Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Vi beskriver en metode til at generere og forstærke genetisk modificerede respiratorisk syncytial virus (RSVs) og en optimeret plaque assay for RSVs. Vi illustrere denne protokol ved at oprette to rekombinant vira, der henholdsvis giver mulighed for kvantificering af RSV replikering og live analyse af RSV integrering organer og inklusion organer-associerede granulat dynamik.

Abstract

Brugen af rekombinant vira er blevet afgørende i grundlæggende eller anvendt virologi. Omvendt genetik har vist sig for at være en meget kraftfuld teknologi, både til at dechifrere virusreplikation mekanismer og til at studere antivirale lægemidler eller skabe udviklingsplatform for vacciner. Konstruktion og manipulation af en reverse genetiske system for en negativ-strenget RNA-virus, såsom en respiratorisk syncytialvirus (RSV), dog stadig er delikat og kræver særlig knowhow. RSV genom er en enkelt-strenget, negative-følelse RNA omkring 15 KB, der fungerer som en skabelon for både viral RNA replikering og transskription. Vores omvendte genetik systemet bruger en cDNA kopi af det menneskelige RSV lange stamme genom (HRSV). Denne cDNA samt cDNAs kodning virale proteiner af komplekse polymerase (L, P, N og M2-1), er placeret i individuelle udtryk vektorer under T7 polymerase styringsforløb. Transfektion af disse elementer i BSR-T7/5 celler, som stabilt express T7 polymerase, tillader cytoplasmatisk replikering og transskription af af rekombinante RSV, giver anledning til genetisk modificerede virioner. En ny RSV, som er til stede på cellens overflade og i cellekultur supernatant BSRT7/5, er samlet for at inficere menneskelige HEp-2 celler for viral forstærkning. To eller tre runder af forstærkning er nødvendig for at opnå viral bestande indeholdende 1 x 106 til 1 x 107 plaquedannelse enheder (PFU) / mL. Metoder for den optimale høst, frysning og titrering af viral bestande er beskrevet her i detaljer. Vi illustrerer den protokol, der er præsenteret her ved at oprette to rekombinant vira henholdsvis udtrykke gratis grøn fluorescerende proteiner (NGL) (RSV-NGL) eller viral M2-1 smeltet til normal god landbrugspraksis (RSV-M2-1-NGL). Vi viser hvordan RSV-NGL til at kvantificere RSV replikering og RSV-M2-1-NGL at visualisere viral strukturer samt viral protein dynamics i levende celler, ved hjælp af video mikroskopi-teknikker.

Introduction

Menneskelige RSV er den hyppigste årsag til indlæggelse for akut luftvejsinfektion i spædbørn verdensomspændende1. Derudover er RSV forbundet med en betydelig sygdomsbyrden i voksne sammenlignes med influenza, med de fleste af indlæggelse og dødelighed byrde i den ældre2. Der findes ingen vacciner eller specifikke antivirale endnu mod RSV, men lovende nye lægemidler er i udvikling af3,4. Kompleksiteten og tyngde i teknikker til kvantificering af RSV multiplikation hæmmer søgningen for antivirale lægemidler eller vacciner trods aktuelle betydelige bestræbelser. Kvantificering af RSV multiplikation in vitro-er generelt baseret på omstændelig, tidskrævende og dyre metoder, der består for det meste i analysen af den cytopatisk effekt af mikroskopi, immunfarvning, plaque reduktion assays, kvantitative reverse transkriptase (qRT)-polymerase kædereaktion (PCR) og enzym-forbundet immunosorbent assay tests. Vira med modificerede genomer og udtrykke reporter gener, som koder for normal god landbrugspraksis, er mere velegnede til sådanne screeninger. Koblet til brug af automatiserede plade læsere, kan reporter gen-regnskabsmæssige rekombinant vira gøre disse assays mere egnet til standardisering og høj overførselshastighed.

RSV er et kappebærende, nonsegmented negative-følelse RNA-virus, som tilhører Orthopneumovirus -slægten af Pneumoviridae familie, orden Mononegavirales5. RSV genom er en enkelt-strenget, negative-følelse RNA omkring 15 KB, som indeholder en noncoding region i 3' og 5' yderpunkterne kaldet leder og Trailer og 10 transcriptional enheder kodning 11 proteiner. Generne, der er bestilt som følger: 3'-NS1, NS2, Nielsen, Pedersen, M, SH, G, F, M2 (kodning for M2-1 og M2-2 proteiner) og L-5'. Genomisk RNA er tæt pakket af nucleoprotein N. Brug encapsidated genomisk RNA som skabelon, viral RNA-afhængige RNA polymerase (RdRp) vil sikre transskription og replikering af viral RNA. Viral RdRp er sammensat af de store protein L, der bærer nukleotid polymerase aktivitet i sig selv, sin obligatoriske cofaktor phosphoprotein Pedersen og M2-1 protein, der fungerer som en viral transskription faktor6. I inficerede celler og inducerer RSV dannelse af cytoplasmatisk indeslutninger kaldet optagelse organer (IBs). Morfologisk tilsvarende cytoplasmatisk indeslutninger er blevet observeret for flere Mononegavirales7,8,9,10. De seneste undersøgelser af rabiesvirus, vesikulær stomatitis-virus (VSV), Ebola-virus og RSV viste at viral RNA syntese forekommer i IBs, som kan således betragtes som viral fabrikker8,9,11, 12. virus fabrikker koncentrere RNA og virale proteiner kræves til viral RNA syntese og også indeholde cellulære proteiner13,14,15,16, 17. IBs udviser en funktionel subcompartment kaldet IB-associerede granulat (IBAGs), som koncentrerer de nyligt synthetized spirende viral mRNA sammen med M2-1-protein. Genomisk RNA og L, P og N registreres ikke i IBAGs. IBAGs er små dynamiske sfæriske strukturer inde i IBs, der udviser egenskaber af flydende organeller12. Trods den centrale rolle på IBs i viral multiplikation, er meget lidt kendt om naturen, interne struktur, dannelsen og drift af disse viral fabrikker.

Udtryk af genomet af et poliovirus fra en cDNA aktiveret produktionen af den første smitsomme viral klon i 198118. For enkelt-strenget negative RNA-vira var det ikke indtil 1994, produktion af en første rabiesvirus efter Transfektion af plasmider i celler19 fandt sted. Den første plasmid-baserede omvendt genetiske system for RSV blev udgivet i 199520. Omvendt genetik har ført til store fremskridt inden for virologi. Mulighed for at indføre specifikke ændringer i det virale genom har givet kritisk indsigt i replikation og patogenese af RNA-vira. Denne teknologi har også i høj grad fremmet udviklingen af vacciner ved at tillade særlige dæmpning gennem målrettet række ændringer. Genom ændringer tillader en hurtig kvantificering af viral formering stærkt forbedret antiviral screening og undersøgelse af deres virkemåde.

Selvom tidligere beskrevet, forbliver at opnå genetisk modificerede RSVs delikat. Vi detalje her, en protokol til at oprette to typer af rekombinante HRSV, henholdsvis udtrykke RSV-normal god landbrugspraksis eller RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis. I denne protokol beskriver vi Transfektion forudsætninger for at redde de nye rekombinante vira, samt deres forstærkning at opnå viral bestande med høj titer, velegnet til reproducerbare eksperimenter. Opførelsen af den omvendte genetik vektorer er i sig selv ikke beskrevet her. Vi beskrive metoder for optimal høst og indefrysning af viral bestande. Den mest nøjagtige metode til kvantificering af viral smitsomme partikler forbliver plaque assay. Celler er inficeret med serielle fortyndinger af de analyserede suspension og inkuberes med en overlejring, der forbyder udbredelse af frie viruspartikler i supernatanten. I sådanne forhold, vil virussen kun inficere sammenhængende celler danner en "plaque" for hver indledende smittefarlige partikel. I den konventionelle RSV titrering assay, er plaques afsløret ved immunfarvning og regnes under mikroskopisk observation. Denne metode er dyrt og tidskrævende. Her beskrev vi, en meget enkel protokol for en RSV plaque analyse ved hjælp af mikrokrystallinsk cellulose overlay, der giver mulighed for dannelse af plaques synlige for det blotte øje. Vi viser, hvordan RSV-normal god landbrugspraksis kan bruges til foranstaltning RSV replikering og således, at kvantificere effekten af antivirale lægemidler. Ved at kombinere omvendt genetik og live imaging-teknologi, demonstrere vi hvordan RSV-M2-1-NGL giver forskerne til at visualisere M2-1 i levende celler og følge dynamikken i intracellulære viral strukturer, såsom IBs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. materielle forberedelse

  1. Købe celle medier (nedsat serum medier, minimum essential medier [MEM], 10 x MEM og Dulbecco ændrede Eagle's medium [DMEM]), Transfektion reagens, og mikrokrystallinsk cellulose (Se Tabel af materialer).
  2. Opnå de følgende vektorer for omvendt Genetik: genomisk vector(s) og udtryk vektorer kodning N protein og polymerase komplekse proteiner. Genomisk vektorerne indeholder fuld cDNA genomet af RSV-normal god landbrugspraksis (p-RSV-NGL) og af RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) nedstrøms fra bacteriophage T7 RNA polymerase (T7 pol) promotor. Udtrykket vektorer (udpeget som p-N, p -P, p-L, og p-M2-1) indeholder de kodende sekvens af N, P, Larsen eller M2-1 nedstrøms T7 pol (Se Rincheval et al.12 og Rameix-Welti et al.21 for nærmere oplysninger vedrørende plasmid konstruktioner).
  3. Forberede medier for en cellekultur i et sterilt miljø og Transfektion og infektion. Brug DMEM med 2 mM L-glutamin suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1.000 enheder/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin (eller uden antibiotika) og MEM med 2 mM L-glutamin suppleret med 0%, 2% eller 10% FCS, 1.000 enheder/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin, udpeget som "komplet medium" i følgende protokol.
  4. Hente BSRT7/522 celler og gøre bestande i komplet medium suppleret med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) på 1-2 x 106 celler/mL. Bevare celle bestandene i flydende kvælstof. Få HEp-2 celler. Kultur BSRT7/5 celler i komplet DMEM og HEp-2 celler i komplet MEM ved 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt miljø.
  5. Forberede en 10 x RSV bevarelse løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7,5] i vand) i et sterilt miljø.
  6. Opnå en inverteret fluorescens mikroskop kompatibel med normal god landbrugspraksis fluorescens målinger og kompatibel med live imaging, hvis det er nødvendigt at overvåge en infektion. Opnå en mikrotiterplade læser kompatibel med normal god landbrugspraksis fluorescens målinger til kvantitering af RSV-normal god landbrugspraksis replikering.

2. redning og første Passage af rekombinant Virus

Bemærk: Udfør følgende trin i et sterilt miljø, ved hjælp af en klasse II sikkerhed kabinet.

  1. Dagen før Transfektion, gøre en suspension af cellelinie BSRT7/5 på 5 x 105 celler/mL i komplet medium. Distribuere 2 mL cellesuspension pr. brønd i en 6-godt plade. Forberede et godt pr. virus, der vil blive reddet og et ekstra godt for negativ kontrol. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2. Kontroller, at cellerne er på en 80-90% confluence næste dag.
  2. Frigør omvendt genetik vektorer (fra trin 1.2) p-RSV-normal god landbrugspraksis og p-RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis, samt p-N, p -P, p-L, og p-M2-1. Blanding, for hver virus at redde, 1 µg p-N og p -P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 og 1,25 µg p-RSV (normal god landbrugspraksis eller M2-1 NGL) i et rør.
    Bemærk: Forskellige udtryk vektorer for N, P, Larsen og M2-1 kan anvendes; forholdet mellem proteiner har dog opretholdes. Udføre den negative kontrol ved at erstatte p-RSV vektor med en tom vektor.
  3. Fortsæt til Transfektion, efter Transfektion reagens producentens protokol (se tabel af materialer).
    1. Tilføje 250 µL af reducerede serum medium til de blandede vektorer. I et andet rør, fortyndet 10 µL af Transfektion reagens i 250 µL af reducerede serum medium. Forsigtigt vortexes både rør og vente i 5 min. Bland indholdet af både rør og vente i 20 min. ved stuetemperatur.
    2. Skyl BSRT7/5 celler med 1 mL af reducerede serum medium og distribuere 1,5 mL af MEM med 10% FCS uden antibiotika pr. brønd. Hvis det er nødvendigt, der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 før inkubation beskrevet taktfast 2.3.1 er fuldført.
    3. Tilsættes 500 µL af Transfektion blanding forberedt i trin 2.3.1 til en brønd, når 20 min Inkubationstiden er overstået. Placer cellerne i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 til 3 dage. Ændre ikke næringssubstratet af cellerne i Transfektion.
  4. Observere normal god landbrugspraksis fluorescens (excitations på 488 nm)- og på 515-535 nm i en inverteret fluorescens mikroskop ved 20 x forstørrelse 1 x om dagen for at overvåge rescue effektivitet, ved hjælp af normal god landbrugspraksis filter.
  5. Den anden dag efter Transfektion, seed celler for den første passage af de reddede virus. Der forberedes en suspension af HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplet medium. Distribuere 2 mL cellesuspension pr. brønd i en 6-godt plade (et godt pr. virus til undsætning og en negativ kontrol).
  6. På den tredje dag af Transfektion, scratch celler i hver brønd af transfected BSRT7/5 6-godt plade, ved hjælp af en anden skraber til hver brønd. Overfør hver godt indhold (celler og supernatanten) ind i en steril 2 mL microcentrifuge rør. Vortex hvert rør kraftigt for mindst 30 s til at frigive den reddede virus fra cellemembraner.
    Bemærk: Dette svarer til passage 0 (P0) af de reddede virus (figur 1).
  7. Bruge friske viral P0 suspension til at udføre den første forstærkning af de reddede virus.
    1. Fjern næringssubstratet fra HEp-2 6-godt plade seedede dagen før (Se trin 2,5) og hurtigt tilføje 500 µL af P0 suspension (fra trin 2.6) pr. brønd. HEp-2 pladen anbringes ved 37 ° C på en se-så rocker for bløde agitation for 2 h.
    2. Fjern og kassér den 500 µL af inokulum og der tilsættes 2 mL af MEM med 2% FCS. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 i 3 dage. Dette vil give den første passage (P1) af de reddede virus (figur 1).
  8. Tilføj 1/10 af mængden af 10 x RSV bevarelse løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7,5]) i den resterende P0 suspension (fra trin 2.6). Vortex microtubes kraftigt i 5 s og alikvot indholdet af kryogene rør mærket med alkohol-resistente tags. Fordyb rør i mindst 1 time i alkohol forkølede ved-80 ° C, og opbevar dem ved-80 ° C.
  9. Titreres P0 stock (Se trin 2.6) af hver reddede virus (Se afsnit 4 for mikrokrystallinsk cellulose titrering).
  10. Observere normal god landbrugspraksis fluorescens (excitations på 488 nm)- og på 515-535 nm af HEp-2-celler inficeret med P0 suspension i en inverteret fluorescens mikroskop ved 20 x forstørrelse 1 x om dagen for at overvåge infektionen. Observere under et mikroskop for brightfield udseendet af små syncytia og celle detachement, som afspejler den RSV cytopathogenic effekt (CPE) (Se figur 2).
  11. Bemærk, at redning mislykkedes hvis hverken fluorescens eller CPE er synlig efter 2-3 dage.
  12. Indsamle den første passage (P1) på dag 3 eller 4 som beskrevet i trin 2.6. Kort sagt, skrabe cellerne, indsamle de celler og supernatanten sammen, vortex dem, tilføje bevarelse løsning som beskrevet i trin 2.8, alikvot af prøven, og fryse det.
  13. Titreres (Se afsnit 4 for titreringen assay) og forstærke den første passage (Se afsnit 3 til forstærkning).

3. forstærkning af de reddede virus

Bemærk: Følgende protokol beskriver forstærkningen af de reddede vira i en 75 cm2 kolbe. Tilpasse kolbe størrelse til diskenheden behov og den nødvendige mangfoldighed af infektion (MOI). Tabel 1 angiver diskenheder for forskellige kolber. Udfør følgende trin i et sterilt miljø i en klasse II sikkerhed kabinet.

  1. Der forberedes en suspension af HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplet medium, dagen før forstærkning. Distribuere 15 mL cellesuspension pr. 75 cm2 kolbe og inkuberes kolber på 37 ° C og 5% CO2. Forberede en kolbe pr. virus til at forstærke.
  2. Dagen efter starten af inkubation, Kontroller, at cellerne er 80 – 100% sammenflydende.
  3. Fortynd den virale suspension fra trin 2.12 i MEM uden FCS at opnå en 3 mL suspension på 50.000 PFU/mL (svarende til en MOI af 0,01 PFU/celle).
  4. Fjern mediet og hurtigt tilføje 3 mL viral suspension. Kolben anbringes ved 37 ° C på en se-så rocker for bløde agitation for 2 h.
  5. Fjern og kassér inokulat og der tilsættes 15 mL MEM med 2% FCS. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 2-4 dage.
  6. Tjek celle morfologi og normal god landbrugspraksis fluorescens (excitations på 488 nm)- og på 515-535 nm i en inverteret fluorescens mikroskop ved 20 x forstørrelse for at anslå det rigtige tidspunkt at høste vira. Bemærk at dette er normalt, når 50%-80% af HEp-2 cellelag er frakoblet på grund af RSV CPE, der opstår mellem h efter infektion for 48 og 72 (PI) (Se figur 3).
  7. Skrab alle celler ved hjælp af en celle skraber. Samle både cellerne og supernatanten og overføre dem til en 50 mL-centrifugerør.
  8. Tilføj 1/10 af rumfanget af 10 x RSV bevarelse løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7,5]). Vortex rør kraftigt i 5 s og præcisere suspensionen af en 5 min centrifugering ved 200 x g.
  9. Overføre supernatanten til en 50 mL tube. Vortex kort og alikvot suspension i kryogene rør mærket med alkohol-resistente tags. Fordyb rør i forkølede-80 ° C alkohol i mindst 1 time og opbevar dem ved-80 ° C.
  10. Frigør en af delprøver til titreres viral suspension (Se afsnit 4).

4. plaque titrering Assay

  1. Forberede titrering dagen før titrering analysen udføres 12-godt plader (seks brønde skal titreres et rør af virus). Seed brønde med 1 mL HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplet medium.
  2. Den næste dag, forberede en steril mikrokrystallinsk cellulose suspension (2.4% [w/v] i vand) (se tabel af materialer).
    1. Sprede 2,4 g af mikrokrystallinsk cellulose pulver i 100 mL destilleret vand, ved hjælp af en standard magnetomrører, indtil fuldstændig opløsning pulver (normalt 4 – 12 h). Autoklave suspension ved 121 ° C i 20 min., og opbevar den ved stuetemperatur før anvendelse.
      Bemærk: Under sådanne betingelser er suspensionen holdbar i 1 år.
    2. Efter åbning af løsningen i et sterilt miljø, skal du gemme det ved 4 ° C for 6 måneder. Altid blande suspension før brug (af hånd ryster eller vortexing) for at sikre det er homogen.
  3. Forberede 2 x MEM i et sterilt miljø. Fortynd kommercielle MEM 10 x med sterilt vand og tilsæt L-glutamin, 1.000 enheder/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin. Ryst fortyndingen kraftigt og opbevares ved 4 ° C.
    Bemærk: Udfør trin 4.4 – 4.10 i et sterilt miljø ved hjælp af en klasse II sikkerhed kabinet.
  4. Forberede seks rør indeholdende 900 µL af MEM uden FCS pr. virus til titreres (titrering rør). Tø virus delprøver, vortex dem kraftigt i 5 s og overføre 100 µL til første titrering tube.
  5. Udføre en tidobbelt fortynding 6 x, som følger. Tilsæt 100 μL af virus til 900 μl af medium i det første rør, sætte hætten på røret, og blande indholdet af vortexing i et par sekunder. Ændre spidsen på pipetten, tilføje 100 µL af den første fortynding til 900 µL af medium i det andet prøveglas, sætte hætten på tube, og vortex. Gentag proceduren indtil sjette røret.
    Bemærk: Det er meget vigtigt at ændre tip for hver fortynding.
  6. Skrive virus navn og Folds fortyndinger på HEp-2 12-godt plader. Tilføj et mærke til at matche pladen og omslaget, fordi de kan adskilles under farvning (trin 4.9). Fjern mediet fra pladerne og distribuere 400 µL af en fortynding pr. brønd. Inkuber plader ved 37 ° C i 2 timer, til virus adsorption.
    Bemærk: Ændre pipette spidsen mellem hver inokulum eller fortsætte fra laveste til højeste koncentration med den samme tip. Podes en begrænset række plader (1 til 2) samtidig for at undgå cellerne tørring.
  7. Forberede mikrokrystallinsk cellulose overlay under virus adsorption (tilberedning). For at opnå 100 mL af overlay, Bland 10 mL af 2,4% mikrokrystallinsk cellulose suspension, 10 mL 2 x MEM, og 80 mL af MEM med 2% FCS.
    1. PH-værdien af 2 x MEM til omkring 7.2 med en steril natriumbikarbonat løsning på 7,5%, efter farve indikator. Tilføj mikrokrystallinsk cellulose suspension og MEM og bland kraftigt.
  8. I slutningen af 2 h inkubation, Tilføj 2 til 3 mL af overlay til hver brønd af 12-godt plader uden at fjerne inokulat. Vær omhyggelig med at undgå kontaminering af de tilstødende brønde med høje viral titer inoculums. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 i 6 dage. Flyt ikke pladen og Flyt ikke rugemaskinen under inkubation.
  9. Fortsæt til pletten celler, ved hjælp af krystalviolet løsning (8% krystalviolet [v/v], 2% formaldehyd [v/v] og 20% ethanol [v/v] i vand).
    1. Beskytte bordpladen af biosikkerhed kabinet med et ark (krystalviolet kraftigt farver overflader).
    2. Ryst forsigtigt plader til tage af mikrokrystallinsk cellulose overlay. Fjerne analysere og vaske celler 2 x med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Håndtere plader én efter én for at undgå cellerne tørring. Tilføje 1-2 mL af opløsningen, krystalviolet og vente 10 – 15 min. Fjern den løsning, der kan genbruges i efterfølgende plade farvning.
    3. Fordyb plader og låg i frisk blegemiddel i et par sekunder, og derefter vaske dem grundigt med postevand. Bemærk at plader og covers er dekontamineres ved blegemiddel.
    4. Sæt plader og låg på papirhåndklæder og lad dem tørre. Tør plader ved en omgivende temperatur efter vand skylle og opbevar dem ved stuetemperatur. For lang opbevaring perioder (måneder), holde pladerne beskyttet mod lys for at beskytte farven. Bemærk, at hvis cellerne mister deres farve, de kan farves igen med krystalviolet.
  10. Beregne virus titers. Tælle plaques i wells af de tørre plader, som er synlige for det blotte øje. Kontroller, at antallet af plaques i de forskellige fortyndinger er sammenhængende (faktor 10 mellem hver fortynding). Vælg den godt, plaques er de nemmeste at tælle. Vurdere antallet af plaques versus inokulum volumen og fortynding.
    Bemærk: På eksemplet i figur 4, tælles 21 plaques på 10-5 fortynding. Disse svarer til en titer på
    Equation
    Equation

5. anvendelse af HRSV-NGL rekombinant Virus at kontrollere virusreplikation i celler behandles med små interfererende RNA eller antivirale lægemidler

Bemærk: Udfør alle trin undtagen 5.1 og 5.2.5 i et sterilt miljø ved hjælp af en klasse II sikkerhed kabinet.

  1. Overvågning af effekten af cellulære genhæmning på RSV multiplikation
    Bemærk: Transfektion protokol afhænger af reagenset (Se Tabel af materialer).
    1. Forberede 96-brønd plader for normal god landbrugspraksis måling. To dage før analysen, for i betragtning af små interfererende RNA (siRNA), forberede en opløsning af reduceret serum medier indeholdende siRNA ved en koncentration på 100 nM og en siRNA Transfektion reagens fortyndet til 1/500. Inkuber løsning i 30 min. ved stuetemperatur.
    2. Tilføje 25 µL af opløsningen til pladens huller, forberedt i 5.1.1 (i tre eksemplarer). Froe wells med 75 µL af en suspension af A549 celler på 4 x 105 celler/mL i komplet medium uden antibiotika for at opnå en endelig celle koncentration af 3 x 105 celler/mL. Inkuber plade i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
      Bemærk: Den endelige siRNA koncentration er 25 nM og endelige Transfektion reagens volumen er 0,5 µL/brønd).
    3. Inficere celler som følger. Fjern mediet fra brøndene. Tilsæt 100 µL af RSV-normal god landbrugspraksis suspension på 50.000 PFU/mL og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Fjern viral suspension og tilsæt 100 µL af DMEM med 2% FCS og uden phenol rød. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2.
    4. På 24 h og 48 h p.i., måle fluorescens, ved hjælp af en spectrofluorometer sat til excitations- og bølgelængder af 488 og 520 nm, henholdsvis (Fluorescens er udtrykt i relative fluorescens enheder). Brug noninfected A549 celler som standarder for fluorescens og baggrunden niveauer.
      Bemærk: Cellerne skal fastgøres med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) før måling dem uden plade cover.
  2. Vurdering af stoffet hæmning ved hjælp af RSV-normal god landbrugspraksis
    1. Forberede 96-brønd plader for normal god landbrugspraksis måling. Dagen før analysen, froe wells med 100 µL af en suspension af HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplet medium uden phenol rød.
    2. Forberede en seriel fortynding af de testede narkotika (AZ4316 i dette eksempel) i MEM suppleret med 2% FCS og antibiotika (50 µL pr. brønd). Forberede en viral suspension på 10.000 PFU/mL i MEM uden stromale vaskulære faktor (SVF) og phenol rød (50 µL pr. brønd).
    3. Fjern mediet fra 96-brønd HEp-2 plade og tilsæt 50 µL af narkotika suspension og 50 µL af den virale suspension (i tre eksemplarer). Udføre en mock infektion parallelt som et kontrolelement.
      Bemærk: Drug fortynding og viral suspension kan blandes før du tilføjer dem på cellerne, eller de kan tilføjes sekventielt.
    4. Inkuber plade i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    5. Måle fluorescens, ved hjælp af en spectrofluorometer, som beskrevet i trin 5.1.4. Bruge mock-inficerede HEp-2 celler som standarder for fluorescens baggrundsværdier.

6. karakterisering af M2-1 lokalisering In Vivo med RSV-M2-1-NGL rekombinant Virus

Bemærk: Udfør trin 6.1 og 6.2 i et sterilt miljø, ved hjælp af en klasse II sikkerhed kabinet.

  1. Der forberedes en suspension af HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i komplet medium. Frø 1,5 mL cellesuspension i en 35 mm petriskål permeant til CO2 og tilpasset til live imaging.
  2. Udføre infektion dagen efter såning med virussen RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis på MOI 1, som beskrevet i trin 3.3-3.5 (fjerne medium, tilsættes 500 µL til 1 mL inokulum, og Inkuber prøve ved 37 ° C mens forsigtigt ryste for 2 h; fjerne inokulat og der tilsættes 1,5 mL MEM med 2 % FCS). Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 til den ønskede tid (IBs vil begynde at dukke op fra 10 h p.i.).
  3. Forvarm inkubation kammer i en inverteret mikroskop udstyret med 40 x 100 x mål ved 37 ° C, før placere petriskål med de inficerede celler på scenen. Åbn CO2 levering og vente på fokus stabilisering.
  4. Udføre imaging med normal god landbrugspraksis-kompatible filtre, under en lav excitation intensitet og billede frekvens (fra 1 til 0,1 billede pr. min) for at minimere fototoksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette arbejde beskrev vi en detaljeret protokol for at producere rekombinant RSV vira at udtrykke en fluorescerende proteiner (figur 2). I pRSV-normal god landbrugspraksis, blev normal god landbrugspraksis genet introduceret mellem P og M gener, som beskrevet for kirsebær genet i tidligere udgivne arbejde21. I pRSV-M2-1-NGL, M2 gen var urørt og en yderligere genet koder for M2-1-normal god landbrugspraksis var indsat mellem SH og G gener12. Det første skridt, svarende til redning af virus i BSRT7/5 celler, er vist i figur 2A. Små klynger af grøn fluorescerende celler var synlige 72 h posttransfection i wells svarende til RSV-normal god landbrugspraksis og RSV-M2-1-NGL redning. Den fluorescerende signal kunne observeres i både cytoplasma og kerner i RSV-normal god landbrugspraksis-inficerede celler, svarende til ekspression af gratis af normal god landbrugspraksis. Derimod i RSV-M2-1-NGL redning, kunne lille fluorescerende cytoplasmatisk prikker observeres, svarende til M2-1-normal god landbrugspraksis ophobning i IBs. Normalt er ingen CPE (syncytia, fritliggende celler) observeret på dette trin. Omvendt, i det andet trin, svarende til virus forstærkning (første passage) på HEp-2 celler, CPE var synlig i inficerede celler på 72 h p.i. (figur 2B). Figur 3A B viser stærk CPE af RSV infektion, karakteriseret ved store syncytia, løsriver sig eller ikke, og mange flydende celler. Både syncytia og celler udstillet lyse grønne fluorescens. Figur 3A viser udviklingen i de cytopatisk effekt mellem 24 og 72 h p.i. i celler inficeret med virussen RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis. Et par spredte fluorescerende celler var synlige på 24 h p.i. uden en påviselig CPE. Lille syncytia (klynge af fluorescerende celler) og et par fritliggende celler/syncytia begyndt at dukke op på 48 h p.i. store fluorescerende syncytia og flydende celler var klart synlige på 72 h p.i.

Billeder af plaque titrering assay og viral titers svarende til hele processen med RSV produktion er vist i figur 5. Udfører plaque assay på den negative kontrol, transfekteret med kun udtryk plasmider af N, P, Larsen og M2-1, viste ingen plak på den laveste fortynding. Titers opnået fra de transfected celler forventedes at være over 100 PFU/mL, hvis redning var effektiv, som vist i figur 5. Titers steg derefter, over passagerne, at nå 106– 107 PFU/mL på passage 1 eller 2. Bemærk at de virale titers var ens mellem de to rekombinante vira.

Celler var transfekteret med siRNA målretning mRNA af en viral protein (N) eller to cellulære proteiner (inosine-5'-monophosphate dehydrogenase [IMPDH] og glyceraldehyd 3'-phosphat dehydrogenase [GAPDH]). Celler var også transfekteret med nontargeting siRNA. Figur 6 viser overvågning af RSV multiplikation ved hjælp af RSV-normal god landbrugspraksis virus på siRNA-behandlede celler. Et stærkt signal om normal god landbrugspraksis konstateredes (figur 6A) og målte (fig. 6B) på kontrol celler transfekteret med nontargeting siRNA eller celler transfekteret med siRNA mod GAPDH mRNA. Derimod var udtrykket normal god landbrugspraksis faldet i inficerede celler, der udtrykker siRNA rettet mod N eller IMPDH. Bemærk at vi bekræftet, at normal god landbrugspraksis fluorescerende signal i RSV-normal god landbrugspraksis-inficerede celler på 48h p.i. var korreleret med den virale dosis som tidligere demonstreret for en lignende rekombinant RSV udtrykker kirsebær (RSV-kirsebær)21. For at vurdere stoffet effektivitet på RSV multiplikation, inficeret HEp-2-celler med RSV-normal god landbrugspraksis for 48 h i overværelse af forskellige stof koncentrationer. Vi observeret en stærk nedgang af normal god landbrugspraksis signal, som nåede baggrundsstøjen (der var et signal om observeret på ikke-inficerede celler), i nærværelse af en øget drug koncentration, som vist i figur 7. Den observerede IC50 for AZD4316 var omkring 4 nM, svarende til den offentliggjorte EC50 på omkring 2 – 40 nM mod forskellige HRSV stammer23. Analyse af dynamikken i IBs og IBAGs i levende celler, takket være RSV-M2-1-NGL, er vist i figur 8 og figur 9 (og film 1 og film 2). IBs vises som mobile sfæriske strukturer at sammensmelte, danner en større sfæriske inklusion. IBAGs er meget dynamisk. De gennemgår løbende forsamling-demontering cyklusser med dannelsen af små IBAGs, der vokser, fuse til store IBAGs, og derefter forsvinde.

Plade eller kolbe HEp-2 celler skal forhåndsudfyldes dagen før Medium volumen (mL) Virus inokulum volumen (mL)
150 cm2 kolbe 15 x 106 30 5
75 cm2 kolbe 7.5 x 106 15 3
25 cm2 kolbe 2.5 x 106 5 1
6-godt plade 1 x 106 2 0,5

Tabel 1: Antallet af celler og inokulum volumen til brug i forskellige beholdere.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af rednings- og forstærkning trin. Transfektion af udtryk vektor af N, P, Larsen, M2-1 og RSV antigenomic RNA i BSRT5/7 celler (redning). Udtryk for den antigenomic RSV RNA og mRNA af N, P, Larsen og M2-1, af T7 RNA-polymerase. N, P, Larsen og M2-1 proteinerne replikere og omskrive genomisk RNA, indlede en viral multiplikation cyklus. Nye viruspartikler er produceret og formere sig, giver anledning til at i P0. Virussen høstet fra rescue (P0) forstærkes derefter på HEp-2 celler til at producere en højere titer viral suspension (P1) (forstærkning). Dette forstærkes derefter for at få viral bestande. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: CPE og mønster af fluorescens observeret under redning af RSV-normal god landbrugspraksis og RSV-M2-1-NGL. (A) BSRT5/7 celler blev transfekteret med den omvendte genetik vektorer, som anført, og fase-kontrast og fluorescens billeder blev taget på 72 h posttransfection. Den negative kontrol (Neg Ctrl) svarer til celler transfekteret med udtryk vektorer af N, P, Larsen og M2-1 uden den omvendte genetiske vektor. (B) HEp-2-celler blev smittet med virussen høstet fra transfected BSRT5/7 celler (nul passage, 72 h posttransfection) og billeder blev taget 72 h efter infektionen er sket. De viste billeder er repræsentative felter; Skalalinjen = 100 µm. Området boxed omslutter celler vist i forstørrelse; Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udviklingen af CPE og fluorescens observeret under forstærkningen af rekombinant RSV. HEp-2-celler blev smittet på et MOI 0,01 PFU/celler i 72 timer med den første passage af (A) RSV-M2-1-NGL eller (B) RSV-normal god landbrugspraksis. Fasekontrast og fluorescens billeder blev taget på 24, 48 h, og 72 timer efter infektionen er sket. De viste billeder er af en repræsentativ felt. Skalalinjen = 100 µm. Området boxed omslutter celler vist i forstørrelse; Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bestemmelse af RSV titer ved hjælp af plaque assay. (A) resultaterne af plaque titrering analysen i en 12-godt plade. Seks brøndene inficeret med serielle fortyndinger af en viral bestand er vist. Fortyndinger er angivet i en base-10 logaritme. Celler inficeret med de tre første fortyndinger er alle adskilt. Plaque numre observeres med den 10-4, 10-5, og 10-6 fortyndinger er konsekvent. (B) Illustration af optællingen plaque (gule tal). Den grønne stjerne angiver ridser på cellelag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: titrering af en reddede og forstærkede virus. Plaque fænotyper af RSV-normal god landbrugspraksis og RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis på de forskellige passager analyseres på HEp-2 celler i en 12-godt plade (billederne viser helhed af brøndene). Titers af de efterfølgende passager er vist i tabellen. Repræsentative data vises. Fortyndinger af de virale bestande er angivet i en base-10 logaritme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: hæmning af RSV-normal god landbrugspraksis udtryk af siRNA målretning RSV N eller IMPDH. A549 celler blev behandlet med kontrol nontargeting siRNA (NT) (lys blå bjælke) eller siRNA målretning GAPDH (blå linje), RSV N (orange bjælke) eller IMPDH2 (grøn bar) for 48 h og derefter inficeret med RSV-normal god landbrugspraksis på en MOI af 0,05 PFU/celle. Den grønne fluorescens blev læst på 48 timer efter infektion. (A) repræsentative billeder af RSV-normal god landbrugspraksis-inficerede celler på 48 h p.i., behandlet med siRNA, som ses på billederne. Skalalinjen = 100 µm. (B) dataene er den gennemsnit ± SD af to uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: hæmning af RSV-normal god landbrugspraksis multiplikation af AZD4136 sammensatte. HEp-2 celler i 96-brønd plader blev smittet med RSV-normal god landbrugspraksis på en MOI af 0,05 PFU/celle i overværelse af serielle fortyndinger af AZD4316 sammensatte eller kontrol DMSO. Den grønne fluorescens blev læst på 48 h p.i. Data er gennemsnit ± SD af to uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: analyse af dynamikken i IBs ved at spore de fluorescerende proteiner M2-1-normal god landbrugspraksis i HEp-2-inficerede celler af tid bortfalder mikroskopi. På 18 h p.i., blev celler afbildet hvert 5 min til 5 h med et fluorescens mikroskop, i et kammer, opvarmet ved 37 ° C. IBs er fluorescerende (grøn), fordi de er værter for M2-1-normal god landbrugspraksis, og cellekerner farves med Hoechst (blå). De hvide pile angiver IBs undergår fusion. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: analyse af dynamikken i IBAGs i RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis-inficerede celler af tid bortfalder mikroskopi. På 18 h p.i., blev celler afbildet med et fluorescens mikroskop, i et kammer, opvarmet ved 37 ° C. M2-1-normal god landbrugspraksis protein blev visualiseret ved grønne fluorescens. De hvide pile angiver IBs undergår en sammensmeltning af IBAGs. Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Movie 1: In vivo analyse af dynamikken i IBs i RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis i HEp-2-inficerede celler. På 18 h p.i., blev celler afbildet hvert 5 min til 5 h med fluorescens mikroskop, i et kammer, opvarmet ved 37 ° C. Skalalinjen = 10 µm. Den resulterende film viser 7 rammer/s (fps). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Movie 2
Movie 2: In vivo analyse af dynamikken i IBAGs i RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis-inficerede celler. På 18 h p.i., blev celler afbildet hvert 5 min for 3 timer og 40 min med fluorescens mikroskop, i et kammer, opvarmet ved 37 ° C. Skalalinjen = 2 µm. Den resulterende film viser 4 fps. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her vil vi præsentere en metode til redning af rekombinante RSVs fra fem plasmider og deres forstærkning. Evnen til at manipulere genomet af virus har revolutioneret virologi forskning for at teste mutationer og udtrykke en yderligere gen eller en mærket virale proteiner. RSV har vi beskrevet og brugt som et eksempel i denne artikel er en virus, der udtrykker en reporter gen, RSV-normal god landbrugspraksis (upubliceret) og udtrykker en M2-1 protein smeltet til en normal god landbrugspraksis tag12. RSV redning er udfordrende og kræver praksis. Transfektion effektivitet er kritisk, afhængigt af et klogt valg af Transfektion reagens og en forudgående optimering af Transfektion protokol. Anvendelse af celler, der udtrykker bacteriophage T7 pol er obligatorisk, fordi den viral cDNA er placeret nedstrøms T7 pol promotor i de fleste af de omvendte genetiske vektor. Et alternativ er at udtrykke T7 pol fra en vaccinia helper virus. Men brugen af celler, der stabilt udtrykker T7 pol undgår nødvendigheden af at adskille de to vira og forhindrer mulige indblanding af vaccinia med undsætning. Det er vigtigt at udføre den første passage af den omvendte genetiske (P0 til P1) uden at fryse inokulum for at sikre maksimal rescue effektivitet. Dette indebærer, at MOI ikke kontrolleres. Imidlertid på dette trin forbliver titers meget lave, hvilket resulterer i en lav MOI til den første passage. For at opnå RSV bestande med høj smitsomme titers (106– 107 PFU/mL), er det vigtigt at afvente en stærk CPE og skrabe celler for at samle de virale partikler knyttet til cellerne. I denne undersøgelse steget titers ikke efter 96 timer p.i. Den hurtige afkøling af viral suspensionen er vigtigt at opretholde høje titers. I stedet kan for af en fordybelse i alkohol forkølede ved-80 ° C, dette opnås ved nedsænkning i en tøris/ethanol mix eller i flydende nitrogen. Tilføjelse af bevarelsen løsning vil sikre en længere stabilitet virussuspension ved-80 ° C. Opbevaring ved-80 ° C er kritisk, da virussen vil hurtigt tab sin smitteevne, når den opbevares ved-20 ° C eller i flydende nitrogen. Vi beskrevet RSV forstærkning på HEp-2 celler, som er den mest populære cellelinie at vokse RSV, men det er også i stand til at vokse effektivt på mange andre cellelinjer in vitro. Bemærk dog, at væksten på Vero celler kan resultere i en ændring i G udtryk24.

Vi beskrevet en meget enkel protokol af plaque titrering af RSV ved hjælp af en mikrokrystallinsk cellulose overlay. Alle titrering assays er følsomme over for forurening med høj titer suspensioner, der kræver omhyggelig manipulation. Konventionelle RSV titrering assays bruge Agarosen eller natriumcarboxymethylcellulose cellulose (CMC) overlejringer og kræver immunfarvning og mikroskopiske observationer for titer bestemmelse. En protokol bruger immundiffusion grade Agarosen er blevet beskrevet at aktivere direkte visualisering af plaques uden immunfarvning25. Men HEp-2-celler er meget følsomme over for en opvarmet agar overlay, hvilket gør denne protokol vanskeligt at bruge for flere virus titreringer (f.eks. et for varmt overlay ødelægger cellelag); på den anden side, når det er ikke varm nok, størkner det efter den første plade distribution. Brugen af mikrokrystallinsk cellulose til en mindeplade assay har første gang beskrevet af Matrosovich et al. for en influenza A virus titrering assay26. Takket være dens lave viskositet er mikrokrystallinsk cellulose overlay let at give afkald og til at fjerne fra plade brønde, hvilket gør det foreneligt med 96 brønde plader. Det er således især tilpasses serologiske undersøgelser og narkotika følsomhedsanalyser. Bemærk, at da mikrokrystallinsk cellulose ikke behøver at være opvarmet, narkotika kan nemt inkorporeres i overlejringen. Det er imidlertid vigtigt, at pladerne forbliver helt stille under inkubation; ellers vil stor komet-formede foci danne i stedet for runde plaques. Plaque åbenbaring med krystalviolet er billige og enkle, men denne løsning er giftigt og skal bortskaffes korrekt. Genanvendelse af løsningen begrænser affaldsproduktion. Desuden, denne metode er følsomme over for éncellelag celleskader, der vises som falsk hvide pletter, der ikke er viral plaques. Et eksempel er vist i figur 4 (grøn stjerne). For at forhindre denne bias, 1) celler skal håndteres med forsigtighed for at undgå at ridse eller rødmen celle éncellelag, 2) aspiration og udlevering altid har gjort på samme sted at afgrænse skaden på et kendt område 3) falske hvide pletter kan identificeres Takket være deres form (ikke sfærisk), deres skarpe kanter og deres holdning. Vi brugte først Avicel RC 581, som tidligere udgivne21,26. Dog RC 581 er ikke længere tilgængelig, og vi med held erstattes det af RC 591. For at tilpasse denne analyse til andre par, celle-virus, har koncentrationen af mikrokrystallinsk cellulose fastsættes afhængigt af virus og cellerne. For meget mikrokrystallinsk cellulose kan være giftigt for celler og føre til små platter, for lidt vil føre til udbredelsen af virus i medium.

Vi beskrevet to eksempler på brugen af RSV-normal god landbrugspraksis virus at overvåge RSV multiplikation: tilstedeværelse af et antiviralt stof, eller når silencing en cellulær protein. Vi viste, at normal god landbrugspraksis signal er korreleret med viral multiplikation. Metoden præsenteres her tillader ubesværet evaluering af viral multiplikation i realtid. Det gør det muligt for forskerne at nemt bestemme IC50 for et antiviralt stof, som vist i figur 7. Vigtigst, kan denne måling tilpasses til brug i medium eller bredbånd, især for screening af kemiske biblioteker. Denne reporter at udtrykke virus kan også være nyttigt at vurdere effekten på virus multiplikation af en graduering ekspression af cellulære proteiner. RNA-interferens er en biologisk proces, hvorved en bestemt mRNA er nedbrudt efter dens specifikke anerkendelse af siRNA, dermed reducere eller afskaffe ideelt, udtryk for den tilsvarende protein27. I eksemplet her, ved at overvåge normal god landbrugspraksis signal intensitet i RSV-normal god landbrugspraksis-inficerede celler, vurderet vi virkningen af hæmning af den virale nucleocapsid (N) mRNA eller vært IMPDH mRNA på RSV multiplikation. IMPDH2 er en purin biosyntetiske enzym, der katalyserer en trafikhastighedsbegrænsning skridt mod de novo biosyntesen af guanin nukleotider fra IMP28. Det er således en regulator af den intracellulære guanin nukleotid pool. IMPDH hæmmere, såsom ribavirin, udøve hæmmende virkninger på RNA-vira, herunder RSV infektion29,30,31. Som vist i figur 6, hæmmer hæmning af IMPDH udtryk viral multiplikation som angivet ved reduktion af normal god landbrugspraksis signal, efterligne virkningerne af ribavirin på RSV vækst. Ligeledes, den virale multiplikation er næsten afskaffet i overværelse af siRNA målretning viral N protein. Dette resultat var forventet da siRNA målretning N protein forventedes at forhindre virale nucleocapsid forsamling og har vist sig stærkt forringer virusreplikation32. Administrationen af disse siRNA af nebulization hæmmet den efterfølgende infektion med RSV i raske voksne33. Effekten af N eller IMPDH siRNA er specifikke siden hæmning af GAPDH udtryk, valgt som en kontrol gen, forringe ikke viral multiplikation i forhold til den nontargeting siRNA. Bemærk at ingen celle toksicitet blev fundet i alle betingelser. Taget sammen, validere disse resultater strategien præsenteret her, som kunne være op skaleret til høj overførselshastighed screening ved hjælp af siRNA biblioteker eller andre knockout metoder, såsom CRISPR-Cas9 teknologi34.

Rekombinant vira at udtrykke en fusion fluorescerende proteiner repræsenterer kraftfulde værktøjer til at studere virale proteiner og viral strukturer dynamik. RSV udtrykker en fluorescerende M2-1 protein giver mulighed for observation af dynamikken af IBs og IBAGs. IBs, der kan betragtes som RSV viral fabrikker, vises som sfæriske dynamiske strukturer. De er i stand til at smelte sammen til at danne større sfæriske strukturer (figur 8 og Movie 1). Disse data tyder på at RSV IBs er flydende organeller, svarende til hvad der er blevet beskrevet for rabies virus35. IBAGs repræsenterer en subcompartment inde i IBs, hvor viral mRNA og M2-1 protein koncentrat, såsom genomisk RNA, nucleocapsid og polymerase, er kun til stede i resten af IBs12. Video mikroskopi eksperimenter viser, at IBAGs er meget dynamiske strukturer udstiller flydende egenskaber (figur 9 og Movie 2). De kan betragtes som flydende rum som følge af væske-væske fase overgang.

Muligheden for genetisk manipulere virus forbliver et værktøj af valg til at studere begge mekanismerne i deres formering og deres følsomhed over for narkotika. Omvendt genetik kan betragtes nu som en del af de "klassiske" teknikker for virologi. Det er imidlertid vanskelige for nogle virus, ligesom RSV. Dette er grunden til, at denne protokol beskriver i detaljer de skridt at redde og forstærke rekombinante RSVs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Qin Yu fra AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, for at give AZD4316 stoffet. Forfatterne er taknemmelig for, at Cymages platform for adgang til ScanR Olympus mikroskop, som blev støttet af tilskud fra regionen Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Forfatterne anerkender støtte fra INSERM og Versailles Saint-Quentin Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 146 Reverse genetik respiratorisk syncytial virus infektion rekombinant virus forstærkning titrering tag fluorescens kvantificering video mikroskopi
Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouillier, C., Rincheval, V.,… More

Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter