Vi presenterar ett protokoll för att bestämma den optimala extraktionsmedel för att mäta kortisol från Koala päls. De lösningsmedel som används i detta protokoll är metanol, etanol och isopropanol. Bestämning av en optimal extraktion lösningsmedel kommer att hjälpa till att tillförlitligt mäta päls för att avgöra effekterna av kronisk stress på Koalas.
Optimala metoder för hormon utvinning används för att mäta stress hos djur över provtyper är inte alltid desamma. Australiens ikoniska pungdjur arter, Koala (Phascolarctos cinereus), ansikten långvarig exponering för antropogena-inducerad stressorer och bedömning av kronisk stress i vilda populationer är brådskande motiverad. Ett av de mest effektiva sätten att mäta kronisk stress är genom att analysera glukokortikoidhormonet kortisol i hår eller päls, eftersom det stöder fysiologiska och beteendemässiga svar. Detta laboratorium validering studie syftar till att testa nuvarande tekniker för att validera en optimal hormon utvinning metod som ska användas som en icke-invasiv åtgärd av kortisol i Koala päls. Det är erkänt att använda icke-invasiva tekniker för att mäta stresshormoner är att föredra framför traditionella, invasiva tekniker på grund av deras ideala praktiska och etiska ståndpunkter. Dessutom är det jämförelsevis lättare att förvärva päls från Koalas än det är att förvärva prover av deras blod. Denna studie används prover av Koala päls förvärvas från Adelaide Koala och Wildlife Hospital för att köra ett antal tekniker hormon utvinning i ett försök att validera en optimal kortisol extraktionsmetod. Resultaten visade att 100% metanol gav den mest optimala vätskeextraktion jämfört med 100% etanol eller 100% isopropanol baserat på parallellitet resultat. Sammanfattningsvis, denna metod för kortisol utvinning från Koala päls som en pålitlig icke-invasiv analys som kan användas för att studera kronisk stress i Koalas.
Australiska ekosystem upprätthålla mänskligt liv genom tillhandahållande av tjänster, inklusive mat och fiber bland många andra dynamiska interaktioner1. Ironiskt nog är det mänsklig verksamhet som fungerar som den dominerande föraren av ekosystem störningar genom biologisk mångfald förändring2. Habitat fragmentering, känd som processen att dela upp stora sammanhängande livsmiljöer i små fläckar av mark, isolerade från varandra, är den stora antropogena biologiska mångfalden förändring hotar australiska ekosystem2. Fragmentering av livsmiljöer förändrar strukturen och mångfalden av artsammansättningen i ett visst område, vilket minskar det område av livsmiljö som behövs för dessa arter för att bibehålla livskraftiga populationer2. Resultatet av detta är ökad konkurrens mellan arter för resurser, inklusive mat, bränsle, fiber och vatten3. Förstörelsen av australiska ekosystem genom förändring av den biologiska mångfalden har katastrofala följder för många australiska inhemska arter1.
Australiens mest ikoniska pungdjur arter, Koala (Phascolarctos cinereus), beror på australiska ekosystem förbli friska för sin överlevnad4. Införandet av den europeiska bosättningen orsakade en snabb nedgång i australiska populationer av koalaer, eftersom de slaktades för sina skinn i jakten på vinst i en stor export handel5. Detta övar förbjöds i 1980talet, och befolkningar av Koalas var därefter kompetent att stabilisera5. Emellertid, exponentiell tillväxt av den mänskliga befolkningen har resulterat i denna art konkurrerar om mycket av sin livsmiljö, och deras överlevnad är återigen under hot6. Enligt internationella naturvårdsunionen (IUCN) är alla populationer av australiska Koalas listade som sårbara för utrotning med en minskande befolknings trend7. Denna förteckning tillskrivs osäkerheten kring relevanta populations parametrar och markant variation i befolkningsutvecklingen för denna art7. Som den mest ikoniska och endemiska djur, Koalas gynnar till stor del den australiska ekonomin genom turism (NSW Office of Environment och Heritage 2018). En uppskattning tyder på att Koala relaterad turism har genererat cirka 9 000 arbetstillfällen och bidrar mellan $1,1 och $2 500 000 000 till ekonomin (NSW Office of Environment och Heritage 2018). Avlägsnandet av en art har potential att vara katastrofal, och kan ses i stadig nedgång av infödda australiska djurliv6. Dessutom kommer Australiens ekonomi känna förgreningar om populationer av australiska Koalas fortsätter att sjunka i den takt de är6.
Det föreslås att prevalensen av död och sjukdom som svar på Habitat fragmentering är resultatet av kronisk stress8. Redan, tjugofyra pungdjur arter har förklarats utrotade i Australien på grund av habitat fragmentering, med Koalas efter en liknande trend8. Komplexiteten i Habitat fragmentering och biologiska system är synergistisk men kan packas upp genom analys av stress Response6. I allmänhet, alla störningar i ett djur naturliga omgivningar aktiverar en komplex kaskad av neurohormonella händelser, känd som en “kamp eller flykt” svar9,10. Detta svar på stress är en process som börjar i hjärnan där hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axeln aktiveras11. En del av hjärnan som kallas hypotalamus frigör kortikotropinfrisättande hormon (CRH), som sedan signalerar den främre hypofysen att frigöra adrenokortikotrofiska hormon (ACTH)11. Detta i sin tur stimulerar glukokortikoid sekretion från adrenal medulla. Kroppen cirkulerar glukokortikoider genom blodet, som avskiljer lagring av glukos från glykogen och mobiliserar glukos från lagrad glykogen11. Denna kaskad av neurohormonella händelser är det svar som används av djuret för att hantera oförutsägbara stimuli11. Men när glukokortikoider släpps och förblir förhöjda under en längre tid, djuret anses ha drabbats av kronisk stress12,13. Denna process innebär att avstyra energi från andra kroppslig kroppsfunktioner, eftersom det behövs för pågående glukokortikoidproduktion13. Som ett resultat, kronisk stress kan förbjuda tillväxt, reproduktion och immunitet, alla är viktiga Fitness egenskaper som krävs för överlevnad14.
Att mäta ett djurs glukokortikoidproduktion är en vanlig indikator som används för att avgöra om djuret upplever fysiologisk stress15. För att göra detta kan glukokortikoider mätas i blodplasma, serum, saliv, urin eller avföring16. Emellertid, bevis tyder på att hår är en mycket mer effektiv indikator på kronisk stress, i motsats till de ovan nämnda16. Detta beror på att hår tros införliva blodburna hormoner under sin tillväxtfas; Det är relativt stabilt; och alla kortisol upptäcks i håret återspeglar fysiologiska stress upplevt under perioden av hårväxt, som kan vara veckor fram till månader16. Dessutom bör varje samling av kortisol vara icke-invasiv för att minimera stressen i samband med avskiljning och hantering16. Emellertid, någon stress upplevde under denna händelse skulle inte påverka glukokortikoid nivåer i hår16. Det har varit många studier som utforskar kompetensen att använda hår för att mäta långsiktig stress i ett antal djur, och inkluderar studier på renar, grizzlybjörnar, rhesusapor, muskoxen och brunbjörnar17,18, 19 , 20 , 21. hår kortisol extraheras vanligtvis genom att först tvätta provet för att säkerställa svett och talg-härledda kortisol deponeras på ytan av håret inte samextraheras med kortisol och sedan pulverisera provet i en pärla-beater22. Efter tvättning måste provet torkas för att säkerställa fullständig avdunstning22. Slutligen, med hjälp av ett lösningsmedel, provet kan extraheras och beredas för att underlätta analysen av kortisol22. Det vanligaste lösningsmedlet som används för att utvinna kortisol från päls är metanol21,23; emellertid, det finns vissa studier som använder etanol och isopropanol i deras kortisol utvinning tekniker. Till exempel, en studie som används etanol var framgångsrik för att utvinna kortisol från Human fostervatten24. Dessutom, en studie som används isopropanol var framgångsrik för att utvinna kortisol från människohår och naglar25,26. Av denna anledning, denna studie testade alla tre lösningsmedel (metanol, etanol, och isopropanol) för att avgöra vilken var den mest framgångsrika för utvinning av kortisol från prover av Koala päls.
Det primära syftet med denna studie var att använda nuvarande tekniker för att validera en optimal hormon utvinning teknik som ska användas som en icke-invasiv åtgärd av kortisol från Koala päls. Detta uppnåddes genom att testa tre extraktionsmedel (metanol, etanol och isopropanol). Vi hypotes om att metanol kommer att vara den optimala lösningsmedel som används för att utvinna kortisol från Koala päls eftersom det är den rekommenderade lösningsmedlet för utvinning av Arbor assay kortisol Kits27.
Det finns ett antal studier som använder en rad olika tekniker för att detektera kortisol i päls av däggdjur. Denna studie presenterar resultat för detektion av kortisol i päls som samlats in från en vild Koala utsätts för nuvarande antropogena stress. Denna banbrytande studie används päls för att testa vilken av de tre vanliga lösningsmedel är bäst på att utvinna kortisol, ett mått på kronisk stress, från Koala päls. Resultaten visade att 100% metanol var den rekommenderade spädningsvätskan för ko…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes genom start-up forskningsanslag för Edward Narayan genom Western Sydney University, School of Science and Health. Författarna tackar Jack Nakhoul för hjälp med provbehandling.
Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |