेस्टेरोन की एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र दिखाई गई है, जो पीक δ f/f0 (%) प्रश्नपत्र द्वारा प्रेरित डेटा प्रोजेस्टेरोन के पतला सांद्रता, एक और प्रयोग में परीक्षण किया मध्यम throughput Ca 2 का उपयोग कर+-संकेतन परख । Ca से डेटा का विश्लेषण2 +-संकेतन परख चरण 5 में समझाया गया है । एक प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम एक नकारात्मक नियंत्रण (dmso) या दो सकारात्मक नियंत्रण (प्रोजेस्टेरोन और ionomycin) पर मध्यम throughput अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख कर सकते है का उपयोग कर मानव शुक्राणु कोशिकाओं को सक्रिय में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया का प्रेरण परीक्षण चित्रा 3के शीर्ष पैनल में देखा जा सकता है । क्वाड्रेंट gated 3 परीक्षण शर्तों से तितर बितर भूखंडों देखा जाता है । अग्रपिंडक प्रतिक्रिया डेटा का विश्लेषण चरण 7 में समझाया गया है ।

तालिका 1: htf की तैयारी के लिए स्टॉक समाधान + . स्टॉक समाधान रखा जा सकता है और समय की लंबी अवधि के लिए पुन: उपयोग, ग्लूकोज और-20 ° c और कमरे के तापमान पर अंय शेयर समाधान hepes । सुनिश्चित करें कि सभी समाधान पूरी तरह से भंग और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाया जाता है ।

तालिका 2: htf की तैयारी + 4 या 25 मिमी hco के साथ 3 - लवण के स्टॉक समाधान (तालिका 1 में तैयार) से । ना-लैक्टेट सिरप, ६०% (w/w), या पाउडर के रूप में जोड़ा जा सकता है । नहको3 पाउडर के रूप में जोड़ा जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: तैरना-गतिशील मानव शुक्राणु कोशिकाओं की शुद्धि । बाएँ: htf+ मध्यम और htf+ माध्यम से नीचे एक लिक्विफाइड वीर्य नमूना pipetted के एक aliquot के साथ ट्यूब. सही: तैरने के 1 एच के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर, गतिशील शुक्राणु कोशिकाओं htf में swum+ मध्यम है । immotile और मृत शुक्राणु कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर शुक्राणु कोशिकाओं htf+ मध्यम नीचे वीर्य में रहते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: माध्यम का आरेख-throughput Ca2 +-संकेतन परख । (क) शुक्राणु कोशिकाओं को एक Ca के साथ लोड कर रहे हैं2 +-संवेदनशील फ्लोरोफोर, धोया और aliquots एक ३८४-कुआं थाली के कुओं को चढ़ाया जाता है. (ख) ३८४-कूप प्लेट 30 ° सेल्सियस पर प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में स्थित है । (ग) प्रतिदीप्ति यौगिकों, सकारात्मक नियंत्रण (प्रोजेस्टेरोन) और नकारात्मक नियंत्रण (वाहन के साथ बफर) के अलावा पहले और बाद में दर्ज की गई है । में readouts δ f/एफ0 (%) इसके अलावा नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के (तीर) के नीचे (ग) में सचित्र हैं । ईसाई schiffer से अनुमति के साथ प्रयोग किया उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: छवि cytometry का उपयोग कर अग्रपिंडक प्रतिक्रिया का आकलन । (शीर्ष पैनल) क्वाड्रेंट एक नकारात्मक वाहन नियंत्रण (dmso), और सकारात्मक नियंत्रण प्रोजेस्टेरोन (ठेला, 10 μm) और ionomycin (iono, 2 μm) से gated तितर बितर भूखंडों । कम सही वृत्त का चक्र में कोशिकाओं में एक वृद्धि (acrosome व्यवहार्य कोशिकाओं प्रतिक्रिया) dmso नियंत्रण करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण की तुलना करते समय देखा जाता है. (नीचे पैनल) प्रतिदीप्ति की सूक्ष्म छवियों शुक्राणु कोशिकाओं लेबल, सभी चार समूहों से कोशिकाओं सहित. BF = उज्ज्वल क्षेत्र, hoechst = hoechst-३३३४२, PSA = पिसम sativum agglutinin, PI = प्रोपिडियम आयोडाइड. स्केल बार = 10 μm । यह आंकड़ा egeberg palme एट अल. २०१८7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Ca से डेटा का उदाहरण2 +-fluorimetry. (a) में परिवर्तन [Ca2 +]मैं नकारात्मक नियंत्रण से प्रेरित, प्रोजेस्टेरोन और यौगिक ए, बी, सी, और डी (बी) प्रोजेस्टेरोन खुराक-प्रतिक्रिया वक्र. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

मध्यम प्रवाह Ca2 + संकेतन परख एकल microwells प्रत्येक २५०,००० शुक्राणु कोशिकाओं के बारे में युक्त से प्रतिदीप्ति के मापन पर आधारित है । कब्जा कर लिया संकेत अच्छी तरह से सभी व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं से औसत है । परख इस प्रकार के बारे में कोई स्थानिक जानकारी प्रदान करता है, जहां विशेष रूप से शुक्राणु सेल में [ca2 +]मैं बदल गया है, कैसे शुक्राणु कोशिकाओं के एक अनुपात में [ca 2 में एक परिवर्तन+]मैं जगह लेता है, या कैसे विषम प्रतिक्रिया है व्यक्तिगत कक्षों के बीच । ऐसी जानकारी प्राप्त करने के लिए, एकल कक्ष रिज़ॉल्यूशन के साथ प्रयोग (उदा.,५०,५२में बताए गए अनुसार) नियोजित किए जाने चाहिए. तकनीक का एक और दोष अस्थायी संकल्प है, जो सेकंड के आदेश पर है. भले ही ५० μl शुक्राणु नमूने अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं जब समाधान के 25 μl जोड़ रहे हैं, माप पहले मल्टी-वेल प्लेट के साथ दराज के बाद शुरू किया जा सकता है प्रतिदीप्ति थाली पाठक के अंदर वापस आ गया है. उच्च अस्थाई संकल्प प्राप्त करने के लिए, अंय तकनीकों (उदाहरण के लिए, एक बंद प्रवाह fluorimetry13,५०) नियोजित किया जाना चाहिए । मध्यम throughput Ca 2 का लाभ+-संकेतन परख, एकल सेल या एक अच्छी तरह से तरीकों की तुलना में है कि एक microwells पाठक का उपयोग एकाधिक microwells के एक साथ माप के लिए अनुमति देता है तेजी से और कई के आसान परीक्षण सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ-साथ यौगिकों (चित्रा 4)1, 2, खुराक की आसान पीढ़ी-व्यक्तिगत यौगिकों की प्रतिक्रिया घटता (चित्रा 4)1,2,3 , 4 , 5, दो या अधिक यौगिकों के लिए योज्यता1,2 और synergism3 का आकलन, साथ ही साथ यौगिकों की कार्रवाई के मोड के अध्ययन हालांकि प्रतिस्पर्धी निषेध प्रयोगों और विशिष्ट का उपयोग औषधीय inhibitors (जैसे, catsper inhibitors1,2,3,4,5) । इसके अलावा, फ्लोरोफोर बदलने से, परख अंय इंट्रासेलर परिवर्तन (जैसे, पीएचमैं1,2) की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है । अंत में, एक से अधिक फ्लोरोफोर एक साथ कई इंट्रासेलुलर परिवर्तन को मापने के लिए एक बार में इस्तेमाल किया जा सकता है । भविष्य में, मध्यम throughput ca2 +-संकेतन परख ca पर प्रभाव के लिए ब्याज की स्क्रीन यौगिकों का इस्तेमाल किया जा सकता है2 +-मानव शुक्राणु में संकेतन (जैसे, पर्यावरण रसायन या दवा उंमीदवारों) संभावित प्रतिकूल जांच करने के लिए मानव शुक्राणु सेल समारोह पर प्रभाव या एक गर्भनिरोधक के रूप में एक संभावित भूमिका की जांच करने के लिए ।

मध्यम थ्रप्ट अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख छवि cytometry पर आधारित है, जो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मैनुअल मूल्यांकन की तुलना में मानव अग्रपिंडक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक आकर्षक विकल्प का गठन किया है । अक्षुण्ण या प्रतिक्रिया के अभिरंजक पैटर्न हमेशा स्पष्ट नहीं हैं, और एक महान अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता इसके परिणाम हो सकते हैं । छवि cytometry के साथ, छवियों का अधिग्रहण और स्वचालित रूप से विश्लेषण कर रहे हैं । मास्किंग चैनल, इस मामले में hoechst-३३३४२, कोशिकाओं को परिभाषित करता है और इन विशिष्ट क्षेत्रों से केवल फ्लोरोसेंट संकेतों डेटा विश्लेषण में शामिल हैं । इसलिए, अवशिष्ट साइटोप्लाज्म युक्त शरीर को धुंधला करना डेटा विश्लेषण में शामिल नहीं है । इसके अलावा, आँकड़े गिनती प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से बेहतर है. सूक्ष्मदर्शी की दूरबीन के माध्यम से २०० कोशिकाओं की गणना करना एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला कार्य है लेकिन छवि कोशिकामिति के साथ कम से ५,००० कोशिकाओं का विश्लेषण कुछ मिनट से भी कम लेता है. हालांकि, छवि cytometer की कम इज़ाफ़ा के कारण, माप का मूल्यांकन करने की क्षमता खो दिया है और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए दाग नमूना लाना होगा । इसलिए, माप को मान्य करने के लिए नियंत्रणों का समावेश सबसे अधिक महत्व का है । नियंत्रण अपेक्षानुसार प्रतिक्रिया नहीं करते हैं, तो एक experiment से परिणाम छोड़ दिया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल यहां वर्णित zoppino एट अल.४९, जो प्रवाह cytometry द्वारा मानव अग्रपिंडक प्रतिक्रिया मूल्यांकन द्वारा किए गए काम से प्रेरित था । वे आगे वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्णित कैसे पीएसए acrosomal डिब्बे में प्रवेश करती है जब झिल्ली-फ्यूजन pores अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के प्रेरण पर दिखाई देते हैं. एक बार acrosomal डिब्बे के अंदर, पीएसए मोज़री और समय की लंबी अवधि के लिए एक निशान स्थिर रूपों । कोई निर्धारण या permeabilization प्रोटोकॉल में लागू किया जाता है और इसलिए परिणाम की व्याख्या स्पष्ट है: एक व्यवहार्य शुक्राणु कोशिका के acrosomal डिब्बे के अंदर पीएसए अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के बराबर होती है. Ca 2 के लिए के रूप में+-संकेतन परख, अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख भी खुराक का आकलन किया जा सकता है-प्रतिक्रिया घटता, निषेध, additivity, और ब्याज के यौगिकों के synergism. भविष्य में, मध्यम थ्रोपुट अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख भी अग्रपिंडक प्रतिक्रिया मानव शुक्राणु पर प्रभाव के लिए ब्याज की स्क्रीन यौगिकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, पर्यावरण रसायन या दवा उंमीदवारों) इस मानव पर संभावित प्रतिकूल प्रभाव की जांच करने के लिए शुक्राणु कोशिका फलन या गर्भनिरोधक के रूप में संभावित भूमिका की जांच करना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों एआर और डले के पर्यवेक्षण के लिए टिमो strünker की प्रयोगशाला अपनी प्रयोगशाला में अपने रहता है के दौरान स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम विकास और प्रजनन के विभाग में हमारे सहयोगियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय अस्पताल, इन दो assays स्थापित करने के साथ उनकी सहायता के लिए rigshospitalet । इस काम को नवाचार कोष डेनमार्क (अनुदान संख्या 005-2010-3 और 14-2013-4) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

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जीव विज्ञान अंक १४५ शुक्राणु वीर्य कैटस्पर कैल्शियम acrosome प्रजनन क्षमता
Ca पर प्रभाव के आकलन के लिए मध्यम throughput स्क्रीनिंग assays<sup>2 +</sup>-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में acrosome प्रतिक्रिया
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L.,… More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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