Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.
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Artigo de método
Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de vírus recombinantes tornou-se crucial em virologia básica ou aplicada. Genética reversa tem sido provada para ser uma tecnologia extremamente poderosa, tanto para decifrar os mecanismos de replicação viral e para estudar antivirais ou fornecer a plataforma de desenvolvimento de vacinas. A construção e manipulação de um sistema de genética reversa para um negativo-vertente vírus RNA como um vírus sincicial respiratório (VSR), no entanto, continua a ser delicados e requer conhecimentos especiais. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, o que serve como um modelo para replicação do RNA viral e transcrição. Nosso sistema de genética reversa utiliza uma cópia de cDNA do genoma humano de longa estirpe de RSV (HRSV). Este cDNA, bem como a codificação de proteínas virais do complexo da polimerase de cDNAs (L, P, N e M2-1), são colocados em vetores de expressão individual sob sequências de controle do polymerase T7. O transfection desses elementos nas células de BSR-T7/5, que expressam estàvel polymerase T7, permite a replicação citoplasmática e transcrição de recombinação RSV, dando origem a virions geneticamente modificados. Uma nova RSV, que está presente na superfície da célula e no sobrenadante de cultura de BSRT7/5, está reunida para infectar células humanas de HEp-2 para amplificação viral. Duas ou três rodadas de amplificação são necessárias para obter ações virais contendo 1 x 106 a 1 x 107 unidades formadoras de placa (PFU) / mL. Métodos para o ideal da colheita, congelamento e titulação de estoques virais são descritos aqui em detalhes. Ilustramos o protocolo aqui apresentado, criando dois vírus recombinantes expressando respectivamente livre proteína verde fluorescente (GFP) (RSV-GFP) ou viral M2-1 fundida a GFP (RSV-M2-1-GFP). Mostramos como usar RSV-GFP para quantificar a replicação RSV e a RSV-M2-1-GFP para visualizar estruturas virais, bem como a dinâmica da proteína viral em células vivas, usando técnicas de vídeo microscopia.
Introdução
RSV humana é a principal causa de hospitalização por infecção aguda do trato respiratório em crianças em todo o mundo1. Além disso, a RSV é associado com um fardo de doença substancial em adultos comparáveis à gripe, com a maioria da hospitalização e carga de mortalidade no idoso2. Não existem vacinas ou específicas antivirais disponíveis ainda contra RSV, mas prometendo novas drogas estão em desenvolvimento3,4. A complexidade e o peso das técnicas de quantificação de multiplicação RSV impedem a busca de antivirais ou vacinas, apesar dos esforços consideráveis at....
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Protocolo
1. material preparação
- Compra de mídia de célula (soro reduzida mídia, mínimo essencial [MEM], 10 x MEM e Dulbecco modificada do meio da águia [DMEM]), reagente de transfeccao e celulose microcristalina (ver Tabela de materiais).
- Obter os seguintes vetores para genética reversa: o vector(s) genômica e os vetores de expressão de codificação da proteína N e as proteínas complexas de polimerase. Os genômicos vetores contêm o genoma completo do cDNA da RSV-GFP (p-RSV-GFP) e de 1GFP-RSV-M2 (p-RSV-M2-1GFP) a jusante do promotor do bacteriófago T7 RNA polimerase (T7 pol). Os vetores de expressão (designado como p-N, p -P, p-L e p-M2-1) co....
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Resultados
Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para produzir recombinantes vírus RSV, expressando uma proteína fluorescente (Figura 2). Em pRSV-GFP, o gene GFP foi introduzido entre os genes P e M, conforme descrito para o gene cereja em trabalho anteriormente publicado21. No pRSV-M2-1-GFP, o gene M2 foi deixado intocado e um adicional gene que codifica para M2-1-GFP foi inserido entre os genes SH e G12. A p.......
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Discussão
Aqui nós apresentamos um método de resgate de recombinante RSVs de cinco plasmídeos e sua amplificação. A capacidade de manipular o genoma do vírus tem revolucionado a pesquisa de virologia para testar as mutações e expressar um gene adicional ou uma proteína viral marcada. A RSV temos descrito e usado como exemplo neste artigo é um vírus que está expressando um gene repórter, o RSV-GFP (não publicado) e expressa uma proteína M2-1 fundida a uma marca GFP12. Resgate de RSV é desafiador e requer prá.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer Dr. Qin Yu da AstraZeneca R & D Boston, MA, EUA, para fornecer a droga AZD4316. Os autores são gratos à plataforma Cymages para acessar o microscópio ScanR Olympus, que foi apoiado por concede da região de Ile-de-France (uma só saúde DIM). Os autores reconhecem apoio do INSERM e a Universidade de Versailles Saint-Quentin.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 35 mm µ prato para imagem de células vivas | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Informações técnicas e outras informações sobre Avicels estão disponíveis em http://www.fmcbiopolymer.com. Armazene em temperatura ambiente. O protocolo na etapa 4 é otimizado para este reagente. |
| BSRT7/5 | não disponível comercialmente | Consulte a referência 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Solução violeta de cristal | Sigma | HT90132 | |
| Microscópio de fluorescência para observações | Microscópio Olympus | IX73 Olympus | |
| Microscópio de fluorescência para videomicroscopia | Olympus | ScanR Microscópio | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥ 99,5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamina (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol na etapa 2.3. é otimizado para este reagente. |
| MEM (10x), sem glutamina | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, Suplemento GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥ 99,5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Meio de soro reduzido | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Solução aquosa de paraformaldeído, 32%, | Microscopia Eletrônica | 15714 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmídeos | não disponíveis | comercialmenteConsulte a referência 21. Rameix-Welti et al., 2014 | |
| Ver Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool e 3 de 4 siRNAs individuais projetados pela Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Humano L-004330-00-0005 | SMARTpool de 4 siRNAs individuais projetados por Dharmacon. Referências e sequências individuais J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA personalizado | UUCAGAACUAGAGGCUAU e UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Reagente de | |
| Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | protocolo nas etapas 5.1.e 5.1.2 são otimizados para este reagente. | |
| Solução de bicarbonato de sódio a 7,5% | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan Tecan | infinito M200PRO |
Referências
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
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Reimpressões e permissões
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