Summary
여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.
Abstract
비 인간 영장류 (NHP) 광유전학에서, 바이러스 성 벡터로 큰 피질 영역을 감염하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 체감각 (S1) 및 모터 (M1) 원숭이의 피질 피질 로 광유전학 적 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도 대류 강화 전달 (CED)의 사용을 입증하여 효율적이고 광범위한 피질 발현을 얻습니다. 빛에 민감한 이온 채널. 황색 형광 단백질(EYFP)에 융합된 적색 이동 opsin C1V1을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 MR-유도 CED 하에서 코막강 마카크의 피질내로 주입되었다. 3개월 후 주입 후, 에피인광 이미징은 2개의 원숭이에서 M1 및S1에서 광유전학적 발현(>130 mm2)의 큰 영역을 확인하였다. 또한, 마이크로 전기 코르티코그래피 어레이를 사용하여 표현 영역에서 신뢰할 수 있는 빛을 불러일으킨 전기 생리학적 반응을 기록할 수 있었습니다. 나중에 리포터에 대한 조직학적 분석 및 면역 염색은 후피광성 이미징에 의해 지시된 분포에 대응하는 M1 및 S1에서 광범위하고 조밀한 광유전학적 발현을 밝혀냈다. 이 기술은 우리가 전통적인 기술에 비해 최소한의 손상으로 시간의 짧은 기간 내에 피질의 넓은 영역에 걸쳐 발현을 얻을 수 있게 하고 NHPs와 같은 큰 동물에 있는 광유전학 바이러스성 납품을 위한 최적 접근일 수 있습니다. 이 접근법은 인간과 진화적으로 가까운 동물 모델에서 세포 유형 특이성을 가진 신경 회로의 네트워크 수준 조작에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
광유전학은 신경 활동의 조작과 뇌의 네트워크 연결 연구를 허용하는 강력한 도구입니다. 비 인간 영장류에서이 기술을 구현 (NHPs) 대규모 신경 계산의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다, 인식, 그리고 영장류 두뇌에 행동. 광유전학이 최근 몇 년 동안 NHP에서성공적으로 구현되었지만 1, 2,3,4,5,6,7, 연구원 얼굴은 이 동물에 있는 큰 두뇌 지역에 걸쳐 표현의 상부를 달성하고 있습니다. 여기에서, 우리는 원숭이에 있는 피질의 넓은 지역에 걸쳐 광유전학 표현의 상부를 달성하기 위하여 능률적이고 간단한 접근을 제공하고 있습니다. 이 기술은 최첨단 기록8,9 및 광학 자극10 기술과 함께 이러한 동물의 현재 광유전학 연구를 향상시킬 수있는 큰 잠재력을 가지고있다.
대류 강화 전달(CED)은 바이러스 벡터를 포함하는 약리작용제 및 기타 큰 분자를 중추신경계(11,12,13)로전달하는 확립된 방법이다. 기존의 전달 방법은 뇌의 작은 영역에 분산 된 여러 낮은 볼륨 주입을 포함하는 반면, CED는 적은 주입으로 더 광범위하고 균일 한 에이전트 분포를 달성 할 수 있습니다. 주입 중 압력 구동 벌크 유체 흐름 (대류)은 CED를 가진 바이러스 성 벡터를 전달할 때 표적 조직의 보다 광범위하고 균일하게 분포된 전달을 허용합니다. 최근 연구에서, 우리는 자기 공명 (MR) 유도 CED를 사용하여 1 차 모터 (M1) 및 체감각 (S1) 코르티즘9 및 시상14의 넓은 영역의 형질 전환 및 후속 광유전학 적 발현을 입증했다.
여기에서, 우리는 단지 몇몇 피질 주사를 가진 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적인 표현을 달성하기 위하여 CED의 사용을 설명합니다.
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Protocol
모든 절차는 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 다음 의 절차는 각각 17.5 kg 및 16.5 kg (원숭이 G 및 원숭이 J)의 무게, 8 및 7 세의 성인 남성 rhesus 원숭이 2 개를 사용하여 수행되었다.
참고: 모든 수술에 표준 무균 기술을 사용하십시오.
1. 기준선 이미징
- 동물을 진정시키고 삽관하고 이소플루란 하에서 전신 마취를 유지하십시오 (호흡률 및 심박수와 같은 활력 징후에 따라 필요에 따라 농도가 0에서 5 % 사이로 변경됩니다). 절차 전반에 걸쳐 동물의 온도, 심박수, 산소 포화도, 심전도 반응 및 CO2의 말조 부분 압력을 모니터링합니다.
- 동물을 MR 호환 입체 프레임(재료 표참조)에 놓고 이 프레임은 절차 전체에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 isoflurane 기계에 연결하고 MRI 스캐너 (3 T)로 운반하십시오.
- 표준 T1(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192 x 80, 슬라이스 두께 = 1mm) 및 T2(플립 각도 = 1mm), 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256 x 45, 슬라이스 두께 = 1mm) 해부학 MR 이미지 참조 및 수술 계획에 대한.
- 마취에서 동물을 복구하고 동물 수용 지역으로 수송.
- 획득한 T1 및 T2 이미지를 사용하여 개두량의 배치를 결정합니다. 개두술의 위치는 마카크 뇌 아틀라스 (Paxinos, 황, 페트리드, 토가 2nd Edition)와 MR의 관심있는 피질 영역을 일치시킴으로써 정확하게 결정될 수 있습니다. 또한, 이들 기준선은 바이러스 주입의 위치에 대한 추정치를 제공할 수 있다. 여기서 입증된 피질 영역은 M1 및 S1입니다.
2. MR 호환 챔버 이식
- 동물을 진정시키고 삽관하고 1.1에서와 같이 표준 마취 모니터링으로 전신 마취를 유지하십시오.
- 동물을 MR 호환 입체 프레임에 놓고 챔버 이식 및 바이러스 벡터 전달 전반에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 연결합니다.
- 메스로 약 5cm의 길이로 중간선에서 약 2cm 의 시상 절개를 만듭니다.
- 엘리베이터를 사용하여 두개골에서 기본 연조직을 제거합니다(재료 표참조).
- 트레핀을 사용하여 주사를 위해 미리 계획된 궤적을 덮기 위해 원형 개두술(직경 2.5cm)을 만듭니다(재료 표참조).
- 트레핀의 가장자리를 지나 트레핀의 중심점을 낮춥습니다. 계획된 두개골 절제술의 중심에 트레핀의 조정 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정시키기에 충분히 깊은 두개골의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 이 기본 신경 조직에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 완전히 두개골의 깊이 통해 침투 하지 않도록 주의 운동.
- 개두술 전반에 걸쳐 조직 수분을 유지하기 위해 필요에 따라 주기적으로 식염수로 영역을 세척하십시오.
- 중심이 만들어지면, 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 방향으로 반시계 방향으로 돌리면서 뼈 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하향 압력을 가합니다. 트레핀으로 기본 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 개두술의 중심에있는 경막을 통해 미세 봉합사 (크기 6-0)를 스레드하고 개두량의 중심에 텐트를 만드는 뇌의 표면에서 봉합사를 부드럽게 당겨 dura를 들어 올립니다.
- 다음으로, 뇌손상을 피하기 위해 미세한 안과 가위를 사용하여 텐트 중앙에 가까운 경막을 뚫습니다. 그런 다음 개두술의 가장자리중앙에서 경막경을 잘라 내고 미세한 옵티마이드 가위로 가장자리를 따라 계속합니다.
- 원통형 맞춤형 CED MR 호환 챔버(도1참조, 생산 지침 섹션 4 참조)를 두개골 상단에 두개골 위에 장착하여 CED 주입 시 캐뉼라 지지대를 제공하여 챔버 플랜지의 곡률이 정렬되도록 합니다. 두개골의 곡률과 잘.
- 플라스틱 나사와 치과 용 아크릴 또는 몇 개의 티타늄 나사를 사용하여 임플란트를 두개골에 고정하십시오.
3. 바이러스 벡터 전달
- MR 호환 챔버를 이식하고 캐뉼라 주사 그리드(그림1A-B, 보조 도1)를 챔버에 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주사 위치를 시각화하기 위한 식염수(0.9% NaCl)로 그리드를 채우고 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수 성 젤라틴으로 챔버 캐비티를 채웁니다 (그림1F).
- 운반 및 MR 주입 중에 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이크로 피부와 실린더를 덮습니다. 양성 식별을 위해 사출 그리드의 상단을 표시하기 위해 비타민 E 캡슐을 놓습니다.
- 동물이 삽관된 채로 남아 있는 동안, 마취 회로에서 endotracheal 관을 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 붙이고 MRI 스캐너에 동물을 수송합니다.
- T1 이미지(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192, 슬라이스 두께 = 1mm, 80슬라이스)를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단으로부터의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의상단에 대한 마커로 사용되어야합니다 (그림 2A). MR 이미징 소프트웨어의 눈금자 도구를 사용하여 사출 그리드의 상단과 피질 표면 사이의 거리를 측정합니다.
- T2 이미지(플립 각도 = 130°, 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256, 슬라이스 두께 = 1mm, 45슬라이스)를 획득하여 대상 주입 부위를 기준으로 각 사이트에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다(그림2B-C). 앞에서 언급했듯이 캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 보이는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 시상 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다.
- 실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 바이러스 벡터를 MR 조영제 가도테리돌(250:1; 2mM Gd-DTPA 의 비율, 재료표참조)과 파이펫 또는 와류 혼합에 의해 혼합한다.
참고: 제시된 기술은 EYFP에 융합된 C1V1의 캄키아 프로모터 구동 발현을 이용한 AAV 벡터에 대해 시험하였다(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, 역가: 2.5 x 1012 바이러스 분자/mL; 물질표참조). - 혼합 바이러스를 0.2 mL 고압 IV 튜브에 로드합니다(재료 표참조).
- 바이러스 주입 라인을 준비하기 위한 MR 스캐너 외부에 멸균 장을 설치합니다.
- 고압 IV 튜브를 사용하여 MR 호환 3 mL 주사기와 식염수프라임에 긴 연장 라인 (MR 보어에 대한 주입 펌프의 위치에 따라 약 3-5 미터)을 연결합니다.
- 바이러스가 로드된 0.2 mL IV 튜브의 근측 끝에 긴 연장 선의 말단을 연결하고 역류 방지 캐뉼라를 1 mm 스프팁(그림2D;캐뉼라 생산 지침의 섹션 5 참조)의 말단끝에 부착합니다. 클램프 스타일 카테터 커넥터가 있는 이 어셈블리(재료 표참조) (그림2E).
- 마지막으로, MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다(재료 표참조). 펌프 컨트롤러는 MR과 호환되지 않기 때문에 스캐너 제어실에 놓습니다.
- 이전에 얻은 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 주입 그리드 위치와 삽입 깊이를 선택합니다. 멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라에 삽입 깊이를 표시합니다.
- 1 μL / min의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증하십시오.
- 주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 주입 그리드를 삽입하면 침투 된 조직이 삽입 중에 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.
- 바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을 위해 빠른 (2 분) 플래시 T1 가중치 이미지 (플립 각도 = 30 °, 반복 시간 / 에코 시간 = 3.05, 매트릭스 크기 = 128 x 128, 슬라이스 두께 = 1mm, 64 슬라이스)를 획득하십시오.
- MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되도록 벡터의 ~10 μL을 주입한 후, MR 영상을 얻어 바이러스의 관찰된 확산에 의해 명백한 바와 같이 올바른 캐뉼라 배치를 확인한다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 그에 따라 깊이를 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 3.12에서와 같이 삽입을 다시 시도하십시오.
- 온라인 MR 이미지의 안내를 통해 주입을 모니터링하고 (플래시 T1 가중) 주입 속도를 증가 5 μL /분 1 μL / 분 단계마다 몇 분 (그림 3A).
- 바이러스 벡터의 약 40 μL을 주입 한 후 주입 속도를 1 μL / min 단계로 줄이기 시작하고 ~ 50 μL주입 후 주입을 중지하고 캐뉼라를 10 분 동안 제자리에 둡니다.
- 천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 각 위치에 대해 3.9~3.19단계를 반복합니다.
- 동물 수송 전에 주사 끝에 멸균 드레이프로 실린더를 덮습니다. 그런 다음 동물을 수술실로 다시 옮김시고.
- MR 호환 챔버를 이식하고 뼈 플랩과 겹쳐진 근육을 교체하고 표준 무균 기술을 사용하여 피부를 봉합하거나 챔버를 티타늄 실린더 및 인공 경루로 교체하여 수술 절개를 닫습니다(참조) 야즈단-샤모라드 외. 20169)신경 녹음 및 자극.
4. MR 호환 챔버 생산
- 나일론 캐뉼라 사출 그리드 (그림1A-B)를지정된 치수에 따라 가공하여 제작합니다 (보충그림1).
- 아크릴로니트리리리티엔 스티렌(ABS0 플라스틱(그림1C-E)에서MR 호환 실린더를 3D 인쇄합니다(추가 파일 1-3참조, 3D 프린터 및 재료용 재료 표 참조).
참고: 하나의 설계는 MR 호환 실린더(그림1C)내에서 고정 캐뉼라 사출 그리드를 유지하며, 다른 설계는 그리드의 회전을 허용하고 사출 영역을 확장합니다(그림1D-E). - 캐뉼라 사출 그리드를 스레드하고 두 조각이 동일한 스레딩을 나타내지 있도록 MR 호환 챔버의 해당 캐비티를 탭합니다.
참고: 두 구성 요소에 동일한 스레딩이 있는 경우 모든 유형의 스레딩을 사용할 수 있습니다. - MR 호환 실린더의 탭된 구멍에 나사로 조여 나일론 캐뉼라 사출 그리드를 삽입합니다.
5. 역류 내성 캐뉼라 생산13
- 면도날을 사용하여 내부 실리카 튜브(재료 표참조)에 대해 0.32 mm ID와 0.43 mm OD로 30cm 길이의 실리카 튜브를 자른다.
- 7.5 cm 길이와 0.45 mm ID와 0.76 mm OD로 5cm 길이의 실리카 튜브를 자르면 외부 실리카 튜브가 있습니다(재료 표참조).
- 7.5 cm 외부 튜브를 시아노아크릴레이트로 30cm 내부 튜브에 부착하여 내부 튜브가 외부 튜브를 넘어 1mm 연장되도록하여 역류 방지 단계를 만듭니다(그림 2D). 시아노아크릴레이트내부튜브의 내부로 들어가지 않도록 하기 위해, 캐뉼라 팁에서 멀리 떨어진 내부 튜브의 바깥쪽에 시아노아크릴레이를 놓습니다.
- 클램프 스타일 카테터 커넥터에 부착하기 위해 내부 튜브의 다른 쪽 끝에 5cm 길이의 실리카 튜브를 붙여 넣습니다(단계 3.10 참조).
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Representative Results
MRI 지침에 따라 대류 향상된 전달 (CED)
바이러스 벡터의 확산은 온라인 MR 이미지의 지도하에 CED 주입동안 모니터링되었다(도 3A). 본 연구에서는, 두 마리의 원숭이의 S1및 M1을 표적으로 하였다(도 3B). 3차원 분포량은 Yazdan-Shahmorad 등 에서 설명한 바와 같이 MR 이미지(그림3C)의사후 분석에서 추정되었으며, 2016년 9월 9일, 피질의 넓은 영역의 커버리지를 확인하였다. 원숭이 G에 대한 M1 주입은 시간 제약으로 인해 MR 안내없이 수행되었습니다.
바이러스 발현의 유효성 검사
큰 피질 광유전학적 발현은 2016년9월야즈단-샤모라드 등에서 설명한 바와 같이 에피소닉 이미징, 전기생리학적 기록 및 조직학적 분석에 의해 확인되었다. 형광 리포터2,9의 표면 후형 이미징에 의한 광유전학적 발현을 모니터링하고, M1과 S1의 피질 표면을 따라 130 mm2 이상의 발현을 단 3개에서 단 3개만으로 추정했습니다. 피질 주사9,15. 빛 자극 (팁488 nm, 20 mW 전력; 재료 표참조) 반투명 마이크로 전극 체질 배열 8,9에 의해 측정 된 표현 영역에서 신뢰할 수있는 전기 생리학적 반응을 산출했습니다. ,16 (그림 4).
MR 이미지의 분석은 원숭이 J의 M1 및 S1에서 벡터 스프레드의 추정 233 mm3 및 433 mm3을 각각 산출하고, 원숭이 G9의 S1에서 317 mm3를 산출하였다. 우리는 직렬 관상 동맥 단면도에 조직학 분석을 수행하고 Opsin를 발현하는 세포의 추정된 70-80%와 M1와 S1 (그림 5C-I)에 있는 주입 사이트 의 주위에 대규모 광유전학 적인 표현을 관찰했습니다. 역학에서 관찰된 발현은 상형 영상으로부터의 추정발현 분포와 일치하였다(도 5A-D). 원숭이 G에서 MR 스캐너 외부에서 수행된 두 가지 주입 중 하나는 실패하여 해당영역에서 발현되지 않았습니다(도 5D). MR 화상 진찰에서 추정된 퍼짐은 바이러스 성 퍼짐의 epifluorescent 및조직학 측정 둘 다의 경계 안에 완전히 있었습니다 (그림 5E-G). MR 추정치를 넘어 후피광 이미징의 확장은 대류 영역을 넘어 바이러스 입자의 확산에 기인 할 수있다. 더욱이, 조직학적 추정은 개두술을 넘어 광학 접근의 부족 때문에 epifluorescccence 추정을 넘어 확장했습니다. 이러한 기술의 세부 사항은 이전 백서9에포함되어 있습니다.
그림 1: MR 호환 실린더 및 캐뉼라 사출그리드. (A,B) 사용자 정의 설계 나일론 주입 그리드. (C) MR 대응 고정 실린더. (D,E) 회전 MR 호환 실린더. (F) 고정 그리드 위치와 MR 호환 주입 실린더. 화살표는 주입 기간 동안 뇌의 표면을 촉촉하게 유지하는 습한 멸균 흡수 젤라틴으로 채워지도록 설계된 구멍을 가리킵니다. (G) 캐뉼라가 격자에 삽입됩니다. 이 수치는 야즈단 샤모라드 등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기준선 MR 화상 진찰 및 역류 저항하는 캐뉼라. (a) 주사 그리드의 상부에 부착된 비타민 E의 T1 가중치 이미지는 뇌의 표면까지의 거리를 측정할 수 있게 한다(흰색 화살표). (B) 뇌의 T2 가중 이미지는 식염수로 채워진 캐뉼라 그리드에서 주사의 위치를 계획하는 데 도움이됩니다. (C) 주입 챔버와 식염수 충전 캐뉼라 그리드의 MR 이미지. 직교 선은 시상 (노란색) 및 관상 (보라색) 평면을 나타냅니다. (D) 환류 내성 주사 캐뉼라 팁의 환류 내성 단계(검정 화살표)의 사진. (E) 주입 라인. 이 수치는 야즈단 샤모라드 등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 주입 및 추정 분포 도중 MR 화상 진찰. (a) S1에서 1개의 주사 부위에 대해 원숭이 G의 관상 섹션내 의 바이러스 벡터의 50 μL의 확산(B에서 화살표로 나타낸). (B) 원숭이 G와 J에 대한 실린더 아래의 피질 표면의 MRI 표면 렌더링. S1 주입 위치는 파란색, M1 위치는 빨간색으로 표시됩니다. (C) CED 주입 후 바이러스 벡터의 확산의 MR 볼륨 재구성. 뇌는 밝은 회색으로 표시됩니다. S1 및 M1 주입 량은 각각 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 그들은 MR 스캐너에서 수행되지 않았기 때문에 어떤 MR 볼륨 재구성은 원숭이 G에 대한 M1 주입을 사용할 수 없습니다. 이 수치는 야즈단 샤모라드 등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 빛 을 불러 일으킨 활동의 전기 생리학적 기록. 마이크로 전기 코르티코그래피(μECoG) 기록은 펄스 광학 자극 중에 발생했습니다. 기록 트레이스는 M1(적색) 및 S1(녹색) 자극 위치의 예에 대한 자극 부위에 가장 가까운 전극으로부터 있었다. 트레이스 주변의 그늘진 영역은 25개의 시험에서 표준 오차를 나타냅니다. 추적의 파란색 사각형은 자극 의 타이밍을 보여줍니다 (1 ms). 자극 및 기록 사이트의 샘플 쌍모두에 대한 자극 트리거 파형의 전체 세트는 패널의 왼쪽에 표시된 대로 평균 파형에 중첩된다. 이 수치는 야즈단 샤모라드 등에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 조직학적 분석. (a) 원숭이 G. (B) A에서와 동일한 MR 관상 슬라이스에 대한 주입 후 조영제의 확산은 A. (C) A 및 B에서와 거의 동일한 부위에서 관상 조직 섹션; 과산화아제 염색은 EYFP-리포터의 표현을 반영한다. (D) EYFP 발현 영역과 표면 진피(진한 녹색 영역)와 조직학적 염색(연한 녹색 선) 사이에 양호한 정렬이 관찰됩니다. 이들은 MR 심상으로부터 추정된 벡터 확산의 영역(흰색 선);; 흰색 점은 주사 부위를 나타내며 전체 검은 색 영역은 개두술에 의해 노출 된 영역을 나타냅니다. 두 개의 왼쪽 된 대부분의 사출 사이트는 M1에 위치 하 고 두 개의 오른쪽 대부분의 사이트는 S1에 있습니다. (e) 원숭이 J의 체감각 피질에서 YFP 발현의 메디오 측각을 나타내는 항 GFP 항체로 염색된 관상동맥 절단의 저배율 이미지(영역 1, 2, 3). 검은 색 화살촉은 캐뉼라 트랙의 위치를 나타냅니다. 인접한 조직(black frame)은 F에도시되어, YFP 양성 세포의 층상 분포를 나타내기 위해 더 큰 배율로 나타났다. (f) YFP 양성 세포의 조밀하게 채워진 영역은 계층 II-III 및 V-VI에 주로 위치하며, 또한 전형적인 피라미드 형태 (백색 프레임의 세포는 패널(G-I)에서더욱 확대된다. 하단 패널에 흰색 화살촉 G-I 층 II-III (G)에서 전형적인 피라미드 세포를 가리킵니다; 층 V(H); 및 레이어VI (I). 축척 막대 = 2mm(E); 200 μm (F); 100 μm (G-I). 이 수치는 야즈단 샤모라드 외 20169 및 야즈단 샤모라드 외 201815에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 1: 스레딩 전에 캐뉼라 주입 그리드. 사출 그리드의 길이와 직경은 각각 15.00 mm및 12.00 mm입니다. 사출 그리드 패턴은 그리드 중심 을 중심으로 3개의 동심원(직경: 1.6, 3.2 및 4.8mm)을 형성하는 0.8mm 직경 의 구멍으로 구성됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서, 우리는 MR 유도된 CED에 의하여 NHP 1 차 체감각 및 모터 피질에 있는 대규모 광유전학 표현을 달성하기위한 실행 가능하고 능률적인 기술을 개략적으로 설명합니다. MR 유도 CED의 사용은 NHP 두뇌에 있는 바이러스성 주입의 전통적인 방법에 비해 중요한 이점을 제시합니다. 이러한 장점 중 하나는 필요한 주입이 적은 넓은 영역에 대한 발현을 달성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 종래의 방법으로, 2-3 mm 직경 영역 1,2,5,17에서벡터 항복 발현의 1-2 μL의 다중 주사. 대규모 벡터 확산을 달성하기위한 이전의 시도는 여러 주사18로약 10mm3의 발현 량을 산출했지만, 여기에서우리는 몇 가지 주입만으로 200 mm3 이상의 발현을 달성하는 방법을 제시합니다. . CED에 의하여 50 μL의 단 하나 주입은 thalamic CED14를가진 전두엽 피질 지역의 피질 CED9 및 전체 엄호를 위한 주사 사이트에서 10 mm까지 벡터 퍼짐을 달성할 수 있습니다.
더욱이, CED를 사용하여 주입된 제12,19,20,21,22의더 균일한 분포를 달성할 수 있고, 균일한 발현 수준으로 이끌어 내는 것을 보여주었다 기존의 미세 주사에 비해 바이러스 벡터 주입 부위 주위에. CED를 채택한 우리의 실험에서, 우리는 opsin8,9 (그림5)를발현하는 뉴런의 약 70-80%를 가진 균일하게 높은 발현 수준을 관찰했다. 대조적으로, 종래의 확산계 주사는 발현 수준4,5,17에의해 둘러싸인 사출 부위 근처에 집중된 높은 발현 영역을 나타낸다. 다중 주사에 대한 감소된 필요성은 CED 주입을 대규모의 균일한 광유전학적 발현을 얻는 시간 효율적인 방법을 렌더링합니다. 주사의 작은 수와 빠른 주입 속도로 인해, 우리는 MRI의 지도하에 바이러스 벡터를 계획하고 주입 할 수있었습니다. 온라인 MR 이미지의 사용은 주입의 정확한 타겟팅과 주입 중 바이러스 벡터의 확산을 모니터링 할 수 있습니다. 그러나 삽입된 캐뉼라의 초기 깊이가 올바르지 않은 경우, MR을 통해 주입을 시각적으로 검출하는 데 필요한 초기 주입 ~10 μL의 결과로 서 바람직하지 않은 위치에서 발현을 얻을 수 있습니다. MR 안내 대신 신탁 마커를 활용할 수도 있습니다. 추가적으로, 온라인 화상 진찰의 비용은 주입 선을 통해 서 완전한 주입을 시각적으로 확인하기 전에 캐뉼라에 삽입의 원하는 깊이를 표시하고 관혼 선의 정확도가 있을 지라도 우회될 수 있습니다 감소. 그러나, 원숭이 G(도5D)의M1에서 실패한 주사에 의해 볼 수 있듯이, MR 지침은 성공적인 주입을 보장하기 위해 중요할 수 있다.
이전 연구는 캐뉼라 관 외의 관찰 된 조직 손상이없고 행동 적자가없는 비 바이러스 및 바이러스입자 모두의 CED 주입의 안전성 입증 9,11,12,13 ,14,15,20. 여기에서 우리의 이전 간행물9,14우리는 광유전학 바이러스성 벡터의 CED 주입 다음 유사한 결과를 보고합니다. 주입 다음 관찰 된 행동 적자 이외에, NeuN 및Nissl 9,14,15 염색 밝혀 신경 세포 죽음과 gliosis는 캐뉼라 관에만 제한 되었다, 보고 된 바와 같이 확산 기반 방법5. 캐뉼라 트랙의 손상을 최소화하기 위해 캐뉼라의 직경을 잠재적으로 줄일 수 있습니다. 그러나, 추가 조사는 표현의 넓은 지역을 달성에 캐뉼라 크기 감소의 효력을 평가하기 위하여 필요합니다. 또한, 높은 주입 속도 또한 조직 손상으로 이어질 수 있기 때문에13,5 μL/min 이하의 주입 속도를 유지하는 것이 좋습니다. CED 기술에 대한 자세한 내용은 이전 간행물9를참조하십시오.
영장류 피질에서 표적 광유전학 적 발현의 넓은 영역을 달성하기위한 MR 유도 CED의 사용은 대규모 회로 역학, 신경 가소성 및 네트워크 연결의 추가 조사로 이어질 수 있습니다.
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Disclosures
PNS는 뇌 자극을 이용한 임상 치료를 개발하는 회사인 Neuralink Corp.에 재정적 관심을 가지고 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다 (AY), 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 구조 조정 및 가소성 부상 복구를 가속화하기 위해 (수리; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, UCSF 신경 과학 이미징 센터에 의해. 이 작품은 또한 수상 번호 K12HD073945, 워싱턴 국립 영장류 연구 센터 (WaNPCR, P51 OD010425)에 따라 국립 보건원의 유니스 케네디 시버 국립 연구소및 인간 개발에 의해 지원되었다 신경 기술 센터 (CNT, 그랜트 EEC-1028725에서 국립 과학 재단 공학 연구 센터). 카밀로 디아즈 보티아, 팀 핸슨, 빅토르 카라지아, 다니엘 실버스미스, 카렌 J. 맥클리오드, 줄리아나 밀라니, 블레이클리 앤드류스가 실험과 난 티안, 지웨이 허, 피터 레도쇼이치, 미셸 마하르비즈, 토니 하운의 도움을 받아 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
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