Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Koalak'da Kortizol Ölçümü (Phascolarctos cinereus) Kürk

doi: 10.3791/59216 Published: August 23, 2019

Summary

Koala kürkünden kortizol ölçümü için en uygun ekstraksiyon çözücüsünü belirlemek için bir protokol sayılacağız. Bu protokolde kullanılan çözücüler metanol, etanol ve isopropanol'dür. Optimal bir ekstraksiyon çözücü belirlenmesi koalalar üzerinde kronik stresin etkisini belirlemek için güvenilir ölçüm kürk yardımcı olacaktır.

Abstract

Örnek türleri arasında hayvanlarda stresi ölçmek için kullanılan hormon ekstraksiyon optimal yöntemler her zaman aynı değildir. Avustralya'nın ikonik keseli türleri, koala(Phascolarctos cinereus),antropojenik kaynaklı stres ve yabani popülasyonlarda kronik stres indeğerlendirilmesi uzun süreli maruz kalma karşı karşıya acilen garanti edilir. Kronik stresi ölçmenin en etkili yollarından biri, fizyolojik ve davranışsal tepkileri desteklediği için saç veya kürkteki glukokortikoid hormon kortizolünün analizidir. Bu laboratuvar doğrulama çalışması, koala kürkünde kortizolün non-invaziv bir ölçütü olarak kullanılacak optimal hormon ekstraksiyon yöntemini doğrulamak için mevcut teknikleri test etmeyi amaçlamaktadır. Stres hormonlarını ölçmek için non-invaziv teknikler kullanmanın, ideal pratik ve etik bakış açıları nedeniyle geleneksel, invaziv tekniklere tercih olduğu kabul edilmektedir. Ayrıca koalalardan kürk elde etmek kan örneklerinden elde etmekten nispeten daha kolaydır. Bu çalışmada, optimal kortizol ekstraksiyon yöntemini doğrulamak amacıyla bir dizi hormon çıkarma tekniğini çalıştırmak için Adelaide Koala ve Vahşi Yaşam Hastanesi'nden alınan koala kürkü örnekleri kullanılmıştır. Sonuçlar, %100 metanolün paralellik sonuçlarına göre %100 etanol veya %100 izopropanol ile karşılaştırıldığında en uygun çözücü ekstraksiyonu sağladığını göstermiştir. Sonuç olarak, koala kürkkortizol ekstraksiyon bu yöntem koalalarda kronik stres çalışma için kullanılabilecek güvenilir bir non-invaziv bir titret sağladı.

Introduction

Avustralya ekosistemleri diğer birçok dinamik etkileşimlerarasındagıda ve lif dahil olmak üzere hizmetlerin sağlanması yoluyla insan hayatını sürdürmek 1. İronik olarak, biyolojik çeşitlilik değişimi ile ekosistem bozulmasının baskınitici gücü olarak çalışan insan aktivitesidir 2. Habitat parçalanma, arazi küçük yamalar halinde büyük sürekli habitatlar bölme süreci olarak bilinen, birbirinden izole, Avustralya ekosistemleri tehdit eden büyük antropojenik biyoçeşitlilik değişimi2. Habitat parçalanması herhangi bir alandaki türlerin bileşiminin yapısını ve çeşitliliğini değiştirerek, bu türlerin canlı popülasyonları korumak için gerekli olan habitat alanını azaltır2. Bunun sonucu gıda, yakıt, lif vesu3 dahil olmak üzere kaynaklar için türler arasındaki rekabet artmaktadır. Biyolojik çeşitlilik değişimi ile Avustralya ekosistemlerinin imha birçok Avustralya yerlitürler üzerinde felaket sonuçlara sahip 1.

Avustralya'nın en ikonik keseli türler, koala(Phascolarctos cinereus),Avustralya ekosistemleri hayatta kalmak için sağlıklı kalan bağlıdır4. Avrupa Yerleşimi'nin başlatılması koalaavustralya popülasyonlarında hızlı bir düşüşe neden oldu, onlar büyük bir ihracat ticaretikar peşinde kendi pelts için katledildi 5. Bu uygulama 1980'lerde yasaklandı ve koala popülasyonları daha sonra5stabilize başardık. Ancak, insan nüfusunun üstel büyüme bu türün yaşam alanlarının büyük bir kısmı için rekabetsonuçlandı ve hayatta kalmaları yine tehdit altında 6. Uluslararası Doğayı Koruma Birliği'ne (IUCN) göre, Avustralya koalalarının tüm popülasyonları azalan nüfuseğilimi7 ile yok olmaya karşı savunmasız olarak listelenmiştir. Bu liste, ilgili nüfus parametreleri etrafındaki belirsizliğe atfedilirve bu tür için popülasyon eğilimlerinde belirgin bir değişim 7. En ikonik ve endemik hayvanlar olan koalalar, turizm yoluyla Avustralya ekonomisine büyük ölçüde fayda sağlamaktadır (NSW Çevre ve Miras Ofisi 2018). Yapılan tahminlere göre koala turizmi yaklaşık 9.000 kişiye iş sağladı ve ekonomiye 1.1 ila 2.5 milyar dolar arasında katkıda bulundu (NSW Çevre ve Miras Ofisi 2018). Herhangi bir türün kaldırılması felaket olma potansiyeline sahiptir, ve yerli Avustralya yaban hayatı sürekli düşüş görülebilir6. Ayrıca, Avustralya koalalarının popülasyonları6oranında azalmaya devam ederse Avustralya ekonomisi nin sonuçları hissedilecektir.

Habitat parçalanmasına yanıt olarak ölüm ve hastalık prevalansının kronik stresin sonucu olduğu ileri sürülmaktadır8. Zaten, yirmi dört keseli türler avustralya'da habitat parçalanma nedeniyle soyu tükenmiş ilan edilmiştir, koalalar benzer bir eğilim aşağıdaki8. Habitat parçalanma ve biyolojik sistemlerin karmaşıklığı sinerjik ama stres yanıtı analizi ile çözülebilir6. Genellikle, bir hayvan doğal ortamda herhangi bir rahatsızlık nörohormonal olayların karmaşık bir çağlayan aktive, bir 'mücadele veya uçuş' yanıtı olarak bilinen9,10. Strese verilen bu yanıt, hipotalamik-hipofiz-adrenal (HPA) ekseninin aktive edildiği beyinde başlayan bir süreçtir11. Hipotalamus denilen beynin bir bileşeni kortikotrofin salgılayan hormon bültenleri (CRH), daha sonra adrenokortikotrofik hormon serbest bırakmak için ön hipofiz sinyalleri (ACTH)11. Bu da adrenal medulla gelen glukokortikoid salgısını uyarır. Vücut glikoz depolarını glikojenden uzaklaştıran ve glikozu depolanan glikojen11'denharekete geçirerek kan yoluyla glukokortikoidler dolaşır. Nörohormonal olayların Bu çağlayan öngörülemeyen uyaranlar ile başa çıkmak için hayvan tarafından kullanılan tepkidir11. Ancak, glukokortikoidler serbest bırakılır ve uzun bir süre için yüksek kalır, hayvan kronik stres yaşıyor olarak kabul edilir12,13. Bu süreç, devam eden glukokortikoid üretimi için gerekli olduğu gibi, enerjiyi diğer onbaşı bedensel işlevlerden uzaklaştırmayı içerir13. Sonuç olarak, kronik stres büyüme, üreme ve bağışıklık yasaklayabilir, tüm önemli fitness özellikleri hayatta kalmak için gerekli olan14.

Bir hayvanın glukokortikoid üretiminin ölçülmesi, hayvanın fizyolojik stres yaşanıp yaşamadığını belirlemek için kullanılan yaygın bir göstergedir15. Bunu yapmak için, glukokortikoidler kan plazması, serum, tükürük, idrar veya dışkı16ölçülebilir. Ancak, kanıtlar saç kronik stres çok daha etkili bir göstergesi olduğunu göstermektedir, yukarıda belirtilen aksine16. Saç büyüme aşamasında kan yoluyla gelen hormonlar dahil düşünülmektedir olmasıdır; nispeten kararlıdır; ve saçta tespit edilen herhangi bir kortizol, saç büyüme döneminde yaşanan fizyolojikstresi yansıtır, bu da haftalar ile 16 ay arasında olabilir. Ayrıca, kortizol herhangi bir koleksiyon yakalama ve 16 işleme ile ilişkilistresi en aza indirmek için non-invaziv olmalıdır. Ancak, bu olay sırasında yaşanan herhangi bir stres saç glukokortikoid düzeylerini etkilemez16. Hayvanların bir dizi uzun vadeli stres ölçmek için saç kullanma yeterliliğini keşfetmek birçok çalışma olmuştur, ve ren geyiği üzerinde çalışmalar dahil, boz ayılar, rhesus maymunlar, muskoxen, ve kahverengi ayılar17,18, 19.09.20 , 20.000 , 21. Saç kortizol genellikle saç yüzeyinde biriken ter ve sebum türetilmiş kortizol sağlamak için ilk örnek yıkanarak ayıklanır co-kortizol ile ayıklanırve daha sonra bir boncuk-beater 22 örnek pulverizing değildir. Yıkandıktan sonra, numunenin tam buharlaşma sağlamak için kurutulması gerekir22. Son olarak, bir çözücü kullanılarak, numune ayıklanabilir ve kortizol 22tsay kolaylaştırmak için yeniden oluşturulabilir. Kürk kortizol ayıklamak için kullanılan en yaygın çözücü metanol21,23; ancak, kortizol çıkarma tekniklerinde etanol ve izopropanol kullanan bazı çalışmalar vardır. Örneğin, etanol kullanılan bir çalışma insan amniyotik sıvı24kortizol ayıklamak için başarılı oldu. Ayrıca, kullanılan izopropanol kullanılan bir çalışma insan saç ve tırnak25,26kortizol ayıklamak için başarılı oldu. Bu nedenle, bu çalışmada koala kürkü örneklerinden kortizol çıkarılması için en başarılı olduğunu belirlemek için her üç çözücüler (metanol, etanol ve izopropanol) test edilmiştir.

Bu çalışmanın temel amacı, koala kürkünden kortizolün non-invaziv bir ölçütü olarak kullanılmak üzere optimal hormon ekstraksiyon tekniğini doğrulamak için mevcut teknikleri kullanmaktır. Bu üç ekstraksiyon çözücüler test edilerek elde edildi (metanol, etanol, ve isopropanol). Biz metanol koala kürk kortizol ayıklamak için kullanılan optimal çözücü olacağını varsayılmış çünkü Arbor tsay kortizol kitleri tarafından ekstraksiyon önerilen çözücü27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu proje sıkı hayvan ve insan bakım yönergeleri altında gerçekleştirilmiştir. Hayvan etiği Western Sydney Üniversitesi (A12373) tarafından verildi. Buna ek olarak, bu araştırmayı güvenli bir şekilde üstlenmek üzere Western Sydney Üniversitesi tarafından bir laboratuvar risk değerlendirmesi ve biyogüvenlik ve radyasyon formu sunulmuş ve kabul edilmiştir (B12366).

NOT: Bu proje için koala kürk örnekleri Adelaide Koala ve Yaban Hayatı Hastanesi, 282 Anzak Karayolu, Plympton Güney Avustralya bulunan elde edilmiştir. Kürk, hastaneye kaldırılan ve ağır yaraları nedeniyle ötenazi yapılan bir koaladan alındı. Ölen koala, ölümden kısa bir süre sonra bir ceset torbasının içinde bir dondurucuda saklanmış. Ölen koala ceset torbasından alındıktan sonra, standart hayvan makası kullanılarak boyun ensesinden 1,2 g kürk tıraş edildi. Kürk cilde mümkün olduğunca yakın tıraş edildi, böylece cilt kesilmedi emin olmak için. Tıraş edildikten sonra, ölen koala ceset torbasına geri konuldu ve dondurucuya konuldu. Kürk daha sonra alüminyum folyodan yapılmış bir kese içine yerleştirildi ve -20 °C'nin altında saklandı. Geçiş sırasında kürk ortam sıcaklığında tutuldu ve laboratuvara vardıklarında kürk -80 °C'de saklandı.

1. Koala kürk kortizol çıkarma

  1. Kürkü -80 °C'deki depodan çıkarın ve çözülme süresine izin verin.
  2. Kürkü laboratuvar analitik hassas dengesinde tartın.
  3. Kürkün 60 mg'ını önceden tartılmış ve 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve 18 tüp dolana kadar tekrarlayın.
    NOT: Bu doğrulama çalışması için 18 kürk alt örneği kullanılmıştır.
  4. Bir pipet kullanarak her tüpe %100 yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı isopropanol 1 mL ekleyin.
  5. 30 s için girdap örnekleri.
  6. Sıvı ve kürk ayrımıelde etmek için her numuneyi 0,5 mm mikro hassasiyetli elek kullanarak süzün.
  7. Sıvıyı bir atık kabına atın.
  8. Etiketli plastik tartım tekne içine her kürk örnek yerleştirin, sonra bir vakum desiccator içine yerleştirin, 3 gün boyunca kurumaya kürk bırakın.
  9. Tamamen kurutuldıktan sonra, her numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  10. Her numuneyi 3 krom çelik boncuklu (3,2 mm) bir boncuk değirmenine yerleştirin ve saniyede 30 sarsıntıda 2 dakika toz haline getirin.
  11. İlk ekstraksiyon tekniğinin 1,5 mL'si (%100 analitik sınıf etanol) kürk numunesini içeren 6 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dönüştürülür.
  12. 18 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler imal edilene kadar %100 analitik sınıf metanol ve %100 analitik sınıf izopropanol için aynı şeyi yapın.
  13. Kapak her 1.5 mL mikrosantrifüj tüp ve oda sıcaklığında kuluçka (RT) sabit zonklayan bir shaker kullanarak 3 saat.
  14. 0,5 mm mikro hassasiyetli elek kullanarak numuneleri çıkarın ve gerin.
  15. Kürkün uygun şekilde atılmasını sağlarken sıvıyı pipetle 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
  16. Bir duman dolabı altında N2 buharı akışı altında tamamen kuru çözücü ekstresi.
  17. 400 μL'lik test tamponu (ticari kortizol kitinde sağlanan kompozisyon; bkz. MalzemelerTablosu) ve 100 μL%100 analitik sınıf etanol kullanarak kurutulmuş numune ekstresini yeniden oluşturun.
    NOT: Örnek ekstreler -80'de saklanabilir.

2. İç kontroller

  1. Kontrolleri yapmak için, yüksek hormon düzeyleri ile ayıklanmış örneklerin bir havuz yapmak. Bu havuzu yapmak için, strese maruz kalma bilinen hayvanlardan örnekler seçin. Örneğin, genellikle yüksek kortizol hormon düzeyleri6gösterecektir gibi çevresel travma kurtarıldı koalalar örnekleri seçin.
    1. Ayıklama havuzunu yapmak için, toplam 200 μL hacim elde edilene kadar her numuneden 20 μL (n = 10) özü alın. Ayıklama havuzu tahlil edilene kadar -80 C'de saklanabilir. Havuzu her tetkikteki düşük veya yüksek iç denetimler olarak çalıştırın (bkz. adım 2.2).
  2. Tararmak için, sırasıyla %70 (C1) ve %30 (C2) ile bağlanan düşük ve yüksek kontroller için stok yapmak için havuzu kullanın. Kortizol standardına karşı ekstre için paralellik grafiğinden %30 ve %70 bağlamanoktaları için seyreltme faktörünü elde edin (Şekil 1). Numune havuzunun seyreltilmesi için test tamponu kullanın. Örneğin, 1:2 seyreltme için 60 μL havuz ekstresi ve 60 μL'lik bir araştırma arabelleği kullanın.
    NOT: Metanol özü için %30 bağlama noktası düzgün, %70 bağlama noktası ise Şekil1'e göre yaklaşık 1:2 idi. Böylece, bu iç kontroller için seyreltme faktörü sağlanan (C1 ve C2 sırasıyla) tsay içinde çalışan için.

3. Koala kürközlerinde kortizol analizi

  1. Ticari bir kortizolkiti (Malzeme Tablosu) kullanın ve numuneler, kontroller, kortizol standartları, spesifik olmayan bağlayıcı kuyular ve tedarikçinin talimatlarına uygun maksimum bağlayıcı kuyular dahil olmak üzere 96 kuyu plakasını kurun. Plaka haritasındaki numunelerin, denetimlerin ve standartların konumlarını listelemek için kit kitapçıkta sağlanan plaka düzeni sayfasını kullanın.
    NOT: Sonuçların doğruluğuna izin vermek için tüm örneklerin, denetimlerin ve standartların yinelenen olarak çalıştırılması önerilir.
  2. Örnekler hazırlayın. % 100 metanol çıkarılan koala kürk elde etmek için kürk hormonu ekstraksiyon (bölüm 1) izleyin.
  3. Reaktifleri hazırlayın. (1) istinat arabelleği, (2) yıkama Tamponu ve (3) standartları (kortizol kitinde sağlanan kompozisyonlar, MalzemeTablosu) dahil olmak üzere reaktifleri hazırlamak için ticari kortizol kitinde açıklanan prosedürü izleyin.
  4. Kortizol kitinde verilen talimatlara göre, 50°L numune veya standarttan oluşan borular plakadaki kuyulara yerleştirin. Pipet 75 μL ve 50 μL'lik test tamponu spesifik olmayan bağlayıcı (NSB) kuyularına ve maksimum bağlama (B0 veya sıfır standart) kuyularına sırasıyla.
  5. Tekrarlayıcı bir pipet kullanarak her kuyuya 25 μL kortizol konjuge ekleyin. Daha sonra NSB kuyuları hariç, kortizol antikorlarının 25°L'lik kısmını her kuyuya yerleştirin. Reaktiflerin iyice karıştırıldığından emin olmak için plakanın kenarlarına hafifçe dokunun.
  6. Plakayı plaka lı ucubenle kapatın ve oda sıcaklığında 1 saat (yavaş hızda) orbital shaker kullanarak sallayın.
  7. Plaka lı iniliği çıkarın ve her kuyuyu 300 μL yıkama tamponu ile 4 kez yıkayarak kuyu plakasını aspire edin.
  8. Temiz emici havlular üzerinde plaka dokunarak plaka kuru.
  9. Pipet 100 μL tetrametilbenzadin (TMB) substrat (kortizol kitinde sağlanan kompozisyon, MalzemeTablosu) her kuyuya.
  10. Plakalı inisini kuyu plakası üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
  11. Pipet 50 μL stop çözeltisi her kuyuiçin.
  12. 450 nm okuma yeteneğine sahip bir plaka okuyucu kuyu plaka yerleştirin.
  13. Son hormon konsantrasyonu hesaplamak için, pg/mL hormon konsantrasyonunun son ekstre hacmi (0,5 mL) ile çarpılması ve kürk numunesi kütlesine (60 mg) bölünmesi ile numunenin ng/mg'ındaki son kürk kortizol konsantrasyonu elde edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlgi hormon metabolitlerinin asa saptanması paralellik kullanılarak belirlenir. Paralellik eğrisi kullanılarak, %50 bağlama noktası standart eğrideki örnek seyreltmefaktörünü de belirler (Şekil 1). Paralellik grafiğinde gösterildiğigibi (Şekil 1), %100 etanol ve %100 İzopropanol ekstreleri kortizol standardına paralel yer değiştirme sağlamamıştır. Ancak, % 100 metanol ekstresi kortizol standardına paralel deplasman sağladı. Kurutulmuş ekstreler, istibak tamponunda seyreltme yoluyla düzgün çalıştırıldı (100 μL %100 etanol ve 400 μL'lik bir asit tamponu).

Varyasyonun intra- (içinde) ve inter- (ara) değerlendirme katsayıları (CV) yüksekten (yaklaşık %70) belirlendi ve düşük - (yaklaşık 30%) bağlayıcı örnek özleri tüm tahlillerde çalışır. Paralellik grafiğine göre(Şekil 1), %30 (düşük) bağlayıcı iç kontroller düzgün koala ekstresi havuzu, %70 (yüksek) bağlayıcı iç kontroller ise 1:2 seyreltilmiş koala ekstresi havuzu idi. İç yüksek ve düşük iç kontrollerde CV %15 idi.

Teşp içindeki hata payı, <%15 olması gereken varyasyonun intra ve inter-assay katsayıları da dahil olmak üzere kalite kontrol kullanılarak belirlenebilir. Atest duyarlılığı, boş (sıfır bağlama) örneklerinin ortalama yanıtından 2 standart sapma değeri olarak hesaplanmış ve 81.26 pg/iyi olarak ifade edilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Kortizol enzim immünoassay altında kortizol standart eğrisine karşı 3 farklı çözücü (%100 etanol, %100 izopropanol veya %100 metanol) kullanılarak çıkarılan havuzlu koala kürkünün paralelliği. B/TB, toplam bağlama üzerinde bağlanma yüzdesidir. Seri seyreltme faktörü (örneğin, 1:2X ortalama seyreltme faktörü 2) her standardın konsantrasyonu ile birlikte sağlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İkinci olarak, her çözücü özü ve kortizol standardı arasındaki ilişki bir regresyon çizimi kullanılarak belirlendi (Şekil 2). Şekil2'de gösterildiği gibi % 100 metanol ekstresi% 100 etanol ve% 100 izopropanol özleri ile karşılaştırıldığında en yüksek R2 değeri ile regresyon en iyi çizgi sağladı.

Figure 2
Şekil 2: Koala kürkü çıkarmak için kullanılan 3 çözücünün (etanol, metanol ve izopropanol) her birine karşı kortizol standardının yüzde bağlanması için regresyon çizimleri. R2 değeri en uygun çizgiden elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ayrıca, üç çözücünün her biri kullanılarak çıkarılan koala kürkünün alt seti tahnit edilmiş ve sonuçlar aşağıdaki Tablo 1'de verilmiştir. Tablo1'de gösterildiği gibi kortizol standardının gözlenen konsantrasyonu 2879.61-125.70 pg/well aralığında ydı. Etanol veya isopropanol ekstraksiyon yöntemi, yöntemlerden herhangi biri kullanılarak elde edilen kürk özü konsantrasyonları çok yüksek min-max hormon konsantrasyonları aralığı ile sonuçlandı (Tablo 1 numaraları işaretlenmiş bakınız kırmızı), kortizol tsay algılama sınırının ötesinde idi. Ancak, metanol özleri kortizol standardı aralığında kortizol konsantrasyonları ile sonuçlandı (Tablo 1'de kalın siyah sayılarda gösterildiği gibi). Ayrıca, metanol ekstraksiyon yöntemi ile saptanan kürk kortizol konsantrasyonları, diğer iki yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında son derece tutarlıydı (bkz. Tablo1). Bu nedenle, metanol etanol ve izopropanol ile karşılaştırıldığında koala kürk hormonu ekstraksiyonu için en uygun çözücü olduğu null hipotezi kabul.

Table 1
Tablo 1: Koala kürkü (n = 18) için kortizol konsantrasyonu (ng/mg) 3 farklı çözücü (etanol, izopropanol veya metanol) kullanılarak elde edilir ve kortizol enzim-immünoassay altında kortizol standart eğrisine karşı çalışır. Koyu kırmızı sayılar, etanol ve isopropanol özleri için tutarsız konsantrasyonları gösterir ve bu da ileri sasayı aralığının (pg/well) ötesindedir. Kalın siyah sayılar kortizol standartları (pg / iyi) aralığında düştü metanol kullanılarak çıkarılan kürk kortizol için konsantrasyonları göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Memeli kürkkortizol tespit etmek için teknikler bir dizi kullanmak çalışmalar vardır. Bu çalışma, mevcut antropojenik strese maruz kalan yabani bir koaladan toplanan kürkkortizol tespiti için sonuçlar sunmaktadır. Bu çığır açan çalışmada koala kürk kronik stres bir ölçüsü olan kortizol ayıklama en iyi üç yaygın olarak kullanılan çözücüler hangi test etmek için kürk kullanılır. Sonuçlar% 100 metanol memeli kürk bu tür kortizol ekstraksiyon için önerilen çözücü olduğunu gösterdi.

Etanol, metanol ve isopropanol hidrojen molekülleri ile bağlı ve yaygın hormon çıkarma deneylerde çözücüler olarak kullanılan tüm birincil alkoller28. Genellikle, polar maddeler diğer polar maddelerde en iyi çözünür, polar olmayan maddeler ise diğer polar olmayan maddelerde en iyi çözünür. Metanol içeren alkol grubu çok kutuplu, isopropanol içeren alkol grubu ise çok non-polar. Moleküler yapısı sayesinde, etanol içeren alkol grubu hem polar hem de polar olmayan çözücü olma avantajına sahiptir. Kortizol gibi steroid hormonlar non-polar olarak kabul edilir, kortizol polar çözücüler ile güçlü bir bağlayıcı ilişki olması gerektiği anlamına gelir.

Koala kürkündeki fizyolojik stresi değerlendirmek için kullanılan ekstraksiyon çözücülerinin daha kapsamlı bir analizi için, gelecekteki araştırma projeleri Şekil3'te açıklandığı gibi aynı yöntemleri denemelidir. Benzer çalışmalar tarihsel taşlama önce yıkama yaptık22, böylece hiçbir istenmeyen ter ve / veya sebum türetilmiş kortizol kürk örnek içine yatırılan olduğundan emin olmak için. Ayrıca, tek başına kortizol ölçümü kronik stres tam bir endikasyon garanti edemez önemlidir. Saç kortizol okumaları bir hayvan Tarafından yaşanan fizyolojik stresi anlamaya çalışırken değerli bir araçtır, ancak yüksek HPA aktivitesi fiziksel egzersiz, metabolik anormallikler ve varlığı da dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında oluşabilir bulaşıcı hastalık22. Hormon verilerinin ana bütünlüğü göz önünde bulundurulması gereken diğer önemli faktörler şunlardır: (1) Kabul edilebilir rasgele hata düzeyi - iç kontrollerden (CV1 ve CV2) elde edilen varyasyon katsayıları tüm tahliller için <%15 olarak ortalama olmalıdır. (2) Her plaka üzerinde çalışan örnek test―yinelenen numuneler içinde rasgele hata <% 15 bir CV olmalıdır; aksi takdirde numunenin yeniden çalıştırılması gerekir. (3) Tsay algılama sınırı - her bir test içinde ölçülen hormon konsantrasyonu (en yüksek seyreltme ve düzgün standart için okumalar arasında) test algılama sınırı içinde olmalıdır; aksi takdirde numuneler daha fazla seyreltme gerektirebilir (numuneler için tespit edilen seviyeler düzgün standart konsantrasyonundan büyükse) veya test içinde analiz edilemeyebilir (numuneler için tespit edilen seviyeler en yüksek seyreltilmiş konsantrasyondan daha düşükse standart). (4) Tsay hassasiyeti - bu arka plan okuma (non-spesifik bağlama) etkilenebilir, bu nedenle test için kalite güvencesi en yüksek düzeyde korumak için önemlidir (örneğin, plaka yıkayıcı ve plaka okuyucu gibi ekipman düzenli olarak servis edilmelidir). (5) Numune ekstresi kurutma - bu adım potansiyel çapraz kontaminasyon veya numune kaybına neden olabilir. Numunelerin N2 gazı buharı altında ayrı ayrı kurutulması ve her numune arasında ekstraksiyon için kullanılan Pasteur pipetinin değiştirilmesi önerilir.

Figure 3
Şekil 3: Koala kürklü kortizol enzim-immünoassay (EIA) ile ilgili önemli adımları gösteren kavramsal akış diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada özetlenen prosedür (Şekil3) kolayca kolayca gerçekleştirmek için kolay olduğu gibi çoğaltılabilir biridir, kolayca kullanılabilir kimyasallar, reaktifler içeren adım adım metodoloji, ve ekipman ile malzemeleri olması muhtemeldir standart bir analitik laboratuvarda bulunur. Bu çalışmanın uygulanması, hem vahşi hem de tutsak koalalarda fizyolojik stresi değerlendirmek için invaziv olmayan bir tekniğin kullanılmasını sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Edward Narayan için Western Sydney Üniversitesi, Bilim ve Sağlık Okulu aracılığıyla start-up araştırma fonu ile desteklenmiştir. Yazarlar örnek işleme ile yardım için Jack Nakhoul teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12, (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494, (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32, (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1, (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43, (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35, (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19, (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57, (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85, (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5, (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2, (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172, (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88, (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37, (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5, (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2, (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11, (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8, (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7, (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7, (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52, (6), 710-716 (2014).
Koalak'da Kortizol Ölçümü (<em>Phascolarctos cinereus</em>) Kürk
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).More

Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter