Summary
在这里,我们演示了磁共振 (MR) 引导的对流增强病毒载体到皮层 (CED) 到皮层作为一种有效和简化的方法,以实现光遗传学表达在大型皮质区域在猴脑。
Abstract
在非人类灵长类动物(NHP)光遗传学中,用病毒载体感染大型皮质区域通常是一项困难而耗时的任务。在这里,我们演示了使用磁共振 (MR) 引导对流增强交付 (CED) 光遗传学病毒载体到原发性躯体感觉 (S1) 和运动 (M1) 皮质的猴获得高效, 广泛皮质表达光敏性电子通道。在MR引导的CED下,将编码红移蛋白C1V1的Adeno相关病毒(AAV)载体注射到恒河猴皮层中,将这种蛋白注入黄色荧光蛋白(EYFP)。输液后三个月,显微荧光成像在M1和S1中确认两只猴子有大面积的光遗传学表达(>130 mm 2)。此外,我们还能够使用微电皮学阵列记录来自表达区域的可靠光唤起电生理反应。后来对记者进行组织学分析和免疫染色后发现,M1和S1中广泛而密集的光遗传学表达与表显荧光成像所指示的分布相对应。与传统技术相比,这种技术使我们能够在较短的时间内获得皮层大面积的表达,损害最小,并且可能是大型动物(如NHPs)的光遗传学病毒传播的最佳方法。这种方法显示了在动物模型中具有细胞型特异性的神经回路的网络级操作的巨大潜力。
Introduction
光遗传学是一个强大的工具,允许操作神经活动和研究大脑中的网络连接。在非人类灵长类动物(NHPs)中实施这种技术有可能增强我们对灵长类动物大脑中大规模神经计算、认知和行为的理解。虽然光遗传学近年来在NHP中已经成功实施了1、2、3、4、5、6、7,这是一个挑战,研究人员面对的是这些动物在大脑大区域实现高水平的表达。在这里,我们提供一种高效和简化的方法,以实现高浓度的光遗传学表达在大脑皮层的大片区域在猴。这项技术具有巨大的潜力,可以结合最先进的记录8、9和光学刺激10技术,提高这些动物目前的光遗传学研究。
对流增强传递(CED)是一种既定的方法,将药理剂和其他大分子(包括病毒载体)输送到中枢神经系统11、12、13。传统的输液方法涉及分布在大脑小区域的多个低容量输注,而CED可以以更少的输注实现更广泛、更均匀的代理分配。输注过程中压力驱动的散装流体流动(对流)允许在使用CED传播病毒载体时更广泛地均匀地分布目标组织。在最近的研究中,我们使用磁共振(MR)引导的CED演示了大面积原马达(M1)和躯体感觉(S1)皮质9和丘拉丘14的转导和后续光遗传学表达。
在这里,我们概述了使用CED实现光遗传学表达在大型皮质区域,只需几个皮质注射。
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Protocol
所有程序均经加州大学旧金山机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准,并符合《实验室动物护理和使用指南》。以下手术分别使用两只8岁、7岁的成年雄性河河猴,体重分别为17.5公斤和16.5公斤(猴子G和猴子J)。
注:对所有外科手术使用标准无菌技术。
1. 基线成像
- 在异胶下对动物进行隔离和插管,维持一般麻醉(浓度根据需要变化在0至5%之间,取决于呼吸速率和心率等生命体征)。在整个过程中监测动物的温度、心率、氧饱和度、心电图反应和CO2的末潮部分压力。
- 将动物置于与 MR 兼容的立体框架中(参见材料表),在整个过程中,它将保留在其中。将动物连接到便携式 MR 兼容异形胶机,并将其传送到 MRI 扫描仪 (3 T)。
- 获取标准 T1(翻转角度 = 9°,重复时间/回波时间 = 668.6,矩阵大小 = 192 x 192 x 80,切片厚度 = 1 mm)和 T2(翻转角度 = 130°,重复时间/回波时间 = 52.5,矩阵大小 = 256 x 256 x 45,切片厚度 = 1 mm)解剖 MR 图像作为基线 参考和手术规划。
- 从麻醉中恢复动物,并将其运送到动物居住区。
- 使用采集的 T1 和 T2 图像确定颅骨切除术的位置。颅内切除术的位置可以通过将MR的皮质区域与猴脑图集(帕克西诺斯、黄、彼得里德、托加第2版)进行精确确定。此外,这些基线图像可以提供病毒输注位置的估计。此处演示的感兴趣皮质区域是 M1 和 S1。
2. MR 兼容腔室植入
- 通过标准麻醉监测,对动物进行麻醉和插管,保持常规麻醉,如1.1。
- 将动物置于与 MR 兼容的立体框架中,使其在整个腔室植入和病毒载体输送过程中保持。将动物连接到便携式 MR 兼容异类胶机。
- 用手术刀从中线约2厘米,长约5厘米,创建一个下垂切口。
- 使用电梯从颅骨中取出底层软组织(参见材料表)。
- 创建一个圆形颅骨切除术(直径2.5厘米),以覆盖预先规划的轨迹,用于使用颤音注射(见材料表)。
- 将颤音的中心点降低到颤音的边缘。在颅骨底部足够深的计划颅内切除术的中心创建一个缩进,以便使用可调节的颅骨中心点锚定颅骨。小心避免完全穿透颅骨的深度,因为这可能导致对底层神经组织的损害。
- 根据需要定期用盐水冲洗区域,以保持整个颅骨切除术的组织水分。
- 做心后,将颅骨降至头骨上,顺时针和逆时针旋转三脚架,同时施加向下压力,直到用钳子取出骨帽。小心避免用颤音破坏底层组织。
- 穿过颅内切除术中心的杜拉(大小6-0)的细缝合线,通过轻轻地从大脑表面拉出缝合线,在颅内切除术的中心形成一个帐篷来提升杜拉。
- 接下来,用精细的眼科剪刀刺穿帐篷中心附近的杜拉,以避免损害大脑。然后,将 Dura 从中心切到颅骨切除术的边缘,然后沿边缘使用精细的眼科剪刀继续。
- 将圆柱形定制 CED MR 兼容室(图1;参见第 4 节,了解生产说明)安装到颅骨顶部颅骨,在 CED 输注期间提供管状支撑,使腔室法兰的曲率对齐以及头骨的曲率。
- 使用塑料螺钉和牙科丙烯酸或几个钛螺钉将植入物固定到头骨上。
3. 病毒载体传递
- 植入 MR 兼容腔室并将导管注射网格(图 1A-B,补充图1)插入腔室后不久,向网格中填充盐水(0.9% NaCl),以便通过 MR 解剖图像和用湿无菌吸收明胶填充腔体以保持大脑的水分(图1F)。
- 用无菌抗菌素窗帘覆盖皮肤和气缸,以保持输油罐在输送和 MR 输注过程中的无菌性。放置一个维生素E胶囊,在注射网格的顶部标记,以进行阳性识别。
- 当动物保持插管时,从麻醉回路中分离内切管,并将其重新连接到便携式MR兼容的异氟拉机,然后将动物运送到MRI扫描仪。
- 获取 T1 图像(翻转角度 = 9°,重复时间/回波时间 = 668.6,矩阵大小 = 192 x 192,切片厚度 = 1 mm,80 切片),以计算与喷射网格顶部和皮质表面的距离。维生素E胶囊在T1图像中清晰可见,应作为注射网格顶部的标记(图2A)。使用 MR 成像软件的标尺工具测量喷射网格顶部与皮质表面之间的距离。
- 获取 T2 图像(翻转角度 = 130°,重复时间/回波时间 = 52.5,矩阵大小 = 256 x 256,切片厚度 = 1 mm,45 片),根据输注的目标位点确定每个站点的最佳导管导轨(图 2B-C)。如前所述,管状网格中充满了盐水,在 T2 图像中最明显。使用MR成像软件,滚动通过日冕和下垂平面,找到输液的目标位置。
- 在室温下解冻病毒载体几个小时后,通过移液器或涡旋混合将病毒载体与MR造影剂加多特利多尔(比250:1;2mM Gd-DTPA,见材料表)混合。
注:该技术对AAV载体进行了测试,其C1V1的CamKIIa启动子驱动表达融合到EYFP(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP,点位:2.5 x 1012病毒分子/mL;见材料表)。 - 将混合病毒加载到 0.2 mL 高压 IV 管中(参见材料表)。
- 在 MR 扫描仪外部建立无菌场,用于准备病毒输注管。
- 使用高压 IV 管,将长延长线(约 3-5 米,取决于输注泵相对于 MR 孔的位置)连接到 MR 兼容的 3 mL 注射器和带盐水的质。
- 将长延长线的远端连接到装有病毒的 0.2 mL IV 管的近端,并将抗回流管用 1 mm 阶梯尖(图 2D;参见第 5 节的导管生产说明)连接到此组件带有夹式导管连接器(参见材料表)(图 2E)。
- 最后,将注射器设置在兼容 MR 的泵中(参见材料表)。将泵控制器放在扫描仪控制室中,因为它与 MR 不兼容。
- 使用之前获得的基线解剖 MR 图像,选择到达目标输注部位所需的管状注射网格位置和插入深度。使用无菌胶带标记管上的插入深度。
- 以 1 μL/min 的速率开始输注,并通过观察液体从管尖喷出来目视验证输液管中的流量。
- 将导管手动通过注射网格插入目标深度,同时保持输液管中的流量,因为这将防止渗透的组织在插入过程中堵塞导管。
- 获取快速(2分钟)闪光T1加权图像(翻转角度= 30°,重复时间/回波时间= 3.05,矩阵大小 = 128 x 128,切片厚度 = 1 mm,64片),用于在线监测病毒载体输注。
- 注入载体的 ±10 μL,以便注入足够的病毒以在 MR 扫描仪中检测后,获取 MR 图像以验证正确的管状放置,这明显表现在观察到的病毒传播中。如果插入的导管深度不正确,请相应地调整深度或缓慢地拆下导管,然后重新尝试插入,如 3.12 中。
- 通过在线 MR 图像(闪存 T1 加权)的引导监控输注,并将输注速率提高到 5 μL/min,每隔几分钟增加 1 μL/min 步数(图 3A)。
- 注入大约40μL的病毒载体后,开始将输注速率降低1μL/min步数,并在注射+50μL后停止输注,并将导管留在原位10分钟。
- 慢慢从大脑中取出导管,并移动到下一个位置。对每个位置重复步骤 3.9 到 3.19。
- 在动物运输前,在注射结束时用无菌窗帘盖住气缸。然后把动物运回手术室。
- 要么切除MR兼容室,通过更换骨瓣和上覆肌肉,并使用标准的无菌技术缝合皮肤,或者用钛缸和人造Dura替换腔室,关闭手术切口(参见Yazdan-Shahmorad等人2016年9),用于神经记录和刺激。
4. 兼容MR的腔室生产
- 根据指定的尺寸加工尼龙管状注射网格(图1A-B)(补充图1)。
- 3D 打印 MR 兼容的气缸,用丙烯酰胺苯乙烯(ABS0 塑料 (图 1C-E)(参见补充文件 1⁄3;参见 3D 打印机和材料的材料表)。
注:一种设计在MR兼容的圆柱体内维护一个固定的管状喷射网格(图1C),而另一种设计允许网格旋转,从而扩展喷射区域(图1D-E)。 - 螺纹导管喷射网格,然后敲击 MR 兼容腔室的相应腔,使两个片件呈现相同的螺纹。
注:如果两个组件具有相同的螺纹,则可以使用任何类型的螺纹。 - 将尼龙管扣喷射网格拧入兼容 MR 的气缸的螺纹孔中。
5. 抗回流环管生产13
- 使用剃刀刀片切割 30 厘米长、ID 为 0.32 mm 和 0.43 mm 的内硅管(参见材料表)的硅管。
- 切割一个7.5厘米长和5厘米长的硅管,0.45毫米ID和0.76毫米外硅管的外径(见材料表)。
- 将 7.5 厘米外管粘附到 30 厘米内管中,使用氰丙烯酸酯,使内管延伸到外管外 1 mm,使反流步骤(图2D)。为确保氰化丙烯酸酯不会进入内管内部,将氰丙烯酸酯放在远离管尖的内管外侧。
- 将 5 厘米长的硅胶管粘贴到内管的另一端,以连接到夹式导管接头(参见步骤 3.10)。
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Representative Results
在 MRI 指导下对流增强交付 (CED)
病毒载体的传播在CED输注期间在在线MR图像的指导下监测(图3A)。在这项研究中,两只猴子的S1和M1成为攻击目标(图3B)。雅兹丹-沙赫莫拉德等人于2016年9月9日对MR图像(图3C)进行了事后分析,证实了对大面积皮层的覆盖,估计了三维分布量。由于时间限制,猴子G的M1输注在没有MR指导的情况下进行。
病毒表达的验证
大皮质光遗传学表达通过表显光成像、电生理记录以及Yazdan-Shahmorad等人2016年9日描述的组织学分析得到证实。我们监测了荧光报告器2、9的表面荧光成像的光遗传学表达,并估计M1和S1中两只猴皮表面的表达超过130毫米2, 皮质注射9,15。光刺激(488nm,尖端功率20mW;见材料表)在半透明微电皮质阵列8、9测量的表达区域产生可靠的电生理反应 ,16 (图 4) 。
对MR图像的分析,在猴子J的M1和S1中分别产生了估计233毫米3和433毫米3的载体分布,在猴子G9的S1中,估计有317毫米3。 我们对连续日冕部分进行了组织学分析,并在M1和S1(图5C-I)输注位周围观察了大规模光遗传学表达,估计有70-80%的细胞表达蛋白酶。从组织学观察到的表达与表显光成像的估计表达分布一致(图5A-D)。在猴子G的MR扫描仪外进行的两次输注中,其中一次不成功,在相应的区域中没有产生任何表达(图5D)。从MR成像估计的传播完全在表显荧光和病毒传播组织学测量的范围内(图5E-G)。显光成像的扩展超出MR估计可归因于病毒颗粒扩散到对流区域以外。此外,组织学估计超出了荧光估计的范围,因为颅外缺乏光学访问。这些技术的细节包含在我们之前的论文9中。
图1:MR兼容的气缸和锥形喷射网格。(A,B) 定制设计的尼龙喷射网.(C) MR 兼容固定气缸。(D,E)旋转兼容 MR 的气缸。(F) MR 兼容输液缸,具有固定网格位置。箭头指向设计为充满湿无菌吸收明胶的空腔,在注射期间保持大脑表面湿润。(G) 插入网格中的卡环。这个数字已由亚兹丹-沙赫莫拉德等人修改,2016年9。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:基线 MR 成像和抗反流管。(A) 连接到注射网格顶部的维生素E的T1加权图像,使我们能够测量到大脑表面的距离(白色箭头)。(B) 大脑的T2加权图像有助于规划从充满盐水的管网注射的位置。(C) 输液室和盐水填充的管状网格的 MR 图像。正交线表示下垂(黄色)和冠状(紫色)平面。(D) 反流耐注射管尖与反流抗步骤(黑色箭头)的照片。(E) 输液管。这个数字已由亚兹丹-沙赫莫拉德等人修改,2016年9。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:输液期间的 MR 成像和估计分布。(A) 在猴子G的冠状部分传播50μL的病毒载体,用于S1中的一个注射部位(以箭头在B中显示)。(B) 猴子G和J的圆柱体下方皮质表面的MRI表面渲染。S1 输注位置以蓝色显示,M1 位置以红色显示。(C) Mr 体积重建后病毒载体的传播CED输注。大脑以浅灰色显示;S1 和 M1 输注量分别以蓝色和红色显示。没有 MR 体积重建可用于猴子 G 的 M1 输注,因为它们不在 MR 扫描仪中完成。这个数字已由亚兹丹-沙赫莫拉德等人修改,2016年9。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:光唤起活动的电生理记录。在脉冲光学刺激期间进行微电皮成像 (μECoG) 记录。记录痕迹来自最近的电极到刺激部位,用于 M1(红色)和 S1(绿色)刺激位置的示例。跟踪周围的 Hadhad 区域表示 25 个试验中的标准误差。痕迹上的蓝色方块显示刺激的时间(1 毫秒)。用于刺激点和记录位点的样本对的刺激触发波形的完整集叠加在平均波形上,如面板左侧所示。这个数字已由亚兹丹-沙赫莫拉德等人修改,2016年9。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:组织学分析。(A) 猴子G. (B) 同一MR冠状切片输注后,造影剂的对比剂扩散,与A(C) A. (C) 同一地点的冠状组织截面与A和B大致相同;过氧化物酶染色反映了EYFP-报告员的表情。(D) 在用表面表征(深绿色区域)测量的EYFP表达区域与组织染色(浅绿线)之间观察到良好的对齐。其中包括从 MR 图像(白线)估计的矢量传播区域;白点表示注射部位,整个黑色区域表示颅骨切除术暴露的区域。左两个最左侧的注射点位于 M1 中,而两个右侧大多数站点位于 S1 中。(E) 冠状部分的低倍率图像,染色的抗GFP抗体显示猴子J体感觉皮层(区域1,2,3)中YFP表达的中侧。黑色箭头指示管路轨道的位置;相邻组织(黑框)以F显示,放大倍率更大,以显示YFP阳性细胞的层状分布。(F) YFP阳性细胞的密集区域主要位于II-III层和V-VI层,并表现出典型的金字塔形态(白框中的细胞在面板(G-I)中进一步放大。底部面板上的白色箭头 G-I 指向 II-III 层 (G )中的典型金字塔细胞 ;第五层 (H);和第六层 (I).刻度杆 = 2 毫米 (E); 200 μm (F);100 μm (G-I)。这一数字已由Yazdan-Shahmorad等人2016年9日和亚兹丹-沙赫莫拉德等人201815年修改。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1:螺纹前的导管注入网格。喷射网格的长度和直径分别为 15.00 mm 和 12.00 mm。喷射网格模式由 0.8 mm 直径孔组成,围绕网格中心形成三个同心圆(直径:1.6、3.2 和 4.8 mm)。请点击此处下载此文件。
补充文件。 请点击此处下载这些文件。
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Discussion
本文概述了一种可行、高效的技术,通过MR引导的CED在NHP原发性躯体感觉和运动皮层中实现大规模光遗传学表达。与NHP大脑中传统的病毒输注方法相比,MR引导的CED的使用具有显著的优势。其中一个优势是能够在需要输注的大面积区域获得表达。例如,在常规方法中,在直径为 2-3 mm 的区域1、2、5、17 中多次注入 1-2 μL 的载体屈服表达式。虽然以前实现大规模向量传播的尝试已经产生了大约10毫米3的表达量与多次注射18,在这里我们提出一种方法,实现表达超过200毫米3,只有几次输注. 通过CED进行50μL的单次输注,即可实现从输注部位扩散至10mm的载体,用于皮质CED9,并完全覆盖前皮质区域,并带有大核CED14。
此外,已经表明,使用CED可以实现注射剂12,19,20,21,22的更均匀分布,导致均匀的表达水平与传统的显微注射相比,病毒载体输注的部位周围。在使用CED的实验中,我们观察到均匀的高表达水平,大约70-80%的神经元表达蛋白8,9(图5)。相比之下,传统的扩散性注射表现出高表达区域集中在注射部位附近,被弱化的表达水平4、5、17包围。多次注射需求的减少使CED输注成为获得大规模、均匀的光遗传学表达的一种高效方法。由于注射次数少,输注率较快,我们能够在MRI的指导下规划和注入病毒载体。使用在线 MR 图像可以精确定位输液,并监测输注过程中病毒载体的传播情况。但是,如果插入的管状的初始深度不正确,则由于通过 MR 目视检测输液所需的初始注入 +10 μL,这可能会在不需要的位置产生表达。使用基准标记也可以代替MR指导。此外,在线成像的成本可以通过在插入前标记在管上的位置标记所需的插入深度,并通过输注管进行视觉确认完成输注,尽管管状放置的准确性为减少。然而,从猴子G的M1注射不成功(图5D)可以看出,MR指导对于确保成功输注至关重要。
先前的研究表明,非病毒和病毒颗粒的CED输注的安全性,在管外没有观察到组织损伤,并且没有行为缺陷9,11,12,13 ,14,15,20.在这里,并在我们以前的出版物9,14我们报告类似的结果后,CED注入光遗传学病毒载体。除了输注后没有观察到的行为缺陷外,NeuN和Nissl9,14,15染色显示神经元细胞死亡和胶质症仅限于导管,正如已经报道的以扩散为基础的方法5。为了尽量减少管路造成的损坏,我们有可能减小管路直径。然而,需要进一步调查,以评估减少锥号尺寸对实现大面积表达的影响。此外,由于高输注率也可能导致组织损伤13,建议将输注速率保持在5μL/min或以下。有关 CED 技术的详细信息,请参阅我们以前的出版物9。
使用MR引导的CED在灵长类皮层中实现靶向光遗传学表达的广泛区域,可以导致对大规模电路动力学、神经可塑性和网络连接性的进一步研究。
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Disclosures
PNS对Neuralink公司有财务利益,该公司正在开发使用大脑刺激的临床疗法。
Acknowledgments
这项工作得到了美国心脏协会博士后奖学金(AY)、国防高级研究计划局(DARPA)重组和可塑性的支持,以加速损伤康复(REPAIR;N66001-10-C-2010),R01。NS073940,由UCSF神经科学成像中心。这项工作还得到了国家卫生研究院尤尼斯·肯尼迪·希弗国家儿童健康与人类发展研究所、华盛顿国家灵长类研究中心(WaNPCR,P51 OD010425)以及神经技术中心(CNT,国家科学基础工程研究中心,由格兰特EEC-1028725)。我们感谢卡米洛·迪亚兹-博蒂亚、蒂姆·汉森、维克托·哈拉齐亚、丹尼尔·西尔弗史密斯、卡伦·麦克劳德、朱莉安娜·米兰尼和布莱克利·安德鲁斯在实验中的帮助,以及南天、何继伟、彼得·莱多克霍维奇、米歇尔·马哈比兹和托尼·豪恩的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
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