Summary

コアラでのコルチゾール測定(ファスコラルコトス・シネレウス)毛皮

Published: August 23, 2019
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Summary

コアラ毛からコルチゾールを測定する最適な抽出溶媒を決定するプロトコルを提示する.このプロトコルで使用される溶媒は、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールである。最適な抽出溶媒を決定することは、コアラに対する慢性ストレスの影響を決定するために毛皮を確実に測定するのに役立ちます。

Abstract

サンプルタイプ全体の動物のストレスを測定するために使用されるホルモン抽出の最適な方法は、常に同じではありません。オーストラリアの象徴的なマルシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、人為的に誘発されたストレスに長時間さらされ、野生集団における慢性ストレスの評価が緊急に保証されている。慢性ストレスを測定する最も効果的な方法の一つは、生理的および行動的応答をサポートするように、髪や毛皮のグルココルチコイドホルモンコルチゾールを分析することです。本研究室の検証研究は、コアラ毛皮におけるコルチゾールの非侵襲的尺度として使用される最適なホルモン抽出方法を検証するための現在の技術をテストすることを目的としています。ストレスホルモンを測定するために非侵襲的な技術を使用することは、彼らの理想的な実用的かつ倫理的な観点による伝統的な侵襲的な技術よりも好ましいことが認識されています。さらに、コアラから毛皮を採取する方が、血液のサンプルを採取するよりも比較的簡単です。本研究では、アデレードコアラと野生動物病院から取得したコアラ毛皮のサンプルを用いて、最適なコルチゾール抽出法を検証するために、多くのホルモン抽出技術を実行した。結果は、100%メタノールが並列性結果に基づいて100%エタノールまたは100%イソプロパノールと比較して最も最適な溶媒抽出を提供することを示した。結論として、コアラファーからのコルチゾール抽出のこの方法は、コアラの慢性ストレスを研究するために使用することができる信頼性の高い非侵襲的アッセイを提供しました。

Introduction

オーストラリアの生態系は、他の多くの動的相互作用の中で食物や繊維を含むサービスの提供を通じて人間の生活を維持します 1.皮肉なことに、生物多様性の変化を通じた生態系破壊の主な原動力として機能しているのは人間の活動です2。生息地の断片化は、大きな連続的な生息地を互いに隔離された小さな土地のパッチに分割するプロセスとして知られており、オーストラリアの生態系を脅かす大きな人為的生物多様性変化2である。生息地の断片化は、任意の領域における種組成の構造と多様性を変更し、したがって、これらの種が生存可能な集団維持するために必要な生息地の面積を減少させる2.この結果、食料、燃料、繊維、水3を含む資源の種間の競争が激化しています。生物多様性の変化によるオーストラリアの生態系の破壊は、多くのオーストラリアの在来種1に壊滅的な影響を及ぼしている。

オーストラリアで最も象徴的なマーシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、オーストラリアの生態系が生存のために健全なままにしている4に依存している。ヨーロッパの入植地の導入は、彼らが大規模な輸出貿易5で利益を追求するために彼らの毛皮のために虐殺されたので、コアラのオーストラリアの人口の急速な減少を引き起こしました。この慣行は1980年代に禁止され、コアラの集団はその後5を安定させることができました.しかし、人間の人口の指数関数的な成長は、この種が彼らの生息地の多くを競い合う結果となり、その生存は再び脅威6の下にあります。国際自然保護連合(IUCN)によると、オーストラリアのコアラのすべての集団は、人口減少傾向7で絶滅の危機に瀕していると記載されています。このリストは、関連する集団パラメータに関する不確実性と、この種7の人口動向の顕著な変動に起因する。最も象徴的で風土的な動物として、コアラは観光を通じてオーストラリア経済に大きな利益を与えます(NSW環境遺産局2018)。推定によると、コアラ関連の観光業は約9,000人の雇用を生み出し、1.1~25億ドルの経済に貢献している(NSW環境遺産局2018)。任意の1種の除去は壊滅的になる可能性があり、オーストラリア原産の野生生物6の着実な減少に見ることができます。さらに、オーストラリアのコアラの人口が6歳のペースで減少し続けると、オーストラリア経済は影響を感じるだろう。

生息地の断片化に対する死亡および疾患の有病率は、慢性ストレス8の結果であることが示唆される。すでに、オーストラリアでは生息地の断片化により24種が絶滅したと宣言されており、コアラも同様の傾向従っている8。生息地の断片化と生物学的システムの複雑さは相乗的であるが、応力応答6の分析を通じて解凍することができる。一般的に、動物の自然環境におけるあらゆる妨害は、「戦いまたは飛行」応答9、10として知られている神経ホルモン事象の複雑なカスケードを活性化する。ストレスに対するこの応答は、視床下部下垂体副腎(HPA)軸が活性化される脳で始まるプロセスである 11.視床下部と呼ばれる脳の成分は、コルチコトロフィン放出ホルモン(CRH)を放出し、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)11を放出するために前下垂体に信号を送る。これは順番に副腎髄質からのグルココルチコイド分泌を刺激する。体は血液を通してグルココルチコイドを循環し、これはグリコーゲンからグルコースの貯蔵をそらし、貯蔵されたグリコーゲン11からグルコースを動員する。神経ホルモンイベントのこのカスケードは、予測不可能な刺激11に対処するために動物によって使用される応答である。しかし、グルココルチコイドが放出され、長期間上昇したままである場合、動物は慢性的なストレス12、13を経験していると考えられる。このプロセスは、進行中のグルココルチコイド生産13に必要とされる他の体の機能からエネルギーをそらすことを含む。その結果、慢性的なストレスは、成長、生殖および免疫を禁止することができ、すべてが生存14に必要な主要なフィットネス特性である。

動物のグルココルチコイド産生を測定することは、動物が生理的ストレスを経験しているかどうかを決定するために使用される一般的な指標である15。そうするために、グルココルチコイドは、血漿、血清、唾液、尿または気管16で測定することができる。しかし、証拠は、前述の16とは対照的に、髪が慢性ストレスのはるかに効果的な指標であることを示唆している。これは、髪は、その成長段階の間に血液媒介ホルモンを組み込むと考えられているためです。それは比較的安定しています。そして、髪の中で検出されたコルチゾールは、髪の成長の期間にわたって経験した生理的ストレスを反映し、それは16ヶ月まで数週間することができます。さらに、コルチゾールの任意のコレクションは、捕捉および取り扱いに関連するストレスを最小限に抑えるために非侵襲的であるべきである16.しかし、このイベント中に経験したストレスは、毛髪16のグルココルチコイドレベルに影響を与えないだろう。多くの動物の長期的なストレスを測定するために髪を使用する能力を探求し、トナカイ、グリズリークマ、カゲザル、マスキセン、およびヒグマ17、18、ヒグマ関する研究を含む多くの研究があります。19歳,20歳,21.毛髪コルチゾールは、通常、毛髪の表面に付着した汗および皮脂由来のコルチゾールがコルチゾールと共抽出されず、ビーズビーター22でサンプルを粉砕することを確実にするために試料を最初に洗浄することによって抽出される。洗浄後、サンプルは完全な蒸発22を確実にするために乾燥する必要があります。最後に、溶媒を用いて、試料を抽出し、コルチゾール22のアッセイを容易にするために再構成することができる。毛皮からコルチゾールを抽出するために使用される最も一般的な溶媒は、メタノール21、23です。しかし, 彼らのコルチゾール抽出技術でエタノールとイソプロパノールを使用するいくつかの研究があります。.例えば、エタノールを用いたした研究は、ヒト羊水24からコルチゾールを抽出することに成功した。さらに、イソプロパノールを用いたした研究は、ヒトの毛髪および爪からコルチゾールを抽出することに成功した25,26.このため、本研究では、コアラファーのサンプルからコルチゾールを抽出するのに最も成功した3つの溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール)をすべて試験した。

本研究の主な目的は、コアラの毛皮からのコルチゾールの非侵襲的尺度として使用される最適なホルモン抽出技術を検証するために現在の技術を使用することでした。これは、3つの抽出溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール)を試験することによって達成された。我々は、メタノールがコアラファーからコルチゾールを抽出するのに使用される最適な溶媒であると仮定した。

Protocol

このプロジェクトは、厳格な動物と人間のケアガイドラインの下で行われました。動物倫理は、西シドニー大学(A12373)によって付与されました。さらに、この研究を安全に行うために、ウェスタンシドニー大学によってラボリスク評価とバイオセーフティおよび放射線フォームが提出され、受け入れられました(B12366)。 注:このプロジェクトのコアラ毛皮サンプルは、282ア…

Representative Results

目的のホルモン代謝産物のアッセイ検出は並列処理を用いて決定される。並列化曲線を使用して、50% 結合点は、標準曲線上のサンプル希釈係数も決定します (図1)。並列化グラフ(図1)に示すように、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物は、コルチゾール標準に対する並列変位を提供しなかった。しかしながら、100%メタノール抽出物は、コルチゾール標準?…

Discussion

哺乳類の毛皮でコルチゾールを検出する技術の範囲を使用する研究の数があります。.本研究は、現在の人為的ストレスにさらされた野生のコアラから採取した毛皮中のコルチゾールの検出に関する結果を提示する。この画期的な研究では、一般的に使用される3つの溶媒のうち、コアラの毛皮から慢性ストレスの尺度であるコルチゾールを抽出するのに最適な方法をテストするために毛皮を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、西シドニー大学、科学衛生学部を通じてエドワード・ナラヤンのスタートアップ研究資金を通じて支援されました。著者は、サンプル処理の支援のためにジャック・ナクールに感謝します。

Materials

Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World’s Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

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Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

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