Summary
هنا، نقوم بإظهار الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من النواقل الفيروسية في القشرة كنهج فعال ومبسط لتحقيق التعبير البصري الجيني عبر المناطق القشرية الكبيرة في الدماغ macaque.
Abstract
في الجينات البصرية غير البشرية (NHP)، غالباً ما تكون إصابة المناطق القشرية الكبيرة بالنواقل الفيروسية مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، نبرهن على استخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من ناقلات الفيروسية البصرية في الحسية الجسدية الأولية (S1) والمحرك (M1) القشرية من المكاك للحصول على كفاءة، والتعبير القشرية على نطاق واسع من قنوات أيون حساسة للضوء. تم حقن ناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدينو (AAV) التي ترمز إلى أوبسين C1V1 المنصهر ة إلى بروتين فلوري أصفر (EYFP) في قشرة المكاك ريسوس تحت CED الموجهة بالرنين المغناطيسي. بعد ثلاثة أشهر من التسريب، أكد التصوير الفلورسنت مناطق كبيرة منالتعبير البصري (> 130 مم 2) في M1 و S1 في اثنين من المكاك. وعلاوة على ذلك، تمكنا من تسجيل استجابات موثوقة للفيزيولوجيا الكهربائية التي تثير الضوء من المناطق التي تعبر عن ذلك باستخدام صفائف الكورتيكوستيصور ية الدقيقة. في وقت لاحق التحليل النسيجي وتلطيخ المناعة ضد مراسل كشفت عن التعبير البصريات واسعة النطاق وكثيفة في M1 و S1 المقابلة للتوزيع المشار إليه من قبل التصوير الفلورسنت. هذه التقنية تمكننا من الحصول على التعبير عبر مناطق واسعة من القشرة في غضون فترة أقصر من الزمن مع الحد الأدنى من الضرر مقارنة مع التقنيات التقليدية ويمكن أن يكون النهج الأمثل للتسليم الفيروسي البصري في الحيوانات الكبيرة مثل NHPs. هذا النهج يدل على إمكانات كبيرة للتلاعب على مستوى الشبكة من الدوائر العصبية مع خصوصية من نوع الخلية في النماذج الحيوانية التطورية القريبة من البشر.
Introduction
علم الوراثة البصرية هو أداة قوية تسمح بالتلاعب في النشاط العصبي ودراسة اتصالات الشبكة في الدماغ. تنفيذ هذه التقنية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) لديه القدرة على تعزيز فهمنا للحساب العصبي على نطاق واسع, الإدراك, والسلوك في الدماغ الرئيسيات. على الرغم من أن علم الوراثة البصرية قد نفذت بنجاح في NHPs في السنوات الأخيرة1،2،3،4،5،6،7،وهو التحدي الذي يواجه الباحثون تحقيق مستويات عالية من التعبير عبر مناطق الدماغ الكبيرة في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم نهج فعال ومبسط لتحقيق مستويات عالية من التعبير البصري في جميع أنحاء مناطق واسعة من القشرة في المكاك. هذه التقنية لديها إمكانات كبيرة لتحسين الدراسات البصريات الحالية في هذه الحيوانات في تركيبة مع الدولة من بين الفن تسجيل8و9 والتحفيز البصري10 التكنولوجيات.
الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) هو وسيلة راسخة لتسليم العوامل الدوائية وغيرها من الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك ناقلات الفيروسية، إلى الجهاز العصبي المركزي11،12،13. في حين أن طرق التسليم التقليدية تنطوي على ضخ اتّصال منخفض الحجم متعدد موزع ة عبر مناطق صغيرة من الدماغ، يمكن أن يحقق CED توزيعًا أوسع وأكثر تكافؤًا للعوامل مع عدد أقل من التسريبات. تدفق السوائل السائبة الناجمة عن الضغط (الحمل الحراري) أثناء التسريب يسمح بنقل الأنسجة المستهدفة على نطاق أوسع وبشكل موحد عند تقديم ناقلات الفيروسية مع CED. في الدراسات الحديثة، أظهرنا الانتراب واللاحقة التعبير الجيني لمساحات كبيرة من المحرك الأولي (M1) والحسية الجسدية (S1) القشرية9 والمهاد14 باستخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة CED.
هنا، نحن الخطوط العريضة لاستخدام CED لتحقيق التعبير البصري الوراثي عبر المناطق القشرية الكبيرة مع عدد قليل فقط من الحقن القشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت جامعة كاليفورنيا، لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية في سان فرانسيسكو، على جميع الإجراءات، وهي متوافقة مع دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تنفيذ الإجراء التالي باستخدام اثنين من الذكور البالغين rhesus macaques من 8 و 7 سنوات من العمر، وزنها 17.5 كجم و 16.5 كجم (القرد G والقرد J)، على التوالي.
ملاحظة: استخدم تقنيات العقيم القياسية لجميع العمليات الجراحية.
1. التصوير الأساسي
- تخدير وتنبيب الحيوان والحفاظ على التخدير العام تحت isoflurane (تركيز تغير بين 0 إلى 5٪ حسب الحاجة، اعتمادا على العلامات الحيوية مثل معدل التنفس ومعدل ضربات القلب). مراقبة درجة حرارة الحيوان، ومعدل ضربات القلب، وتشبع الأكسجين، والاستجابات القلبية، والضغط الجزئي نهاية المد والجزر من ثاني أكسيد الكربون2 طوال الإجراء.
- ضع الحيوان في إطار مجسم متوافق مع MR (راجع جدولالمواد) حيث سيبقى طوال الإجراء. قم بتوصيل الحيوان بآلة isoflurane محمولة متوافقة مع MR ونقلها إلى الماسح الضوئي بالرنين المغناطيسي (3 T).
- الحصول على معيار T1 (زاوية الوجه = 9 درجة، وقت التكرار / صدى = 668.6، حجم المصفوفة = 192 × 192 × 80، سمك شريحة = 1 ملم) و T2 (زاوية الوجه = 130 درجة، تكرار الوقت / صدى الوقت = 52.5، حجم المصفوفة = 256 × 256 × 45، سمك شريحة = 1 ملم) صور MR التشريحية كخط الأساس المرجعية والتخطيط الجراحي.
- استعادة الحيوان من التخدير ونقله إلى منطقة إسكان الحيوانات.
- استخدم الصور التي تم الحصول عليها T1 وT2 لتحديد موضع استئصال الجمجمة. يمكن تحديد موقع استئصال الجمجمة بدقة عن طريق مطابقة المنطقة القشرية ذات الاهتمام من MR مع أطلس الدماغ macaque (Paxinos، هوانغ، Petride، Toga 2الطبعة الثانية). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر هذه الصور الأساسية تقديرا لمواقع التسريب الفيروسي. المناطق القشرية من الاهتمام أظهرت هنا هي M1 و S1.
2. زرع غرفة متوافقة مع MR
- تخدير وتنبيب الحيوان والحفاظ على التخدير العام مع مراقبة التخدير القياسية كما هو الحال في 1.1.
- ضع الحيوان في الإطار المجسم المتوافق مع MR حيث سيبقى في جميع أنحاء زرع الغرفة وتسليم ناقلات الفيروسية. قم بتوصيل الحيوان بآلة isoflurane متوافقة مع MR المحمولة.
- إنشاء شق المترهل حوالي 2 سم من خط الوسط مع طول حوالي 5 سم مع مشرط.
- إزالة الأنسجة الرخوة الكامنة من الجمجمة باستخدام المصاعد (انظر جدولالمواد).
- إنشاء استئصال الجمجمة الدائري (قطر2.5 سم) لتغطية المسارات المخططة مسبقا للحقن باستخدام تريفين (انظر جدولالمواد).
- خفض نقطة توسيط من trephine الماضي حافة trephine. إنشاء المسافة البادئة في مركز استئصال الجمجمة المخطط لها في عمق ما يكفي في الجمجمة لرسو التريبين باستخدام نقطة توسيط قابل للتعديل من التريبين. توخي الحذر لتجنب اختراق تماما من خلال عمق الجمجمة لأن هذا يمكن أن يسبب ضررا للأنسجة العصبية الكامنة.
- غسل المنطقة بشكل دوري مع المالحة حسب الحاجة للحفاظ على رطوبة الأنسجة في جميع أنحاء استئصال الجمجمة.
- مرة واحدة وقد تم إجراء المركز، وانخفاض trephine على الجمجمة وتدوير trephine في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة في حين تطبيق الضغط التنازلي حتى يمكن إزالة غطاء العظام مع ملقط. توخي الحذر لتجنب إتلاف الأنسجة الكامنة مع التريبين.
- خيط خياطة غرامة (حجم 6-0) من خلال دورا في وسط استئصال الجمجمة ورفع دورا عن طريق سحب بلطف خياطة من سطح الدماغ خلق خيمة في وسط استئصال الجمجمة.
- بعد ذلك، ثقب دورا على مقربة من وسط الخيمة باستخدام مقص العين غرامة لتجنب الإضرار الدماغ. ثم قطع دورا من المركز إلى حافة استئصال الجمجمة ومواصلة على طول الحافة مع مقص أوبحلميك غرامة.
- قم بتركيب الغرفة الأسطوانية المتوافقة مع التصويربالرنين المغناطيسي (الشكل 1؛ انظر القسم 4 للاطلاع على تعليمات الإنتاج) إلى الجمجمة أعلى استئصال الجمجمة لتوفير دعم قنية أثناء ضخ CED بحيث محاذاة انحناء شفة الغرفة بشكل جيد مع انحناء الجمجمة.
- تأمين يزرع إلى الجمجمة باستخدام إما مسامير بلاستيكية والاكريليك الأسنان أو عدد قليل من مسامير التيتانيوم.
3. تسليم ناقلات الفيروسية
- بعد وقت قصير من زرع غرفة متوافقة مع MR وإدراج شبكة حقن قنية (الشكل1A-B، الشكل التكميلي1) في الغرفة، وملء الشبكة مع المالحة (0.9٪ NaCl) لتصور مواقع الحقن عن طريق الصور التشريحية MR و ملء تجاويف الغرفة مع الجيلاتين المعقمة الرطبة القابلة للامتصاص للحفاظ على رطوبة الدماغ (الشكل1F).
- تغطية الجلد والاسطوانة مع الستائر المضادة للميكروبات معقمة قطع للحفاظ على عقم الاسطوانات أثناء النقل وضخ MR. ضع كبسولة فيتامين E لوضع علامة على الجزء العلوي من شبكة الحقن لتحديد إيجابي.
- في حين أن الحيوان لا يزال منبّا، فصل أنبوب الرغامى من دائرة التخدير وإعادة إرفاقه إلى آلة isoflurane متوافقة مع MR المحمولة ونقل الحيوان إلى الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي.
- الحصول على صور T1 (زاوية الوجه = 9 درجة، وقت التكرار / صدى = 668.6، حجم المصفوفة = 192 × 192، سمك شريحة = 1 ملم، 80 شرائح) لحساب المسافة من الجزء العلوي من شبكة الحقن والسطح القشري. كبسولة فيتامين E مرئية بوضوح في الصور T1 وينبغي أن تستخدم كعلامة لأعلى شبكة الحقن (الشكل2A). استخدم أداة مسطرة برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي لقياس المسافة بين الجزء العلوي من شبكة الحقن والسطح القشري.
- الحصول على صور T2 (زاوية الوجه = 130 درجة، وقت التكرار / صدى = 52.5، حجم المصفوفة = 256 × 256، سمك شريحة = 1 ملم، 45 شرائح) لتحديد أدلة قنية الأمثل لكل موقع على أساس الموقع المستهدف للتسريب (الشكل2B-C). كما ذكر سابقا، يتم تعبئة شبكة قنية مع المالحة التي هي أفضل مرئية في الصور T2. باستخدام برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي، انتقل من خلال الطائرات الإكليلية والمترهلة للعثور على الموقع المستهدف للتسريب.
- بعد إذابة ناقلات الفيروسية لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة، مزيج ناقلات الفيروسية مع عامل التباين MR gadoteridol (نسبة 250:1؛ 2MM Gd-DTPA، انظر جدولالمواد) عن طريق ماصة أو دوامة خلط.
ملاحظة: تم اختبار التقنية المقدمة لناقلات AAV مع تعبير كامكيا المروج القيادة من C1V1 تنصهر إلى EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP، titer: 2.5 × 1012 جزيئات الفيروس / مل؛ انظر جدول المواد). - تحميل الفيروس مختلطة في أنابيب الضغط العالي 0.2 مل IV (انظر جدول المواد).
- إنشاء حقل معقم خارج الماسح الضوئي MR لإعداد خط التسريب الفيروسي.
- باستخدام أنابيب الضغط العالي IV، قم بتوصيل خط تمديد طويل (حوالي 3-5 أمتار، اعتمادا على موقع مضخة التسريب فيما يتعلق بتتحمل MR) إلى حقنة 3 مل متوافقة مع MR وبرايم مع المالحة.
- ربط الطرف القاصي من خط التمديد الطويل إلى نهاية القريبة من أنابيب 4 0.2 مل محملة بالفيروس وإرفاق قنية مقاومة للارتجاع مع طرف 1 ملم صعدت (الشكل2D؛ انظر القسم 5 لتعليمات إنتاج قنية) إلى نهاية القاصي من هذا التجمع مع موصل القسطرة نمط المشبك (انظر جدولالمواد) (الشكل2E).
- وأخيرا، تعيين الحقنة في مضخة متوافقة مع MR (انظر جدولالمواد). ضع وحدة تحكم المضخة في غرفة التحكم في الماسح ة لأنها غير متوافقة مع MR.
- باستخدام خط الأساس التصوير بالرنين المغناطيسي التشريحي التي تم الحصول عليها من قبل، حدد موقع شبكة حقن القنية وعمق الإدراج اللازم للوصول إلى موقع التسريب المستهدف. وضع علامة على عمق الإدراج على قنية باستخدام شريط معقم.
- بدء التسريب بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة والتحقق بصريا من تدفق السائل في خط التسريب عن طريق مراقبة طرد السائل من طرف قنية.
- إدراج قنية يدويا من خلال شبكة الحقن إلى عمق الهدف مع الحفاظ على تدفق في خط التسريب، وهذا سوف يمنع الأنسجة توغلت من انسداد قنية أثناء الإدراج.
- الحصول على سريع (2 دقيقة) فلاش T1 الصور المرجحة (زاوية الوجه = 30 درجة، تكرار الوقت / صدى = 3.05، حجم المصفوفة = 128 × 128، سمك شريحة = 1 ملم، 64 شرائح) لرصد عبر الإنترنت من ضخ ناقلات الفيروسية.
- بعد غرس ~ 10 درجة مئوية من ناقلات بحيث يتم غرس ما يكفي من الفيروس للكشف في الماسح الضوئي MR، والحصول على صور MR للتحقق من وضع قنية الصحيح كما يتضح من انتشار الفيروس لوحظ. إذا كان عمق قنية إدراج غير صحيح، ضبط العمق وفقا لذلك أو ببطء إزالة قنية وإعادة محاولة الإدراج كما في 3.12.
- رصد التسريب عن طريق توجيه الصور MR على الانترنت (فلاش T1 المرجحة) وزيادة معدل التسريب إلى 5 ميكرولتر / دقيقة من 1 درجة مئوية / دقيقة الخطوات كل بضع دقائق (الشكل3A).
- بعد غرس ما يقرب من 40 درجة مئوية من ناقلات الفيروسية، والبدء في خفض معدل التسريب من قبل 1 درجة مئوية / دقيقة الخطوات ووقف التسريب بعد حقن ~ 50 درجة مئوية وترك قنية في مكان لمدة 10 دقائق.
- إزالة ببطء قنية من الدماغ والانتقال إلى الموقع التالي. كرر الخطوات من 3.9 إلى 3.19 لكل موقع.
- تغطية الاسطوانة مع الستائر المعقمة في نهاية الحقن، قبل نقل الحيوانات. ثم نقل الحيوان مرة أخرى إلى غرفة العمليات.
- إما استبدال الغرفة المتوافقة مع MR وإغلاق الشق الجراحي عن طريق استبدال رفرف العظام والعضلات فوق وخياطة الجلد باستخدام تقنيات العقيم القياسية أو استبدال الغرفة مع اسطوانة التيتانيوم ودورا الاصطناعية (انظر يزدان شاهمراد وآخرون 20169) للتسجيل العصبي والتحفيز.
4. MR- متوافق مع غرفة الإنتاج
- تصنيع شبكة حقن قنية النايلون (الشكل1A-B)عن طريق الآلات وفقا للأبعاد المحددة (الشكلالتكميلي1).
- 3D طباعة اسطوانة متوافقة مع MR من أكريلونيتريل بيوتادين الستايرين (ABS0 البلاستيك (الشكل1C-E)(انظر الملف التكميلي 1-3؛ انظر جدول المواد للطابعة والمواد 3D).
ملاحظة: تصميم واحد يحافظ على شبكة حقن قنية ثابتة داخل اسطوانة متوافقة مع MR (الشكل1C)،في حين يسمح آخر لتناوب الشبكة، وتوسيع منطقة الحقن (الشكل1D-E). - مؤشر ترابط شبكة حقن قنية والاستفادة من تجويف المقابلة للغرفة متوافقة مع MR بحيث تظهر كل من القطع نفس الخيوط.
ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من مؤشرات الترابط بشرط أن يكون كلا المكونين نفس مؤشر الترابط. - إدراج شبكة حقن قنية النايلون عن طريق الشد في حفرة استغلالها من اسطوانة متوافقة مع MR.
5- إنتاج قنية مقاومة للارتجاع13
- قطع أنابيب السيليكا بطول 30 سم مع معرف 0.32 مم و 0.43 مم OD لأنابيب السيليكا الداخلية (انظر جدولالمواد) باستخدام شفرة الحلاقة.
- قطع أنابيب السيليكا بطول 7.5 سم و5 سم طويلة مع معرف 0.45 مم و0.76 مم OD لأنابيب السيليكا الخارجية (انظر جدولالمواد).
- التمسك الأنابيب الخارجية 7.5 سم إلى الأنابيب الداخلية 30 سم مع cyanoacrylate بحيث يمتد الأنبوب الداخلي 1 ملم وراء الأنبوب الخارجي، مما يجعل خطوة مقاومة للارتجاع (الشكل2D). للتأكد من أن cyanoacrylate لا يدخل داخل الأنابيب الداخلية، ضع السيانوكريلات على الجزء الخارجي من الأنابيب الداخلية بعيدا عن طرف قنية.
- قم بلصق أنابيب السيليكا التي يبلغ طولها 5 سم إلى الطرف الآخر من الأنابيب الداخلية للإرفاق بموصل القسطرة على غرار المشبك (انظر الخطوة 3.10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التسليم المعزز للتصوير الحراري (CED) تحت إرشادات التصوير بالرنين المغناطيسي
تم رصد انتشار ناقلات الفيروسية خلال ضخ CED تحت إشراف صور MR على الانترنت (الشكل3A). في هذه الدراسة، تم استهداف S1 و M1 من اثنين من الالقردة (الشكل3B). تم تقدير أحجام التوزيع ثلاثية الأبعاد في تحليل ما بعد مخصص للصور MR (الشكل3C)كما وصفها يزدان شاهمراد وآخرون 20169،مما يؤكد تغطية مساحات واسعة من القشرة. تم إجراء التسريبات M1 للالقرد G دون توجيه MR بسبب ضيق الوقت.
التحقق من صحة التعبير الفيروسي
تم تأكيد التعبير الأوتوبيالي القشري الكبير من خلال التصوير الفلورسنت، والتسجيلات الفسيولوجية الكهربائية، والتحليل النسيجي كما وصفها يزدان شاهمراد وآخرون 20169. رصدنا التعبير البصري عن طريق التصوير السطحي للمراسلالفلورسنت 2،9 وقدرت أكثر من 130 ملم2 من التعبير على طول السطح القشري في M1 و S1 من اثنين من macaques من ثلاثة فقط حقن القشرية9،15. أدى التحفيز الخفيف (488 نانومتر، قوة 20 مليواط في الطرف؛ انظر جدولالمواد) إلى استجابات كهربائية فسيولوجية موثوقة في المناطق التي تعبر عن ذلك مقاسة صفائف الكهروكورتيصور الدقيقة شبه الشفافة8و9 ،16 (الشكل4).
أسفر تحليل الصور MR ما يقدر ب233 مم3 و 433 مم3 من انتشار ناقلات في M1 و S1 من القرد J، على التوالي، و 317 مم3 في S1 من القرد G9. قمنا بإجراء التحليلات النسيجية على المقاطع الإكليلية التسلسلية ولاحظنا التعبير البصري على نطاق واسعحول مواقع التسريب في M1 و S1 (الشكل 5C-I)، مع ما يقدر بـ 70-80٪ من الخلايا التي تعبر عن الأوبسين. التعبير الملاحظ من علم الأنسجة يتماشى مع توزيعالتعبير المقدر من التصوير الفلورسنت (الشكل 5A-D). واحدة من اثنين من التسريبات التي أجريت خارج الماسح الضوئي MR في القرد G لم تنجح، مما أسفر عن أي تعبير في المنطقة المقابلة (الشكل5D). وكان انتشار المقدرة من التصوير بالرنين المغناطيسي تماما ضمن حدود كل من الفلورسنت والقياسات النسيجية للانتشار الفيروسي (الشكل5E-G). ويمكن أن يعزى التوسع في التصوير الفلورسنت وراء تقدير MR إلى انتشار الجسيمات الفيروسية خارج منطقة advection. وعلاوة على ذلك، فإن التقدير النسيجي يتجاوز تقدير اللاإقبال بسبب الافتقار إلى النفاذ البصري إلى ما بعد استئصال الجمجمة. وترد تفاصيل هذه التقنيات فيورقتنا السابقة 9.
الشكل 1: اسطوانة متوافقة مع MR وشبكة حقن قنية. (A،B) مصممة خصيصا شبكة حقن النايلون. (C) MR متوافق مع اسطوانة ثابتة. (D,E) تدوير اسطوانة متوافقة مع MR. (F) MR- متوافق مع اسطوانة ضخ مع موقف الشبكة الثابتة. تشير الأسهم إلى التجاويف التي تم تصميمها لتملأ بالجيلاتين المعقمة الرطبة القابلة للامتصاص معبأ تحافظ على سطح الدماغ رطبة لمدة الحقن. (G) قنية إدراجها في الشبكة. تم تعديل هذا الرقم من يزدان شاهمراد وآخرون 20169. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خط الأساس التصوير بالرنين المغناطيسي وارتجاع مقاومة قنية. (أ) T1 الصورة المرجحة من فيتامين E التي تم إرفاقها إلى الجزء العلوي من شبكة الحقن التي تمكننا من قياس المسافة إلى سطح الدماغ (السهم الأبيض). (B) T2 الصورة المرجحة للدماغ يساعد على تخطيط موقع الحقن من شبكة قنية مليئة المالحة. (C) صورة MR من غرفة التسريب وشبكة قنية المالحة المملوءة. تمثل الخطوط المتعامدة الطائرتين المترهلتين (الصفراء) والإكليلية (الأرجوانية). (D) صورة من الجزر مقاومة حقن قنية طرف مع خطوة مقاومة الجزر (السهم الأسود). (E) خطوط التسريب. تم تعديل هذا الرقم من يزدان شاهمراد وآخرون 20169. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصوير بالرنين المغناطيسي أثناء التسريب والتوزيع المقدر. (أ) انتشار 50 ميكرولتر من النواقل الفيروسية في المقاطع الإكليلية من القرد G لموقع حقن واحد في S1 (يظهر مع سهم في B). (B) التصوير بالرنين المغناطيسي سطح تقديم سطح القشرية تحت الاسطوانة للالقردة G و J، على التوالي. يتم عرض مواقع التسريب S1 باللون الأزرق، مواقع M1 باللون الأحمر. (ج) إعادة بناء حجم MR من انتشار ناقلات الفيروسية بعد ضخ CED. يظهر الدماغ باللون الرمادي الفاتح; يتم عرض أحجام التسريب S1 و M1 باللونين الأزرق والأحمر، على التوالي. لا يتوفر إعادة بناء حجم MR لضخ M1 للالقرد G لأنها لم تتم في الماسح الضوئي MR. تم تعديل هذا الرقم من يزدان شاهمراد وآخرون 20169. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التسجيلات الكهرولوجية للنشاط الذي يثير الضوء. وقد حدثت تسجيلات التصوير الكهربائي الدقيق (μECoG) أثناء التحفيز البصري النبضي. وكانت آثار التسجيل من أقرب قطب كهربائي إلى موقع التحفيز للأمثلة على مواقع التحفيز M1 (الأحمر) وS1 (الأخضر). المناطق المظللة حول آثار تمثل خطأ قياسي عبر 25 التجارب. المربعات الزرقاء على آثار تظهر توقيت التحفيز (1 مللي ثانية). يتم فرض المجموعة الكاملة من الأشكال الموجية التي يتم تشغيلها من قبل التحفيز لكل من أزواج العينات من مواقع التحفيز والتسجيل على الموجي المتوسط كما هو موضح على الجانب الأيسر من اللوحة. تم تعديل هذا الرقم من يزدان شاهمراد وآخرون 20169. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل النسيجي. (أ) خط الأساس صورة MR الإكليلية في القرد G. (B) انتشار عامل التباين بعد التسريب لنفس شريحة MR الإكليلية كما هو الحال في A. (C)قسم الأنسجة الإكليلية من نفس الموقع تقريبا كما هو الحال في A و B؛ بيروكسيداز تلطيخ يعكس التعبير عن EYFP-مراسل. (D) لوحظ محاذاة جيدة بين منطقة التعبير EYFP تقاس مع epiflourescence السطح (المناطق الخضراء الداكنة) ومع تلطيخ النسيجية (الخطوط الخضراء الخفيفة). وتشمل هذه المنطقة من انتشار ناقلات المقدرة من الصور MR (الخط الأبيض)؛ النقاط البيضاء تشير إلى مواقع الحقن، والمنطقة السوداء بأكملها تمثل المنطقة التي تتعرض لاستئصال الجمجمة. يقع معظم مواقع الحقن اليسرى في M1، ويقع معظم المواقع اليمنى في S1. (E) صورة التكبير منخفضة من القسم الإكليلي ملطخة المضادة للGFP تظهر الجانب ميديو الجانبي للتعبير YFP في القشرة الحسية الجسدية للالقرد J (المناطق 1، 2، 3). يشير رأس السهم الأسود إلى موقع مسار القنية. يظهر النسيج المجاور (الإطار الأسود) في F، في تكبير أكبر لإظهار توزيع اللامينار للخلايا الإيجابية YFP. (F) تقع المناطق ذات الكثافة السكانية العالية من الخلايا الإيجابية YFP في الغالب في الطبقات II-III و V-VI، وتظهر أيضا مورفولوجيا هرمية نموذجية (يتم توسيع الخلايا في الإطارات البيضاء في لوحات(G-I). رؤوس الأسهم البيضاء على لوحات أسفل G-I تشير إلى الخلاياالهرمية النموذجية في طبقات II-III (G); طبقةV (H)؛ والطبقة السادسة(I). قضبان مقياس = 2 مم (E)؛ 200 ميكرومتر (F)؛ 100 ميكرومتر (G-I). تم تعديل هذا الرقم من يزدان شاهمراد وآخرون 20169 ويزندان شاهمراد وآخرون 201815. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: شبكة حقن القنية قبل الخيوط. طول وقطر شبكة الحقن هي 15.00 مم و 12.00 مم، على التوالي. يتكون نمط شبكة الحقن من ثقوب قطرها 0.8 مم تشكل ثلاث دوائر متحدة المركز (القطر: 1.6 و3.2 و4.8 مم) حول مركز الشبكة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملفات التكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحدد تقنية مجدية وفعالة لتحقيق التعبير البصري على نطاق واسع في القشرة الحسية الجسدية والحركية الأولية NHP من قبل التصوير بالرنين المغناطيسي الموجه. استخدام الرنين المغناطيسي الموجه MR يقدم مزايا كبيرة على الأساليب التقليدية للتسريب الفيروسي في الدماغ NHP. وتتمثل إحدى هذه المزايا في القدرة على التعبير عن العبرة في مناطق واسعة مع عدد أقل من التسريبات المطلوبة. على سبيل المثال، مع الأساليب التقليدية، حقن متعددة من 1-2 ميكرولتر منالتعبير العائد ناقلات في منطقة قطرها 2-3 ملم 1،2،5،17. في حين أن المحاولات السابقة لتحقيق انتشار ناقلات على نطاق واسع قد أسفرت عن أحجام التعبير من حوالي 10 مم3 مع حقن متعددة18, هنا نقدم طريقة لتحقيق التعبير أكثر من 200 مم3 مع عدد قليل فقط من التسريبات . ضخ واحد من 50 ميكرولتر بواسطة CED يمكن أن يحقق انتشار ناقلات تصل إلى 10 ملم من موقع الحقن لCED9 القشرية والتغطية الكاملة للمناطق القشرية الأمامية مع CED الثاليا14.
وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن استخدام CED يمكن أن يحقق توزيع أكثر تجانسا من وكيل حقن12،19،20،21،22،مما يؤدي إلى مستويات التعبير موحدة حول موقع ضخ ناقلات الفيروسية, بالمقارنة مع الحقن الدقيقة التقليدية. في تجاربنا توظيف CED، لاحظنا مستويات التعبير عالية بشكل موحد مع ما يقرب من 70-80٪ من الخلايا العصبية التي تعبر عن opsin8،9 ( الشكل5). وعلى النقيض من ذلك، تظهر الحقن التقليدية القائمة على الانتشار مناطق عالية التعبير تتركز بالقرب من مواقع الحقن المحاطة بضعف مستويات التعبير4و5و17. إن انخفاض الحاجة إلى حقن متعددة يجعل ضخ CED طريقة فعالة من حيث الوقت للحصول على تعبير وراثي البصريات على نطاق واسع وموحد. بسبب انخفاض عدد الحقن ومعدلات التسريب أسرع, كنا قادرين على تخطيط وضخ ناقلات الفيروسية تحت إشراف التصوير بالرنين المغناطيسي. استخدام الصور MR على الانترنت تمكن الاستهداف الدقيق للتسريبات ورصد انتشار ناقلات الفيروسية أثناء التسريب. ومع ذلك، إذا كان العمق الأولي للقنية المدرجة غير صحيح، وهذا قد تسفر عن التعبير في المواقع غير المرغوب فيها نتيجة للغرس الأولي ~ 10 درجة مئوية اللازمة للكشف بصريا عن طريق MR. بدلا من ذلك، نظم الملاحة الجراحية العصبية التجارية ويمكن أيضا استخدام علامات fiducial بدلا من التوجيه MR. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحايل على تكاليف التصوير عبر الإنترنت عن طريق وضع علامة على العمق المطلوب من الإدراج على قنية قبل الإدراج وتأكيد بصريا ضخ كامل من خلال خط التسريب، على الرغم من أن دقة وضع قنية سيكون تخفيض. ومع ذلك، كما رأينا من خلال الحقن غير ناجحة في M1 من القرد G (الشكل5D)،يمكن توجيه MR أن تكون حاسمة لضمان ضخ ناجحة.
وقد أظهرت الدراسات السابقة سلامة التسريبات CED من كل من الجسيمات غير الفيروسية والفيروسية مععدم وجود تلف الأنسجة الملاحظة خارج المسالك قنية ولا يوجد عجز سلوكي 9،11،12،13 ،14،15،20. هنا وفي منشوراتنا السابقة9,14 نبلغ عن نتائج مماثلة بعد ضخ CED من ناقلات الفيروسية البصرية. بالإضافة إلى عدم وجود عجز سلوكي ملحوظ بعد التسريب، NeuN وNissl9،14،15 تلطيخ كشف موت الخلايا العصبية والورم الدبقي يقتصر فقط على الجهاز القنية ، كما تم الإبلاغ عن مع الأساليب القائمة على الانتشار5. لتقليل الضرر من مسار قنية، يمكننا أن تقلل من قطر قنية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى إجراء مزيد من التحقيقات لتقييم أثر تخفيض حجم القنية على تحقيق مجالات واسعة من التعبير. وعلاوة على ذلك، لأن ارتفاع معدلات التسريب يمكن أن يؤدي أيضا إلى تلف الأنسجة13،فمن المستحسن للحفاظ على معدل التسريب في أو أقل من 5 ميكرولتر / دقيقة. لمزيد من المعلومات التفصيلية حول تقنية CED يرجى الاطلاع على المنشور السابق9.
يمكن أن يؤدي استخدام CED الموجه ة بالرنين المغناطيسي لتحقيق مناطق واسعة من التعبير البصري المستهدف في قشرة الرئيسيات إلى مزيد من التحقيقات في ديناميات الدوائر على نطاق واسع، واللدونة العصبية، واتصال الشبكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS لديها مصلحة مالية في Neuroink كورب، وهي الشركة التي تقوم بتطوير العلاجات السريرية باستخدام تحفيز الدماغ.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه (AY)، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع (DARPA) إعادة التنظيم واللدونة لتسريع الانتعاش الإصابة (REPAIR; N66001-10-C-2010)، R01. NS073940، ومن قبل مركز التصوير في علم الأعصاب UCSF. كما تم دعم هذا العمل من قبل معهد يونيس كينيدي شيفير الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة رقم K12HD073945، ومركز واشنطن الوطني لبحوث الرئيسيات (WaNPCR، P51 OD010425)، و مركز تكنولوجيا الأعصاب (CNT، وهو مركز البحوث الهندسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت منحة EEC-1028725). نشكر كاميلو دياز بوتيا، تيم هانسون، فيكتور خرازيا، دانيال سيلفرسميث، كارين ج. ماكلويد، جوليانا ميلاني، وبليكلي أندروز على مساعدتهم في التجارب ونان تيان، جيوي هي، بيتر ليدوكوبيتش، ميشيل ماهاربيز، وتوني هاون على المساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
