Vi præsenterer en protokol til at bestemme den optimale ekstraktionsmiddel til at måle cortisol fra Koala pels. De opløsningsmidler, der anvendes i denne protokol, er methanol, ethanol og isopropanol. Bestemmelse af en optimal ekstraktionsmiddel vil støtte i pålideligt måling af pels til at bestemme virkningen af kronisk stress på Koalas.
Optimale metoder til hormon ekstraktion bruges til at måle stress i dyr på tværs af prøvetyper er ikke altid de samme. Australiens ikoniske pungdyr arter, Koala (phascolarctos cinereus), står over for langvarig udsættelse for antropogene inducerede stressorer og vurdering af kronisk stress i vilde populationer er presserende berettiget. En af de mest effektive måder at måle kronisk stress er gennem analyse af glukokortikoidhormonet cortisol i hår eller pels, da det understøtter fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner. Dette laboratorium validering undersøgelse har til formål at teste nuværende teknikker til at validere en optimal hormon udvinding metode, der skal anvendes som en ikke-invasiv måling af cortisol i Koala pels. Det erkendes, at ved hjælp af ikke-invasive teknikker til at måle stresshormoner foretrækkes frem for traditionelle, invasive teknikker på grund af deres ideelle praktiske og etiske standpunkter. Desuden er det forholdsvis lettere at erhverve pels fra Koalas end det er at erhverve prøver af deres blod. Denne undersøgelse brugte prøver af Koala pels erhvervet fra Adelaide Koala og Wildlife Hospital til at køre en række hormon udvinding teknikker i et forsøg på at validere en optimal cortisol udvinding metode. Resultaterne viste, at 100% methanol gav den mest optimale solventekstraktion sammenlignet med 100% ethanol eller 100% isopropanol baseret på parallelitet resultater. Afslutningsvis, denne metode til cortisol udvinding fra Koala pels forudsat en pålidelig ikke-invasiv analyse, der kunne bruges til at studere kronisk stress i Koalas.
Australske økosystemer opretholder menneskeliv gennemleve ring af tjenester, herunder mad og fiber blandt mange andre dynamiske interaktioner1. Ironisk nok er det menneskelig aktivitet, der fungerer som den dominerende drivkraft for økosystem forstyrrelser gennem biodiversitets ændringer2. Fragmentering af levesteder, kendt som processen med at opdele store kontinuerlige habitater i små jord pletter, isoleret fra hinanden, er den største antropogene biodiversitet forandring truer australske økosystemer2. Fragmentering af levesteder ændrer strukturen og mangfoldigheden af artssammensætning i et givet område og mindsker dermed det område af habitat, som er nødvendigt for at opretholde levedygtige populationer2. Resultatet af dette er øget konkurrence mellem arter for ressourcer, herunder fødevarer, brændstof, fiber, og vand3. Ødelæggelsen af australske økosystemer gennem ændringer i biodiversiteten har katastrofale konsekvenser for mange australske indfødte arter1.
Australiens mest ikoniske pungdyr arter, Koala (phascolarctos cinereus), afhænger af australske økosystemer forbliver sunde for deres overlevelse4. Indførelsen af den europæiske bosættelse forårsagede en hurtig nedgang i de australske befolkninger i Koalas, da de blev slagtet for deres skind i jagten på profit i en stor eksporthandel5. Denne praksis blev forbudt i 1980 ‘ er og populationer af Koalas var derefter i stand til at stabilisere5. Men eksponentiel vækst i den menneskelige befolkning har resulteret i denne art konkurrerer om en stor del af deres habitat, og deres overlevelse er igen under trussel6. Ifølge den internationale Union for naturbevaring (IUCN), alle populationer af australske Koalas er opført som sårbare over for udryddelse med en faldende befolknings tendens7. Denne fortegnelse tilskrives usikkerheden omkring relevante populations parametre og markante variationer i befolknings tendenserne for denne art7. Som de mest ikoniske og endemiske dyr, Koalas stort set gavne den australske økonomi gennem turisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Et skøn tyder på, at Koala relaterede turisme har genereret ca 9.000 job og bidrager mellem $1,1 og $2.500.000.000 til økonomien (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Fjernelsen af en art har potentialet til at være katastrofal, og kan ses i den stadige nedgang i indfødte australske dyreliv6. Desuden, Australien økonomi vil føle forgreninger hvis populationer af australske Koalas fortsætte med at falde med den sats, de er6.
Det foreslås, at forekomsten af død og sygdom som følge af fragmentering af levesteder er resultatet af kronisk stress8. Allerede, fireogtyve pungdyr arter er blevet erklæret uddøde i Australien på grund af habitatfragmentering, med Koalas efter en lignende tendens8. Kompleksiteten af habitatfragmentering og biologiske systemer er synergistisk, men kan pakkes ud gennem analyse af stress respons6. Generelt, enhver forstyrrelse i et dyr naturlige omgivelser aktiverer en kompleks kaskade af Neuro hormonelle begivenheder, kendt som en ‘ Fight eller Flight ‘ svar9,10. Denne reaktion på stress er en proces, der begynder i hjernen, hvor hypothalamus-hypofyse-adrenal (HPA) akse er aktiveret11. En komponent i hjernen kaldes hypothalamus frigiver kortikotropin-releasing hormon (CRH), som derefter signalerer den forreste hypofyse til frigivelse adrenocorticotrophic hormon (ACTH)11. Dette stimulerer igen glukokortikoid sekretionen fra binyre medulla. Kroppen cirkulerer glukokortikoider gennem blodet, som afledes lagring af glucose fra glykogen og mobiliserer glukose fra lagret glykogen11. Denne kaskade af Neuro hormonelle begivenheder er det svar, der anvendes af dyret til at beskæftige sig med uforudsigelige stimuli11. Men, når glukokortikoider frigives og forblive forhøjet i en længere periode, dyret anses for at være oplever kronisk stress12,13. Denne proces indebærer at omdirigere energi væk fra andre korporal kropsfunktioner, da det er nødvendigt for løbende glukokortikoid produktion13. Som et resultat, kronisk stress kan forbyde vækst, reproduktion og immunitet, alle er vigtige fitness egenskaber kræves for overlevelse14.
Måling af et dyrs glukokortikoidproduktion er en fælles indikator, der anvendes til at bestemme, om dyret oplever fysiologisk stress15. For at gøre dette kan glukokortikoider måles i blodplasma, serum, spyt, urin eller fæces16. Men, tyder på, at hår er en langt mere effektiv indikator for kronisk stress, i modsætning til de førnævnte16. Dette skyldes, at håret menes at indarbejde blod-bårne hormoner i sin vækstfase; Det er relativt stabilt; og enhver cortisol detekteret i håret afspejler fysiologiske stress oplevet i perioden med hårvækst, som kan være uger frem til måneder16. Desuden bør enhver samling af cortisol være ikke-invasiv for at minimere stress i forbindelse med opsamling og håndtering16. Men, enhver stress oplevet under denne begivenhed ville ikke påvirke glukokortikoid niveauer i hår16. Der har været mange undersøgelser, der udforsker færdighed i at bruge hår til at måle langsigtet stress i en række dyr, og omfatter undersøgelser af rensdyr, Grizzly bjørne, rhesus aber, moskus og brune bjørne17,18, 19 , 20 , 21. hår cortisol er normalt udvindes ved første vask prøven for at sikre sved og sebum-afledte cortisol deponeret på overfladen af håret er ikke Co-ekstraheret med cortisol og derefter pulveriserer prøven i en perle-beater22. Efter vask skal prøven tørres for at sikre fuldstændig fordampning22. Endelig, ved hjælp af et opløsningsmiddel, kan prøven ekstraheres og rekonstitueres for at lette analysen af cortisol22. Det mest almindelige opløsningsmiddel, der anvendes til at udtrække cortisol fra pels, er methanol21,23; Men, der er nogle undersøgelser, der bruger ethanol og isopropanol i deres cortisol udvinding teknikker. For eksempel, en undersøgelse, der brugte ethanol var en succes for udvinding cortisol fra Human amniotisk væske24. Desuden, en undersøgelse, der anvendes isopropanol var en succes for udvinding cortisol fra menneskehår og negle25,26. Af denne grund testede denne undersøgelse alle tre opløsningsmidler (methanol, ethanol og isopropanol) for at afgøre, hvilken var den mest vellykkede til ekstraktion af cortisol fra prøver af Koala pels.
Det primære formål med denne undersøgelse var at bruge nuværende teknikker til at validere en optimal hormon udvinding teknik, der skal anvendes som en ikke-invasiv måling af cortisol fra Koala pels. Dette blev opnået ved at afprøve tre ekstraktionsmidler (methanol, ethanol og isopropanol). Vi hypotese, at methanol vil være den optimale opløsningsmiddel, der anvendes til udvinding cortisol fra Koala pels, fordi det er den anbefalede opløsningsmiddel af ekstraktion af Arbor assay cortisol kits27.
Der er en række undersøgelser, der bruger en række teknikker til at detektere cortisol i pattedyrs pels. Denne undersøgelse præsenterer resultater for påvisning af cortisol i pels indsamlet fra en vild Koala udsat for nuværende antropogene stress. Denne banebrydende undersøgelse brugte pels til at teste, hvilke af de tre almindeligt anvendte opløsningsmidler er bedst til at udtrække cortisol, et mål af kronisk stress, fra Koala pels. Resultaterne viste, at 100% methanol var det anbefalede opløsningsmiddel til…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet gennem opstart forskningsstøtte til Edward Narayan gennem Western Sydney University, School of Science and Health. Forfatterne takker Jack Nakhoul for hjælp til prøve behandling.
Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |