Summary
Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.
Abstract
Het gebruik van recombinante virussen is in basic of toegepaste Virologie van cruciaal belang geworden. Omgekeerde genetica heeft bewezen een uiterst krachtige technologie, zowel ontcijferen van virale replicatie mechanismen te bestuderen van antivirale middelen of ontwikkelplatform voor vaccins. De bouw en de manipulatie van een omgekeerde genetische systeem voor een negatieve-streng RNA-virus zoals een respiratoir syncytieel virus (RSV), echter blijft gevoelige en speciale kennis vereist. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb dat als een sjabloon voor zowel virale RNA replicatie en transcriptie fungeert. Onze omgekeerde genetica-systeem gebruikt een cDNA kopie van het menselijk genoom van de RSV lange stam (HRSV). Dit cDNA, evenals de cDNAs virale eiwitten van de polymerase van complexe codering (L, P, N en M2-1), worden in afzonderlijke expressievectoren onder T7 polymerase besturingsprocessen geplaatst. De transfectie van deze elementen in de BSR-T7/5 cellen, die stabiel express T7 polymerase, kan men cytoplasmatische replicatie en transcriptie van de recombinante RSV, die aanleiding geven tot genetisch gemodificeerde virionen. Een nieuwe RSV, die aanwezig is op het celoppervlak en in het supernatant van cultuur van BSRT7/5, wordt verzameld om te infecteren menselijke HEp-2 cellen voor virale versterking. Twee of drie rondes van versterking nodig zijn om te verkrijgen van virale bouillon met 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 plaque-vormende eenheden (PFU) / mL. Methoden voor de optimale oogsten, bevriezing en titratie van virale voorraden worden hier in detail beschreven. We illustreren het protocol hier gepresenteerd door het creëren van twee recombinante virussen respectievelijk uiten gratis groen fluorescente proteïne (GFP) (RSV-GFP) of virale M2-1 gesmolten tot GFP (RSV-M2-1-GFP). We laten zien hoe met RSV-GFP kwantificeren RSV replicatie en de RSV-M2-1-GFP te visualiseren van virale structuren, evenals de dynamiek van de virale eiwitten in levende cellen, met behulp van video microscopie technieken.
Introduction
Menselijke RSV is de belangrijkste oorzaak van hospitalisatie voor acute respiratoire landstreekbesmetting in zuigelingen wereldwijd1. RSV is bovendien gekoppeld aan een aanzienlijke ziektelast in volwassenen vergelijkbaar met influenza, met de meeste van de hospitalisatie en sterfte last in de oudere2. Er zijn geen vaccins of specifieke antivirale middelen beschikbaar nog tegen RSV, maar veelbelovende nieuwe drugs zijn in ontwikkeling3,4. De complexiteit en de zwaarte van de technieken van kwantificering van RSV vermenigvuldiging belemmeren de zoekt antivirale middelen of vaccins ondanks huidige aanzienlijke inspanningen. De kwantificering van RSV vermenigvuldiging in vitro is over het algemeen gebaseerd op omslachtige, tijdrovende en dure methoden, die meestal in de analyse van de cytopathogeen effect door microscopie, immunokleuring, vermindering van de plaque testen, kwantitatieve bestaat reverse-transcriptase (qRT)-de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assay proeven. Virussen met gemodificeerde genoom en het uiten van reporter genen, zoals codering voor de GFP, zijn meer geschikt voor dergelijke vertoningen. Gekoppeld aan het gebruik van geautomatiseerde plaat lezers, kunnen reporter gene-uitvoering recombinante virussen maken deze testen meer geschikt voor normalisatie en hoog-productie doeleinden.
RSV is een omhuld, nonsegmented negatief-sense RNA-virus dat tot het geslacht van de Orthopneumovirus van de Pneumoviridae familie, orde Mononegavirales5 behoort. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb, waarin een noncoding regio op de 3' en 5' extremiteiten leider en Trailer en 10 transcriptionele eenheden codering 11 eiwitten. De genen worden als volgt gerangschikt: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codering voor M2-1 en M2-2 eiwitten) en L-5'. De genomische RNA is strak verpakt door de nucleoproteïne N. Using encapsidated genomic RNA als een sjabloon, virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) zal zorgen voor transcriptie en replicatie van de virale RNA. Virale RdRp bestaat uit het grote eiwit L die per se de polymeraseactiviteit nucleotide draagt, zijn verplichte cofactor de phosphoprotein P en de M2-1 proteïne die als een virale transcriptie functioneert factor6. In de geïnfecteerde cellen induceert RSV de vorming van cytoplasmatische insluitingen opneming instanties (IBs) genaamd. Morfologisch soortgelijke cytoplasmatische insluitingen zijn waargenomen voor diverse Mononegavirales7,8,9,10. Recente studies over rabiësvirus, vesiculaire stomatitis virus (VSV), Ebola-virus en RSV bleek dat virale RNA-synthese treedt op in IBs, dat kunnen dus worden beschouwd als virale fabrieken8,9,11, 12. de virus fabrieken concentreren de RNA en virale eiwitten nodig is voor virale RNA-synthese en bevatten ook cellulaire eiwitten13,14,15,16, 17. IBs vertonen een functionele subcompartment genaamd IB-geassocieerde korrels (IBAGs), die zich concentreren het nieuw synthetized ontluikende virale mRNA samen met de M2-1 proteïne. De genomische RNA en de L, P en N worden niet gedetecteerd in IBAGs. IBAGs zijn kleine dynamische bolvormige structuren binnen IBs die de eigenschappen van vloeibare organellen12vertonen. Ondanks de centrale rol van IBs in virale vermenigvuldiging, is zeer weinig bekend over de aard, de interne structuur, de vorming en de werking van deze virale fabrieken.
De expressie van het genoom van een poliovirus uit een cDNA ingeschakeld de productie van de eerste besmettelijke virale kloon in 198118. Voor single-stranded negatieve RNA virussen was het niet tot 1994 dat de productie van een eerste rabiësvirus na transfectie van plasmiden in cellen19 plaatsvond. Het eerste plasmide gebaseerde omgekeerde genetische systeem voor RSV werd gepubliceerd in 199520. Omgekeerde genetica hebben geleid tot belangrijke ontwikkelingen op het gebied van virologie. Kritisch inzicht in de replicatie en pathogenese van RNA-virussen heeft voorzien in de mogelijkheid van de invoering van specifieke wijzigingen in het virale genoom. Deze technologie heeft de ontwikkeling van vaccins ook aanzienlijk vergemakkelijkt doordat specifieke demping door middel van gerichte reeks wijzigingen. Genoom wijzigingen waardoor een snelle kwantificering van virale vermenigvuldiging sterk verbeterd de antivirale screening en de studie van hun werkingsmechanisme.
Hoewel eerder beschreven, blijft verkrijgen van genetisch gemodificeerde RSVs gevoelig. Hier, detail we een protocol bij het maken van twee soorten recombinante HRSV, respectievelijk uiting van RSV-GFP of RSV-M2-1-GFP. In dit protocol beschrijven we de voorwaarden van de transfectie moest redden de nieuwe recombinante virussen, evenals hun versterking te verkrijgen van virale voorraden met hoge titer, geschikt voor reproduceerbare experimenten. De bouw van het reverse genetics vectoren wordt per se hier niet beschreven. We worden methoden beschreven voor de optimale oogsten en invriezen van virale voorraden. De meest nauwkeurige methode te kwantificeren virale besmettelijke deeltjes blijft plaque assay. Cellen zijn besmet met seriële verdunningen van de geanalyseerde schorsing en geïncubeerd met een overlay die de verspreiding van gratis virale deeltjes in het supernatant verbiedt. In dergelijke omstandigheden, zal het virus alleen aangrenzende cellen vormen een "plaque" voor elk initiële infectieuze deeltje infecteren. In de conventionele RSV titratie assay, zijn plaques geopenbaard door immunokleuring en geteld onder microscopische observatie. Deze methode is duurder en tijdrovender. We beschreven hier een heel simpel protocol voor een RSV plaque assay met microkristallijne cellulose overlay waarmee de vorming van plaques zichtbaar met het blote oog. We laten zien hoe RSV-GFP kan worden gebruikt op maatregel RSV replicatie en, dus, op het kwantificeren van de impact van antivirale middelen. Omgekeerde genetica en levende imaging technologie te combineren, we laten zien hoe de RSV-M2-1-GFP wetenschappers te visualiseren M2-1 in levende cellen en volgen de dynamiek van intracellulaire virale structuren, zoals IBs toestaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materiële voorbereiding
- Cel media kopen (verminderde serum media, minimale essentiële media [MEM], 10 x MEM en Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium [DMEM]), transfectiereagens en microkristallijne cellulose (Zie Tabel van materialen).
- Verkrijgen van de volgende vectoren voor omgekeerde genetica: de genomische vector(s) en de codering van de N-eiwitten en de complexe eiwitten van polymerase expressievectoren. De genomische vectoren bevatten het volledige cDNA genoom van RSV-GFP (p-RSV-GFP) en RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) stroomafwaarts van de bacteriofaag T7 RNA polymerase (T7 pol) promotor. De expressievectoren (uitgeroepen tot p-N, p -P, p-L en p-M2-1) bevatten de codering opeenvolging van N, P, L of M2-1 stroomafwaarts de T7-pol (Zie Rincheval et al.12 en Rameix-Welti et al.21 voor details met betrekking tot de plasmide constructies).
- Media voor te bereiden voor een cultuur van de cel in een steriele omgeving en voor de transfectie en infectie. Gebruik DMEM met 2 mM L-glutamine aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1.000 eenheden/mL penicilline en 1 mg/mL streptomycine (of zonder antibiotica) en MEM met 2 mM L-glutamine aangevuld met 0%, 2% of 10% FCS, 1.000 eenheden/mL penicilline, en 1 mg/mL streptomycine, uitgeroepen tot "volledige medium" in het volgende protocol.
- BSRT7/522 cellen verkrijgen en maak voorraden in volledige medium aangevuld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bij 1 tot 2 x 106 cellen/mL. Instandhouding van de visbestanden van de cel in vloeibare stikstof. Verkrijgen HEp-2 cellen. De cellen van de BSRT7/5 van de cultuur in volledige DMEM en HEp-2 cellen in volledige MEM op 37 ° C en 5% CO2 in een steriele omgeving.
- Bereid een 10 x RSV instandhouding oplossing (0.5 M HEPES en 1 M MgSO4 [pH 7.5] in water) in een steriele omgeving.
- Het verkrijgen van een omgekeerde fluorescentie Microscoop compatibel met GFP fluorescentie metingen en compatibel met levende imaging indien het noodzakelijk is om een infectie te controleren. Het verkrijgen van een compatibel met GFP fluorescentie metingen voor de kwantificatie van RSV-GFP replicatie microplate-reader.
2. rescue en eerste Passage van recombinante Virus
Opmerking: Alle van de volgende stappen uitvoeren in een steriele omgeving, met behulp van een klasse II veiligheidskast.
- Eergisteren transfectie, maak een suspensie van de cellijn van BSRT7/5 bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium. Distribueren van 2 mL celsuspensie per putje in een 6-well-plate. Een goed per virus dat zal worden gered en één extra goed voorbereiden door negatieve controle. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2. Controleer of de cellen aan de samenvloeiing van een 80%-90% de volgende dag.
- Ontdooien van de reverse genetics vectoren (uit stap 1.2) p-RSV-GFP en p-RSV-M2-1-GFP, evenals p-N, p -P, p-L en p-M2-1. Mix, voor elke virus te redden, 1 microgram van p-N en p -P, 0,5 µg van p-L, 0,25 µg p-M2-1 en 1,25 µg p-RSV (GFP of M2-1 GFP) in een buis.
Opmerking: Verschillende expressievectoren voor N, P, L en M2-1 mag worden gebruikt; de verhouding tussen de eiwitten heeft echter te worden gehandhaafd. De negatieve controle uitvoeren door de p-RSV-vector te vervangen door een lege vector. -
Gaat u verder met de transfectie, volgens protocol van de transfectie reagens fabrikant (zie tabel van materialen).
- Voeg toe 250 µL van verminderde serum medium aan de gemengde vectoren. In een andere buis, Verdun 10 µL van het transfectiereagens in 250 µL van verminderde serum medium. Zachtjes vortex zowel buizen en wacht 5 min. Mix de inhoud van beide buizen en wacht gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de cellen van de BSRT7/5 met 1 mL van verminderde serum medium en distribueren van 1,5 mL MEM met 10% FCS zonder antibiotica per putje. Indien nodig, Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 totdat de incubatie beschreven in stap 2.3.1 is voltooid.
- Voeg 500 µL van het mengsel van de transfectie bereid in stap 2.3.1 aan een putje wanneer de incubatietijd van 20 min. over. Plaats de cellen gedurende 3 dagen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 . Wijzig het cultuurmedium van de cellen niet tijdens de transfectie.
- Observeren van GFP fluorescentie (excitatie op 488 nm) en emissie bij 515 – 535 nm onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop op 20 x vergroting 1 x per dag te controleren van de doeltreffendheid van de redding, met behulp van het GFP filteren.
- Zaad op de tweede dag na de transfectie, de cellen voor de eerste passage van de geredde virussen. Maak een suspensie van de HEp-2 cellen bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium. Distribueren van 2 mL celsuspensie per putje in een 6-well plaat (één putje per virus voor reddings- en één negatieve controle).
- Op de derde dag van transfectie, kras cellen in elk putje van de plaat van transfected BSRT7/5-6-well, met behulp van een andere schraper voor elk putje. Pipetteer telkens goed inhoud (cellen en supernatant) in een steriele 2 mL microcentrifuge buis. Vortex elke buis krachtig voor ten minste 30 s tot vrijlating van de geredde virus uit de celmembranen.
Opmerking: Dit komt overeen met de passage 0 (P0) van de geredde virus (Figuur 1). -
Gebruik de verse virale P0 schorsing voor het uitvoeren van de eerste amplificatie van de geredde virussen.
- Verwijder het kweekmedium van de HEp-2 6-well plaat eergisteren ontpit (zie stap 2.5) en 500 µL van de schorsing van de P0 (uit stap 2.6) per putje snel toe te voegen. Plaats de HEp-2 plaat bij 37 ° C op een wip rocker voor zachte agitatie voor 2 h.
- Verwijderen en verwijderen van de 500 µL van entmateriaal en voeg toe 2 mL MEM met 2% FCS. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 voor 3 dagen. Dit zal de eerste passage (P1) van de geredde virussen (Figuur 1) produceren.
- Voeg 1/10 van het volume van 10 x RSV instandhouding oplossing (0.5 M HEPES en 1 M MgSO4 [pH 7.5]) in de resterende P0 schorsing (uit stap 2.6). Vortex de slangen krachtig gedurende 5 s en aliquot de inhoud in cryogene buizen aangeduid met alcoholbestendig tags. Dompel de buizen voor ten minste 1 uur in alcohol precooled bij-80 ° C, en bewaar ze bij-80 ° C.
- Titreer de P0-voorraad (zie stap 2.6) van elke geredde virus (zie punt 4 bij de titratie met microkristallijne cellulose).
- Observeren GFP fluorescentie (excitatie op 488 nm) en emissie bij 515 – 535 nm van de HEp-2 cellen geïnfecteerd met de schorsing van de P0 onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop op 20 x vergroting 1 x per dag te controleren van de infectie. Observeren onder een helderveld Microscoop het uiterlijk van kleine syncytia en cel detachement die het RSV cytopathogenic effect (CPE weerspiegelt) (Zie Figuur 2).
- Merk op dat de redding heeft ontbroken anders als fluorescentie noch CPE zichtbaar na 2-3 dagen is.
- Verzamel de eerste passage (P1) op dag 3 of 4 zoals beschreven in stap 2.6. Kortom, schrapen van de cellen, het verzamelen van de cellen en de bovendrijvende vloeistof samen, vortex, voeg de instandhouding oplossing zoals beschreven in stap 2.8, hoeveelheid van het monster, en bevriezen.
- Titreer (zie hoofdstuk 4 voor de titratie assay) en de eerste passage (zie punt 3 voor de versterking) versterken.
3. versterking van de geredde virussen
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de versterking van de geredde virussen in een maatkolf van 75 cm2 . De grootte van de kolf aan het benodigde volume en de vereiste veelheid van infectie (MOI) aanpassen. Tabel 1 geeft aan volumes voor verschillende kolven. Alle van de volgende stappen uitvoeren in een steriele omgeving in een klasse II veiligheidskast.
- Maak een suspensie van de HEp-2 cellen bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium, de dag vóór de versterking. Distribueren van 15 mL van de celsuspensie per 75 cm2 kolf en Incubeer de kolven op 37 ° C en 5% CO2. Bereiden een kolf per virus te versterken.
- De dag na het begin van de incubatie, Controleer of de cellen 80 – 100% heuvels zijn.
- Verdun de virale schorsing uit stap 2.12 in MEM zonder FCS te verkrijgen van een schorsing van de 3 mL bij 50.000 PFU/mL (overeenkomend met een MOI van 0,01 PFU/cel).
- Verwijder het medium en snel toevoegen de virale schorsing van 3 mL. Plaats de erlenmeyer op 37 ° C op een wip rocker voor zachte agitatie voor 2 h.
- Verwijderen en verwijderen van het entmateriaal en voeg toe 15 mL MEM met 2% FCS. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 tot 4 dagen.
- Controleer de cel morfologie en GFP fluorescentie (excitatie op 488 nm) en emissie bij 515 – 535 nm onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop op 20 x vergroting om te kunnen inschatten van de juiste tijd om te oogsten van de virussen. Dit is meestal wanneer 50%-80% van de cellaag van de HEp-2 als gevolg van de RSV CPE die tussen de 48 en 72 h postinfection (p.i. optreedt) is vrijstaand (Zie Figuur 3).
- Alle cellen met behulp van een cel schraper Schraap. Zowel de cellen en het supernatant samen verzamelen en overbrengen naar een tube van 50 mL centrifuge.
- Voeg 1/10 van het volume van de 10 x RSV instandhouding oplossing (0.5 M HEPES en 1 M MgSO4 [pH 7.5]). Vortex de buizen krachtig gedurende 5 s en verduidelijking van de schorsing door een 5 minuten centrifugeren op 200 x g.
- Het supernatant overbrengen in een tube van 50 mL. Vortex kort en aliquot de schorsing in cryogene buizen aangeduid met alcoholbestendig tags. De buizen in de alcohol precooled-80 ° C gedurende ten minste 1 uur onderdompelen en bewaar ze bij-80 ° C.
- Blokkering opheffen tot de aliquots aan Titreer de virale opschorting (zie punt 4).
4. plaque titratie Assay
- 12-Wells-platen voorbereiden titratie de dag voordat de bepaling van de titratie wordt uitgevoerd (zes wells zal moeten Titreer één buis van virus). Beënt de putjes met 1 mL van de HEp-2 cellen bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium.
-
De volgende dag, maak een suspensie van steriele microkristallijne cellulose (2,4% [w/v] in water) (zie tabel van materialen).
- 2.4 g microkristallijne cellulose poeder in 100 mL gedestilleerd water, met behulp van een standaard magneetroerder, tot volledige ontbinding van het poeder (meestal 4-12 h) verspreiden. Autoclaaf de schorsing bij 121 ° C gedurende 20 minuten en opslaan bij kamertemperatuur vóór gebruik.
Opmerking: Onder dergelijke omstandigheden is de schorsing voor 1 jaar stabiel. - Na het openen van de oplossing in een steriele omgeving, opslaan bij 4 ° C voor 6 maanden. Altijd mengen de schorsing vóór gebruik (door hand schudden of vortexing) om ervoor te zorgen dat het homogeen is.
- 2.4 g microkristallijne cellulose poeder in 100 mL gedestilleerd water, met behulp van een standaard magneetroerder, tot volledige ontbinding van het poeder (meestal 4-12 h) verspreiden. Autoclaaf de schorsing bij 121 ° C gedurende 20 minuten en opslaan bij kamertemperatuur vóór gebruik.
- Voorbereiden van de 2 x MEM in een steriele omgeving. Verdun commerciële MEM 10 x met steriel water en L-glutamine, 1.000 eenheden/mL penicilline en 1 mg/mL streptomycine toevoegen. De verdunning goed schudden en op te slaan bij 4 ° C.
Opmerking: Voer stappen 4.4 – 4.10 in een steriele omgeving met behulp van een klasse II veiligheidskast. - Bereiden van zes buizen met 900 µL van MEM zonder FCS per virus te worden getitreerd (de titratie buizen). Ontdooi de virus aliquots, vortex hen krachtig gedurende 5 s, en overdracht 100 µL met de eerste titratie buis.
- Uitvoeren van een tienvoudige verdunning 6 x, als volgt. Voeg 100 μl van het virus op 900 μL van medium in de eerste buis, zetten de dop op de tube, en meng de inhoud ervan door de vortexing voor een paar seconden. De tip over de Pipet wijzigen, voeg 100 µL van de eerste verdunning aan 900 µL van medium in de tweede buis, zet de dop op de tube, en vortex. Herhaal de procedure tot de zesde buis.
Opmerking: Het is zeer belangrijk om te wijzigen de tip voor elke verdunning. - Schrijf de naam en de vouw verdunningen het virus op de HEp-2 12-Wells-platen. Het toevoegen van een mark zodat deze overeenkomen met de plaat en zijn dekking omdat ze tijdens de kleuring (stap 4.9) mogen worden gescheiden. Verwijder het medium van de platen en distribueren van 400 µL van een verdunning per putje. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur, voor virus adsorptie.
Opmerking: Het uiteinde van de pipet tussen elke entmateriaal wijzigen of overgaan van laagste tot hoogste concentratie met de dezelfde tip. Inoculeer een beperkte reeks van platen (1 tot 2) gelijktijdig om te voorkomen dat de cellen drogen. -
De overlay microkristallijne cellulose gedurende de virus adsorptie (extempore voorbereiding) voorbereiden. Voor het verkrijgen van 100 mL van overlay, meng 10 mL van 2,4% microkristallijne cellulose schorsing, 10 mL 2 x MEM, en 80 mL van MEM met 2% FCS.
- Breng de pH van de 2 x MEM naar ongeveer 7.2 met een steriele natrium bicarbonaat oplossing op 7,5%, na de kleur indicator. Voeg de schorsing microkristallijne cellulose en de MEM en meng krachtig.
- Voeg aan het eind van de incubatie 2 h, 2 tot 3 mL van overlay aan elk putje van de 12-Wells-platen zonder het verwijderen van het entmateriaal. Wees voorzichtig om de verontreiniging van de aangrenzende putten met hoge virale titer inoculums te voorkomen. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 voor 6 dagen. De plaat niet verplaatsen en verplaats de incubator niet tijdens de incubatie.
-
Ga naar de vlek van de cellen, met kristalvioletoplossing (8% kristalviolet [v/v] 2% formaldehyde [v/v] en 20% ethanol [v/v] in water).
- Bescherming van het oppervlak van de werkzaamheden van het biosafety kabinet met een vel (de kristalviolet kleuren sterk oppervlakken).
- Voorzichtig schudden de platen af de overlay microkristallijne cellulose te nemen. Verwijder het supernatant en wassen van de cellen 2 x met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Omgaan met de platen een voor een om te voorkomen dat de cellen drogen. Voeg 1-2 mL van de Kristalvioletoplossing en wacht 10-15 min. verwijderen de oplossing, die kan worden hergebruikt voor de volgende plaat kleuring.
- Borden en deksels in verse bleekmiddel onderdompelen gedurende een paar seconden en, vervolgens, was ze grondig met leidingwater. Merk op dat de platen en de covers zijn ontsmet door het bleekmiddel.
- Doe de platen en de deksels op keukenpapier en laat ze drogen. De platen bij een omgevingstemperatuur droog na het spoelen van het water en bewaar ze bij kamertemperatuur. Voor lange opslagperioden (maanden), houden de platen beschermd tegen licht te beschermen van de kleur. Merk op dat als de cellen hun kleur verliezen, ze kunnen worden gekleurd opnieuw met crystal violet.
- Bereken virus titers. Tellen de plaques in de putten van de droge platen, die met het blote oog zichtbaar zijn. Controleer of het aantal plaques van de verschillende verdunningen is coherent (factor 10 tussen elke verdunning). Kies de bron waarop de plaques het makkelijkst zijn te tellen. Het aantal plaques versus het entmateriaal volume als met de verdunning te beoordelen.
Opmerking: Op het voorbeeld in Figuur 4, worden 21 plaques meegeteld bij de 10-5 -verdunning. Deze komen overeen met een titer van
5. het gebruik van HRSV-GFP recombinante virussen te controleren van de virale replicatie in cellen die zijn behandeld met Klein Mengend RNA of antivirale middelen
Opmerking: Voer alle stappen uit behalve 5.1 en 5.2.5 in een steriele omgeving met behulp van een klasse II veiligheidskast.
-
Toezicht op het effect van cellulaire gen zwijgen over RSV vermenigvuldiging
Opmerking: Het protocol van de transfectie is afhankelijk van het reagens (Zie Tabel van materialen).- Stel 96-wells-platen voor het GFP-meting. Twee dagen vóór de assay, voor bepaalde kleine Mengend RNA (siRNA), bereid een oplossing van verminderde serum media met siRNA bij een concentratie van 100 nM en een siRNA transfectiereagens verdund 1/500. Laat de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Voeg 25 µL van de oplossing aan de putjes van de plaat bereid in 5.1.1 (in drievoud). Zaad de putjes met 75 µL van een suspensie van A549 cellen op 4 x 105 cellen/mL in volledige medium zonder antibiotica te verkrijgen van een concentratie van de laatste cel van 3 x 105 cellen/mL. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: De definitieve siRNA concentratie is 25 nM en het definitieve transfectie reagens volume is 0,5 µL per putje). - De cellen als volgt infecteren. Verwijder het medium van de putten. Voeg 100 µL van RSV-GFP schorsing bij 50.000 PFU/mL en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Verwijder de virale schorsing en voeg 100 µL van DMEM met 2% FCS en zonder fenol rood. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2.
- Bij 24 uur en 48 uur p.i., meten de fluorescentie, met behulp van een spectrofluorometer ingesteld op excitatie en emissie golflengten van 488 en 520 nm, respectievelijk (fluorescentie wordt uitgedrukt in relatieve fluorescentie). Noninfected A549 cellen worden gebruikt als de normen voor fluorescentie en achtergrond niveau.
Opmerking: De cellen moeten worden verholpen met 4% paraformaldehyde (PFA) voor het meten van hen zonder de cover van de plaat.
-
Beoordeling van de remming van de drug met behulp van RSV-GFP
- Stel 96-wells-platen voor het GFP-meting. De dag vóór de assay, zaad de putjes met 100 µL van een suspensie van HEp-2 cellen bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium zonder fenol rood.
- Maak een seriële verdunning van de geteste geneesmiddelen (AZ4316 in dit voorbeeld) in MEM aangevuld met 2% FCS en antibiotica (50 µL per putje). Maak een suspensie van virale bij 10.000 PFU/mL in MEM zonder stromale vasculaire factor (SVF) en fenol rood (50 µL per putje).
- Verwijder het medium van de 96-Wells HEp-2 plaat en voeg 50 µL van de schorsing van de drug en 50 µL van de virale suspensie (in drievoud). Een mock infectie in parallel uitvoeren als een besturingselement.
Opmerking: De drug verdunnings- en virale schorsing mogen worden vermengd voordat ze op de cellen toe te voegen, of ze opeenvolgend kunnen worden toegevoegd. - Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Het meten van de fluorescentie, met een spectrofluorometer zoals beschreven in stap 5.1.4. Mock-geïnfecteerde HEp-2 cellen worden gebruikt als de normen voor fluorescentie achtergrondniveaus.
6. karakterisering van M2-1 lokalisatie In Vivo met het RSV-M2-1-GFP recombinante Virus
Opmerking: Voer stap 6.1 en 6.2 in een steriele omgeving, met behulp van een klasse II veiligheidskast.
- Maak een suspensie van de HEp-2 cellen bij 5 x 105 cellen/mL in volledige medium. Zaad 1,5 mL van de celsuspensie in een 35 mm petrischaal permeant om CO2 en aangepast voor live imaging.
- Voert de infectie de dag na het zaaien met het RSV-M2-1-GFP-virus bij 1 van de MOI, zoals beschreven in stappen 3.3-3.5 (verwijderen van het medium, voeg 500 µL tot 1 mL van entmateriaal, Incubeer het monster bij 37 ° C terwijl voorzichtig schudden 2 h; verwijderen van het entmateriaal en voeg 1,5 mL MEM met 2 % FCS). Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de gewenste tijd (IBs zal beginnen te verschijnen vanaf 10u p.i.).
- Verwarm de incubatie kamer van een omgekeerde Microscoop uitgerust met 40 x 100 x doelstellingen bij 37 ° C, vóór de petrischaal met de geïnfecteerde cellen in het werkgebied te plaatsen. Open de CO2 -levering en wachten tot stabilisatie van de focus.
- Imaging met GFP-compatibele filters, onder een lage excitatie-intensiteit en beeld frequentie (van 1 tot 0.1 beeld per min) om te minimaliseren van fototoxiciteit uitvoeren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol voor de productie van recombinante virussen van RSV uiting van een fluorescente proteïne (Figuur 2). In pRSV-GFP, is het GFP-gen tussen de P en M genen, geïntroduceerd als beschreven voor het Cherry gen in eerder gepubliceerde werk21. In de pRSV-M2-1-GFP, de M2 gene was links onaangeroerd en een extra gen dat codeert voor M2-1-GFP werd ingevoegd tussen SH en G genen12. De eerste stap, overeenkomt met de redding van het virus in BSRT7/5 cellen, wordt weergegeven in figuur 2A. Kleine clusters van groene fluorescerende cellen waren zichtbaar 72 h posttransfection in putten overeenkomt met RSV-GFP en RSV-M2-1-GFP redding. De fluorescerende signaal kon worden waargenomen in het cytoplasma zowel kernen in RSV-GFP-geïnfecteerde cellen, die overeenkomt met de expressie van de gratis GFP. Daarentegen in de RSV-M2-1-GFP redding, kon fluorescerende cytoplasmatische puntjes worden waargenomen, overeenkomt met de M2-1-GFP accumulatie in IBs. Geen CPE (syncytia, vrijstaande cellen) wordt meestal waargenomen bij deze stap. Daarentegen tijdens de tweede stap, overeenkomt met de versterking van het virus (eerste passage) op HEp-2 cellen, de CPE was zichtbaar in de geïnfecteerde cellen op 72 h p.i. (figuur 2B). Figuur 3A B toont de sterke CPE van de RSV-infectie, gekenmerkt door grote syncytia, vrijstaand of niet, en veel zwevende cellen. Syncytia en cellen beide tentoongesteld helder groene fluorescentie. Figuur 3A toont de evolutie van de cytopathogeen effect tussen 24 en 72 h p.i. in cellen die zijn besmet met het RSV-M2-1-GFP-virus. Een paar verspreide fluorescerende cellen waren zichtbaar op 24u p.i. zonder een detecteerbare CPE. Kleine syncytia (cluster van fluorescerende cellen) en enkele vrijstaande cellen/syncytia begonnen te verschijnen op 48u p.i. grote fluorescerende syncytia en zwevende cellen waren duidelijk zichtbaar op 72 h p.i.
Foto's van plaque titratie assay en virale titers overeenkomt met het hele proces van RSV productie zijn afgebeeld in Figuur 5. Uitvoeren van de bepaling van de plaque op de negatieve controle, transfected met alleen de expressie plasmiden van N, P, L en M2-1, geopenbaard geen plaque bij de laagste verdunning. De titers transfected cellen verkregen werden verwacht dat boven 100 PFU/mL als de redding efficiënt, was zoals afgebeeld in Figuur 5. De titers toegenomen over de passages, tot 106–107 PFU/mL bij passage 1 of 2. Merk op dat de virale titers vergelijkbaar tussen de twee recombinante virussen waren.
Cellen zijn transfected met siRNA gericht op het mRNA van een virale eiwitten (N) of twee cellulaire eiwitten (inosine,-5'-monofosfaat dehydrogenase [IMPDH] en glyceraldehyde 3'-fosfaat dehydrogenase [GAPDH]). Cellen werden ook met nontargeting siRNA transfected. Figuur 6 toont het toezicht van RSV vermenigvuldiging met behulp van RSV-GFP virus op siRNA-behandelde cellen. Een sterk signaal van GFP werd waargenomen (figuur 6A) en gemeten (figuur 6B) op controle cellen transfected met nontargeting siRNA of cellen transfected met siRNA tegen GAPDH mRNA. Daarentegen was het GFP-expressie daalde in de geïnfecteerde cellen uiten van siRNA gericht op N of IMPDH. Merk op dat we geverifieerd dat het GFP fluorescent signaal in RSV-GFP-geïnfecteerde cellen bij 48u p.i. was gecorreleerd met de virale dosis zoals eerder blijkt voor een soortgelijke recombinante RSV Cherry (RSV-Cherry)21uitdrukken. Om te beoordelen drug efficiëntie te verhogen bij RSV vermenigvuldiging, waren HEp-2 cellen besmet met RSV-GFP gedurende 48 uur in aanwezigheid van verschillende concentraties van de drug. We waargenomen een sterke daling van het GFP-signaal, dat bereikt het achtergrond lawaai (er was een signaal op niet-geïnfecteerde cellen waargenomen), in aanwezigheid van een verhoogde drug concentratie, zoals weergegeven in Figuur 7. De waargenomen IC50 voor AZD4316 was ongeveer 4 nM, vergelijkbaar met de gepubliceerde EC50-waarde van ongeveer 2 – 40 nM tegen verschillende HRSV stammen23. De analyse van de dynamiek van IBs en IBAGs in levende cellen, dankzij RSV-M2-1-GFP, worden weergegeven in Figuur 8 en Figuur 9 (en film 1 en film 2). IBs verschijnen als mobiele bolvormige structuren kunnen smelten, vormen een grotere sferische integratie. IBAGs zijn zeer dynamisch. Ze ondergaan continu montage-demontage cycli met de vorming van kleine IBAGs die groeien, fuse in grote IBAGs, en dan verdwijnen.
| Plaat of kolf | HEp-2 cellen worden overgeënt eergisteren | Mediuminhoud (mL) | Virus entmateriaal volume (mL) |
| 150 cm2 kolf | 15 x 106 | 30 | 5 |
| 75 cm2 kolf | 7.5 x 106 | 15 | 3 |
| 25 cm2 kolf | 2.5 x 106 | 5 | 1 |
| 6-well plaat | 1 x 106 | 2 | 0,5 |
Tabel 1: Het aantal cellen en entmateriaal volume te gebruiken in verschillende kolven.
Figuur 1: schematische weergave van de reddings- en versterking stappen. De transfectie van de expressie vector van N, P, L, M2-1 en RSV antigenomic RNA in BSRT5/7 cellen (redding). Expressie van het antigenomic RSV-RNA en de mRNA van N, P, L en M2-1, door de T7 RNA-polymerase. De N, P, L en M2-1 eiwitten repliceren en transcriberen de genomic RNA, het initiëren van een virale vermenigvuldiging cyclus. Nieuwe virale deeltjes worden geproduceerd en vermenigvuldigen, geven aanleiding tot de P0. Het virus van de redding (P0) geoogst wordt vervolgens versterkt op HEp-2 cellen tot een hogere titer virale schorsing (P1) (versterking). Dit wordt vervolgens versterkt met het oog op een virale voorraden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: CPE en het patroon van de fluorescentie waargenomen tijdens de redding van RSV-GFP en RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 cellen transfected waren met het reverse genetics vectoren, zoals aangegeven en fase contrast en fluorescentie beelden werden genomen op 72 h posttransfection. De negatieve controle (Neg Ctrl) komt overeen met cellen transfected met het expressievectoren van N, P, L en M2-1 zonder de omgekeerde genetische vector. (B) HEp-2 cellen waren besmet met het virus geoogst uit de transfected cellen voor BSRT5/7 (de nul passage, 72 h posttransfection) en afbeeldingen zijn 72 h postinfection genomen. De beelden zijn van representatieve velden; Schaal bar = 100 µm. De doos gebied omsluit cellen weergegeven in vergroting; Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: evolutie van de CPE en de fluorescentie waargenomen tijdens de amplificatie van recombinante RSV. HEp-2 cellen waren bij een MOI van 0,01 PFU/cellen gedurende 72 uur met de eerste passage van (A) RSV-M2-1-GFP of (B) RSV-GFP besmet. Fase contrast en fluorescentie beelden werden genomen op 24 h, 48 uur en 72 h postinfection. De beelden zijn van een representatieve veld; Schaal bar = 100 µm. De doos gebied omsluit cellen weergegeven in vergroting; Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: bepaling van RSV titer met behulp van de plaque assay. (A) resultaten van de bepaling van de titratie plaque in een 12-well-plate. De zes putten besmet met seriële verdunningen van een virale voorraad staan. Verdunningen worden aangegeven in een logaritme met grondtal 10. Cellen die zijn besmet met de drie eerste verdunningen zijn allemaal vrijstaand. De plaque aantallen waargenomen met de 10-4, 10-5, en 10-6 verdunningen stroken. (B) de illustratie van de plaque-opsomming (gele getallen). De groene ster geeft krassen op de cellaag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: titratie van een geredde en versterkte virus. Plaque fenotypes van de RSV-GFP en RSV-M2-1-GFP op de verschillende passages vehiculumcontrolegroep HEp-2 cellen in een 12-well plaat (de beelden tonen het geheel van de putten). De titers van de latere passages worden weergegeven in de tabel. Representatieve gegevens worden weergegeven. Verdunningen van de virale voorraden zijn aangegeven in een logaritme met grondtal 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: inhibitie van de RSV-GFP-expressie door siRNA targeting RSV N of IMPDH. A549 cellen werden behandeld met controle nontargeting siRNA (NT) (lichte blauwe balk) of siRNA gericht op GAPDH (blauwe balk), RSV N (oranje balk) of IMPDH2 (groene bar) gedurende 48 uur en dan besmet met RSV-GFP bij een MOI van 0,05 PFU/cel. De groene fluorescentie werd voorgelezen op 48 h postinfection. (A) representatieve beelden van de RSV-GFP-geïnfecteerde cellen in 48u p.i., siRNA behandeld zoals te zien op de foto's. Schaal bar = 100 µm. (B) gegevens zijn de gemiddelde ± SD van twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: remming van RSV-GFP vermenigvuldiging met samengestelde AZD4136. HEp-2 cellen in 96-wells-platen waren besmet met de RSV-GFP bij een MOI van 0,05 PFU/cel in aanwezigheid van seriële verdunningen van AZD4316 samengestelde of zeggenschap DMSO. De groene fluorescentie werd voorgelezen op 48u p.i. die gegevens de gemiddelde ± SD van twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: analyse van de dynamiek van IBs door het bijhouden van de fluorescente proteïne M2-1-GFP in HEp-2-geïnfecteerde cellen door tijd vervallen microscopie. Op 18 h p.i., werden cellen elke 5 min voor 5 h beeld met een fluorescentie Microscoop, in een kamer verwarmd bij 37 ° C. De IBs zijn fluorescerende (groen) omdat zij gastheer M2-1-GFP en kernen zijn gekleurd met Hoechst (blauw). De witte pijlen geven aan IBs fusion ondergaan. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: analyse van de dynamiek van IBAGs in RSV-M2-1-GFP-geïnfecteerde cellen door tijd vervallen microscopie. Op 18 h p.i., werden cellen beeld met een fluorescentie Microscoop, in een kamer verwarmd bij 37 ° C. Het eiwit M2-1-GFP werd gevisualiseerd door groene fluorescentie. De witte pijlen geven aan IBs ondergaan een fusie van IBAGs. Schaal bar = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: In vivo analyse van de dynamiek van IBs in RSV-M2-1-GFP in HEp-2-geïnfecteerde cellen. Op 18 h p.i., werden cellen elke 5 min voor 5 h beeld met fluorescentie Microscoop, in een kamer verwarmd bij 37 ° C. Schaal bar = 10 µm. De resulterende film toont 7 frames/s (fps). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: In vivo analyse van de dynamiek van IBAGs in RSV-M2-1-GFP-geïnfecteerde cellen. Op 18 h p.i., werden cellen elke 5 min voor 3 h en 40 min beeld met fluorescentie Microscoop, in een kamer verwarmd bij 37 ° C. Schaal bar = 2 µm. De resulterende film toont 4 fps. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methode van redding van recombinant RSVs van vijf plasmiden en hun versterking. De mogelijkheid om het manipuleren van het genoom van virussen heeft een revolutie teweeggebracht in virologie onderzoek om te testen van mutaties en express een extra gen of een tagged virale eiwitten. Het RSV hebben we beschreven en gebruikt als een voorbeeld in dit artikel een uiting van een verslaggever-gen, de RSV-GFP is (ongepubliceerd), en spreekt een M2-1 eiwit tot een GFP label12 gesmoltenvirus. RSV redding is uitdagend en praktijk vereist. De efficiëntie van de transfectie is kritisch, afhankelijk van een verstandig selectie van het transfectiereagens en een voorafgaande optimalisatie van de transfectie protocol. Het gebruik van cellen, uiting geven aan de bacteriofaag T7 pol is verplicht omdat de virale cDNA stroomafwaarts is geplaatst de T7 pol promotor in de meeste van de omgekeerde genetische vector. Een alternatief is om uit te drukken de T7 pol van een virus van de helper "vacciniavirus". Echter, het gebruik van cellen stabiel uiten de T7 pol vermijdt de noodzaak van het scheiden van de twee virussen en voorkomt mogelijke storingen van het "vacciniavirus" met de redding. Het is belangrijk voor het uitvoeren van de eerste passage van de omgekeerde genetische (P0 naar P1) zonder bevriezing van het entmateriaal om ervoor te zorgen maximale redding efficiëntie. Dit impliceert dat de MOI niet wordt gecontroleerd. Bij deze stap is de titers echter zeer gering, wat resulteert in een lage MOI voor de eerste passage. Voor het verkrijgen van RSV voorraden met hoge besmettelijke titers (106–107 PFU/mL), is het belangrijk te wachten op een sterke CPE en schrapen de cellen om te verzamelen van de virale deeltjes gekoppeld aan de cellen. In deze studie verhogen titers niet na 96 h p.i. De snelle afkoeling van de virale schorsing is belangrijk aan het handhaven van hoge titers. In plaats kan van door een onderdompeling in alcohol precooled bij-80 ° C, dit ook gebeuren door onderdompeling in een mix van droogijs/ethanol of in vloeibare stikstof. De toevoeging van de instandhouding oplossing zorgt voor een langere stabiliteit van de virussuspensie bij-80 ° C. De opslag bij-80 ° C is van cruciaal belang, aangezien het virus zal snel verlies haar infectiviteit wanneer opgeslagen bij-20 ° C of in vloeibare stikstof. We beschreven de RSV versterking op HEp-2 cellen, die de meest populaire cellijn RSV groeien is, maar het is ook kunnen groeien efficiënt op talrijke andere cellijnen in vitro. Merk echter op dat groei op Vero-cellen leiden een verandering in de G expressie24 tot kan.
We beschreven een heel simpel protocol van plaque titratie van RSV met behulp van een overlay microkristallijne cellulose. Wat betreft alle titratie tests is het gevoelig voor besmetting met hoge titer schorsingen, vereisen zorgvuldige manipulatie. Conventionele RSV titratie assays agarose of carboxymethyl cellulose (CMC) overlays gebruiken en vereisen van immunokleuring en microscopische opmerkingen voor bepaling van de titer. Een protocol met behulp van immunodiffusie rang agarose is beschreven voor het inschakelen van de directe visualisatie van plaques zonder immunokleuring25. Echter HEp-2 cellen zijn zeer gevoelig aan een verwarmde topagar, waardoor dit protocol moeilijk te gebruiken voor meerdere virus titraties (bijvoorbeeld een te warm overlay vernietigt de cellaag); aan de andere kant, wanneer het niet heet genoeg is, stolt het na de eerste plaat distributie. Het gebruik van microkristallijne cellulose voor een plaque assay werd eerst beschreven door Matrosovich et al. voor een influenza-A virus titratie assay26. Dankzij zijn lage viscositeit is de microkristallijne cellulose-overlay gemakkelijk te zien en te verwijderen putjes van de plaat, waardoor het compatibel is met 96-wells-platen. Het is dus met name aan te passen aan serologische studies en analyses van drug gevoeligheid. Merk op dat aangezien microkristallijne cellulose niet hoeft te worden verwarmd, de drugs gemakkelijk deel van de overlay uitmaken kunnen. Het is echter belangrijk dat de platen perfect nog tijdens de incubatie blijven; anders, zullen grote komeet-vormige foci in plaats van ronde plaques vormen. Plaque openbaring met behulp van crystal violet is goedkoop en eenvoudig, maar deze oplossing is giftig en moet worden afgevoerd. De recycling van de oplossing beperkt de hoeveelheid geproduceerd afval. Bovendien, deze methode is gevoelig voor enkelgelaagde celbeschadiging wat later zou verschijnen als valse witte vlekken die niet virale plaques. Een voorbeeld is weergegeven in Figuur 4 (groene ster). Om te voorkomen dat dit vooroordeel, 1) cellen moeten worden behandeld met de nodige voorzichtigheid te voorkomen krassen of blozen de cel enkelgelaagde, 2) aspiratie en verstrekking altijd te omschrijven van de schade aan een bekende gebied op dezelfde plek aangebracht, en 3) valse witte vlekken kunnen worden geïdentificeerd Dankzij hun vorm (niet-bolvormige), hun scherpe randen en hun positie. We gebruikten eerst Avicel RC 581, als eerder gepubliceerde21,26. Echter de RC 581 is niet langer beschikbaar en wij vervangen het met succes door RC 591. Aan te passen deze test aan andere cel/virus paren, dient de concentratie van microkristallijne cellulose te worden bepaald afhankelijk van het virus en de cellen. Teveel microkristallijne cellulose kunnen giftig zijn voor cellen en leiden tot kleine plaquettes, te weinig zal leiden tot de verspreiding van het virus in het medium.
We beschreven twee voorbeelden van gebruik van het RSV-GFP-virus te controleren van RSV vermenigvuldiging: in het bijzijn van een antivirale geneesmiddelen of wanneer een cellulaire eiwit zwijgen. We toonden aan dat het GFP-signaal is gecorreleerd met virale vermenigvuldiging. De methode die hier gepresenteerd kan de moeiteloze evaluatie van virale vermenigvuldiging in real-time. Hierdoor wetenschappers om gemakkelijk de IC50 voor een antivirale medicijn, zoals weergegeven in Figuur 7. Nog belangrijker is, is deze meting aangepast voor gebruik in medium of breedband, met name voor de screening van chemische bibliotheken. Dit virus verslaggever-uiten kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van het effect op de vermenigvuldiging van het virus een modulatie van cellulaire eiwit expressie. RNA-interferentie is een biologisch proces, waarbij een specifieke mRNA is afgebroken na haar specifieke erkenning door siRNA, waardoor of, idealiter, afschaffing van de expressie van de overeenkomstige eiwit27. In het hier gegeven voorbeeld door monitoring van GFP signaal intensiteit in RSV-GFP-geïnfecteerde cellen, beoordeling van de gevolgen van het monddood maken van de virale nucleocapside mRNA (N) of de host IMPDH mRNA over RSV vermenigvuldiging. IMPDH2 is een purine biosynthetic enzym dat een snelheidsbeperking stap op weg naar de de novo biosynthese van guanine nucleotiden van IMP28katalyseert. Het is dus een regulator van het intracellulaire guanine nucleotide zwembad. IMPDH-remmers, zoals ribavirine, oefenen remmende effecten op RNA virussen, met inbegrip van RSV-infectie29,30,31. Zoals aangegeven in Figuur 6, schaadt de remming van IMPDH expressie virale vermenigvuldiging, zoals aangegeven door de reductie van het GFP-signaal, het nabootsen van de effecten van ribavirine op RSV groei. De virale vermenigvuldiging is ook bijna afgeschaft in aanwezigheid van siRNA gericht op de virale N-eiwit. Dit resultaat werd verwacht aangezien siRNA gericht op de N-eiwit werd verwacht om te voorkomen dat virale nucleocapside vergadering en heeft bewezen sterk schade kunnen toebrengen aan virale replicatie32. Het beheer van deze siRNA door nebulization geremd de latere infectie door RSV in gezonde volwassenen33. Het effect van N of IMPDH siRNA is specifieke sinds de remming van de expressie van de GAPDH, gekozen als een controle-gen, virale vermenigvuldiging in vergelijking met de nontargeting siRNA niet wordt aangetast. Merk op dat de toxiciteit van geen cel werd ontdekt in alle omstandigheden. Samen genomen, valideren deze resultaten de strategie gepresenteerd, die kon worden omhoog geschaald naar high-throughput screening met behulp van siRNA bibliotheken of andere knock-out-methoden, zoals CRISPR-Cas9 technologie34.
Recombinante virussen een fluorescerende fusieproteïne uitdrukken vertegenwoordigen krachtige tools om te studeren virale eiwitten en dynamiek van de virale structuren. RSV uiting geven aan een fluorescerende M2-1 eiwit maakt het mogelijk de waarneming van de dynamiek van IBs en IBAGs. IBs, die kunnen worden beschouwd als RSV virale fabrieken, worden weergegeven als bolvormige dynamische structuren. Ze kunnen samensmelten formulier groter bolvormige structuren (Figuur 8 en film 1). Deze gegevens suggereren dat RSV IBs vloeistof organellen, vergelijkbaar met wat beschreven voor rabiës virus35 is. IBAGs vormen een subcompartment binnen IBs, waarin virale mRNA en M2-1 eiwit concentraat, zoals de genomic RNA, de nucleocapside en de polymerase, zijn alleen aanwezig in de rest van de IBs-12. Videomicroscopie experimenten blijkt dat IBAGs zeer dynamische structuren vertonen vloeibaar eigenschappen (Figuur 9 en Movie 2). Zij kunnen worden beschouwd als vloeibare compartimenten als gevolg van vloeistof-vloeistof faseovergang.
De mogelijkheid van het genetisch manipuleren van virussen blijft een middel bij uitstek om te studeren zowel de mechanismen voor hun vermenigvuldiging en hun gevoeligheid voor medicijnen. Omgekeerde genetica kan nu worden beschouwd als onderdeel van de "klassieke" technieken van de virologie. Het blijft echter lastig voor sommige virussen, zoals RSV. Dit is de reden waarom dit protocol in detail de stappen beschrijft voor het succesvol redden en versterken van recombinante RSVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Qin Yu van AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, voor het verstrekken van de drug AZD4316. De auteurs zijn dankbaar aan het Cymages platform voor toegang tot de ScanR Olympus Microscoop, die werd ondersteund door subsidies uit de regio Ile-de-France (DIM Eén gezondheid). De auteurs erkennen steun van het INSERM en de Universiteit van Versailles Saint-Quentin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
- DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
- DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
- Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
- Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
- Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
- Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
- Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
- Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
- Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
- Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
- Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
- Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
- Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
- Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
- Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
- Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
- Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
- Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
- Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
- McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
- Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
- Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
- Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
- Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
- Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
- Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
- DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).
