Summary
Burada, biz manyetik rezonans göstermektedir (Mr)-güdümlü konveksiyon gelişmiş teslim (Ced) viral vektörler içinde korteks içine etkili ve basitleştirilmiş bir yaklaşım olarak makak beynin büyük kortikal alanlarda arasında optogenetik ifade elde etmek.
Abstract
İnsan dışı primat (NHP) optogenetik olarak, viral vektörler ile büyük kortikal alanları enfekte genellikle zor ve zaman alıcı bir iştir. Burada, optogenetik viral vektörler için manyetik rezonans (MR) destekli konveksiyon gelişmiş teslimat (CED) ' nin primer somatoduyusal (S1) ve motor (M1) korüslerinin etkili, yaygın kortikal ifadesi elde etmek için kullanılması gösterilmektedir. ışık duyarlı iyon kanalları. Adeno-ilişkili viral (AAV) vektörler, Sarı floresan protein (EYFP) için kırmızı-kaydırılmış opsin C1V1 erimiş kodlama Bay güdümlü Ced altında Rhesus Makaklar korteks içine enjekte edildi. Üç ay sonrası infüzyon, epifloresan görüntüleme iki Macaques M1 ve S1 optogenetik ifade (> 130 mm2) büyük bölgeler doğruladı. Ayrıca, mikro-electrocorticographic dizileri kullanarak ifade alanlarından güvenilir ışık uyarılmış Elektrofizyoloji yanıtlarını kayıt edebildik. Daha sonra histolojik analiz ve gazeteciye karşı immünostan, M1 ve S1 'de epifloresan görüntüleme ile gösterilen dağılıma karşılık gelen yaygın ve yoğun optogenetik ifade gösterdi. Bu teknik, geleneksel tekniklere kıyasla minimal hasar ile daha kısa bir süre içinde korteks büyük alanlarda ifade elde etmek için bize sağlar ve NHPs gibi büyük hayvanların optogenetik viral teslim için optimum bir yaklaşım olabilir. Bu yaklaşım, insan evrime yakın hayvan modellerinde hücre tipi özgüllüğü ile sinir devrelerinin ağ düzeyinde manipülasyon için büyük bir potansiyel göstermektedir.
Introduction
Optogenetiği nöral aktivite manipülasyon ve beyindeki ağ bağlantılarının çalışması için izin veren güçlü bir araçtır. İnsan dışı primatlar (NHPs) Bu tekniğin uygulanması büyük ölçekli nöral hesaplama, biliş ve primat beynin davranış anlayışımızı geliştirmek için potansiyele sahiptir. Optogenetiği son yıllarda nhps 'de başarıyla uygulanmasına rağmen1,2,3,4,5,6,7, Araştırmacılar yüz bu hayvanların büyük beyin alanları arasında ifade yüksek düzeylerde elde etmektir. Burada, macakların korteksinin büyük alanlarında yüksek düzeyde optogenetik ifade elde etmek için verimli ve basitleştirilmiş bir yaklaşım sağlıyoruz. Bu tekniğin, bu hayvanların son teknoloji kayıt8,9 ve optik stimülasyon10 teknolojileri ile birlikte mevcut optogenetik çalışmalarını iyileştirmek için büyük bir potansiyeli vardır.
Konveksiyon gelişmiş teslimat (Ced) farmakolojik ajanlar ve diğer büyük moleküllerin, viral vektörler de dahil olmak üzere, merkezi sinir sistemi11,12,13için kurulan bir yöntemdir. Geleneksel Teslimat yöntemleri beyin küçük bölgeler arasında dağıtılan birden düşük hacimli infüzyon içerir ise, CED daha az infüzyon ile daha geniş ve daha bile Ajan dağıtımı elde edebilirsiniz. İnfüzyon sırasında basınç odaklı toplu sıvı akışı (Konveksiyon) CED ile viral vektörler teslim ederken hedef doku daha yaygın ve eşit şekilde dağıtılmış dönüştürücü sağlar. Son çalışmalar, biz temel motor (M1) ve somatoduyusal (S1) korteks9 ve talamus14 manyetik rezonans (Mr) destekli Ced kullanarak büyük alanların transksiyon ve sonraki optogenetik ifade göstermiştir.
Burada, sadece birkaç kortikal enjeksiyon ile büyük kortikal alanlarda optogenetik ifade elde etmek için CED kullanımını özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından onaylanmıştır ve laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzu ile uyumludur. Aşağıdaki prosedür, sırasıyla 17,5 kg ve 16,5 kg (maymun G ve maymun J) ağırlığında, 8 ve 7 yaş arası iki yetişkin erkek Rhesus Makaklar kullanılarak yapılmıştır.
Not: tüm cerrahi prosedürler için standart aseptik teknikler kullanın.
1. temel görüntüleme
- Hayvan sedate ve entübe ve Isoflurane altında genel anestezi korumak (konsantrasyon değişti 0 için 5% gerektiğinde, solunum hızı ve kalp hızı gibi hayati belirtileri bağlı olarak). Hayvan sıcaklığı, kalp hızı, oksijen doygunluğu, elektrokardiyografik tepkiler ve CO2 bitiş-Tidal kısmi basıncı izleme prosedürü boyunca.
- Hayvanı Bay uyumlu stereotaktik çerçeveye yerleştirin ( malzeme tablosunabakın), prosedür boyunca kalacaktır. Hayvanı taşınabilir Mr uyumlu izofluran makinesine bağlayın ve MRI tarayıcına (3 T) taşıma.
- Elde standart T1 (Flip açı = 9 °, tekrarlama süresi/yankı süresi = 668,6, matris boyutu = 192 x 192 x 80, dilim kalınlığı = 1 mm) ve T2 (Flip Angle = 130 °, tekrarlama süresi/yankı süresi = 52,5, matris boyutu = 256 x 256 x 45, dilim kalınlığı = 1 mm) temel olarak anatomik MR görüntüleri Başvuru ve cerrahi planlama için.
- Anestezi hayvan kurtarmak ve hayvan konut alanına taşımak.
- Kraniyotominin yerleşimini belirlemek için elde edilen T1 ve T2 görüntülerini kullanın. Kraniyotominin konumu, Bay 'den gelen kortikal alan ile makak beyin Atlası (Paxinos, Huang, petride, toga 2ND Edition) ile eşleştirilerek kesin olarak belirlenir. Buna ek olarak, bu temel görüntüler viral infüzyon konumları için bir tahmin sağlayabilir. Burada gösterilen ilgi kortikal bölgeler M1 ve S1 vardır.
2. MR-uyumlu Oda Implantasyonu
- Hayvan sedate ve entübe ve 1,1 yılında olduğu gibi standart anestezik izleme ile genel anestezi korumak.
- Hayvanı, Oda implantasyonu ve viral vektör teslimi boyunca kalacağı MR uyumlu stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Hayvanı taşınabilir Bay uyumlu izofluran makinesine bağlayın.
- Bir neşter ile yaklaşık 5 cm uzunluğuna sahip orta çizgiden neredeyse 2 cm sagittal kesi oluşturun.
- Asansörleri kullanarak kafatası temel yumuşak doku çıkarın ( malzeme tablosunabakın).
- Bir trefin (bkz. malzeme tablosu) kullanarak enjeksiyonlar için önceden planlanmış yörüngeleri kapsayacak şekilde dairesel kraniyotomi (2,5 cm çap) oluşturun.
- Trephinin kenarını geçmenin merkezleme noktasını aşağı indirin. Trephin ayarlanabilir merkezleme noktası kullanarak trefin çapa kafatası yeterince derin planlanan kraniyotomi merkezinde bir girinti oluşturun. Bu altta yatan nöral dokuya zarar verebilir gibi kafatası derinliği tamamen penetran önlemek için dikkatli olun.
- Kraniyotomi boyunca doku nemi korumak için gerektiğinde periyodik olarak tuz ile alanı yıkayın.
- Merkezi yapıldıktan sonra, kafatası üzerine trefin düşük ve kemik kapağı forseps ile kaldırılabilir kadar aşağı basınç uygularken saat yönünde ve saat yönünün tersine trefin döndürün. Trephine ile temel doku zarar görmesini önlemek için dikkatli olun.
- Diş ince bir sütür (Boyut 6-0) kraniyotomi merkezinde dura ile ve yavaşça kraniyotomi merkezinde bir çadır oluşturarak beynin yüzeyinden sütür çekerek dura kaldırın.
- Sonra, beynin zarar görmesini önlemek için ince oftalmik makas kullanarak çadırda merkezine dura yakın delinme. Daha sonra kraniyotominin kenarına merkezden dura kesmek ve ince optalik makas ile kenar boyunca devam.
- Dairesel özel yapılan CED MR uyumlu odası monte edin (Şekil 1; üretim talimatları için Bölüm 4 ' e bakın), Ced infüzyon sırasında kanül desteği sağlamak için kraniyotominin üstündeki kafatasına, Oda flanşı eğriliği hizalar kafatası eğriliği ile iyi.
- Plastik vida ve diş akrilik ya da birkaç titanyum vida kullanarak kafatası implantları güvenli.
3. Viral vektör teslim
- Bay uyumlu odası implantasyonundan ve kanül enjeksiyon ızgarasını (Şekil 1a-B, tamamlayıcı Şekil 1) odasına yerleştirdikten hemen sonra, enjeksıyon konumlarını Mr anatomik görüntüleri ile görselleştirerek ızgarayı (0,9% NaCl) tuz ile doldurun ve beyin nemi korumak için ıslak steril absorblenebilir jelatin ile Oda boşlukları doldurun (Şekil 1F).
- Taşıma ve Mr infüzyon sırasında silindirlerin sterilitesi korumak için steril bir antimikrobiyal yakma asmak ile cilt ve silindir kapak. Pozitif kimlik için enjeksiyon ızgarasının üst işaretlemek için bir vitamin E kapsül yerleştirin.
- Hayvan intübik kalırken, endotrakeal tüpü anestezi devresinde ayırın ve taşınabilir Bay uyumlu izofluran makineye yeniden takın ve hayvanı MRI tarayıcılarına taşıma.
- Elde T1 görüntüleri (Flip açı = 9 °, tekrarlama süresi/Echo zaman = 668,6, matris boyutu = 192 x 192, dilim kalınlığı = 1 mm, 80 dilim) enjeksiyon ızgarasının üst ve kortikal yüzey uzaklığı hesaplamak için. E vitamini kapsülü T1 görüntülerde açıkça görülebilir ve enjeksiyon ızgarasının üst kısmında bir marker olarak kullanılmalıdır (Şekil 2a). Enjeksiyon ızgarasının üst ve kortikal yüzey arasındaki mesafeyi ölçmek için MR görüntüleme yazılımının cetvel aracını kullanın.
- T2 görüntüleri elde (Flip açı = 130 °, tekrarlama süresi/Echo zaman = 52,5, matris boyutu = 256 x 256, dilim kalınlığı = 1 mm, 45 dilim) her site için optimum kanül kılavuzları belirlemek için infüzyon hedeflenen siteye dayalı (Şekil 2B-C). Daha önce belirtildiği gibi, kanül ızgarası T2 görüntülerde en iyi görünür olan tuzlu ile doldurulur. MR görüntüleme yazılımını kullanarak, infüzyon hedef konumunu bulmak için koronal ve sagittal düzlemleri ilerleyin.
- Oda sıcaklığında birkaç saat için viral vektörünün çözülme sonra, Bay kontrast Ajan gadoteridol ile viral vektör Mix (250:1 oranı; 2mM GD-DTPA, bkz: malzeme tablosu) pipet veya Vortex karıştırma ile.
Not: Sunulan tekniği bir camkiia Organizatör sürüş ifadesi ile AAV vektörler için test edildi C1V1 EYFP için erimiş (AAV 2.5-camkii-C1V1-EYFP, titer: 2,5 x 1012 virüs molekülleri/ml; malzeme tablosunabakın). - Karışık virüsü bir 0,2 mL yüksek basınçlı IV tüpüne yükleyin (bkz. malzeme tablosu).
- Viral infüzyon hattını hazırlamak için MR tarayıcısının dışında steril bir alan kurun.
- Yüksek basınçlı IV boru kullanarak, uzun bir uzatma hattı bağlayın (yaklaşık 3-5 metre, Bay delik ile ilgili İnfüzyon Pompası konumuna bağlı olarak) bir MR-uyumlu 3 mL şırınga ve tuz ile Prime.
- Uzun uzatma hattının distal ucunu virüs ile yüklenen 0,2 mL IV boruların proksimal ucuna bağlayın ve reflü-dirençli kanülünü 1 mm kademeli ucu ile takın (Şekil 2D; kanül üretim talimatları için Bölüm 5 ' e bakınız) distal ucunu Bu montaj bir kelepçe tarzı kateter konektörü ile (bkz. malzeme tablosu) (Şekil 2e).
- Son olarak, Bay uyumlu bir pompanın içinde şırıngayı ayarlayın (bkz. malzeme tablosu). Pompa kumandasını MR uyumlu olmadığı için tarayıcı kontrol odasına yerleştirin.
- Daha önce elde edilen temel anatomik MR görüntülerini kullanarak, hedef infüzyon sitesine ulaşmak için gerekli kanül enjeksiyon ızgarası konumunu ve ekleme derinliğini seçin. Steril teyp kullanarak kanula üzerinde ekleme derinliği işaretleyin.
- İnfüzyon 1 μL/dak hızında başlayın ve kanül ucundan sıvının ejeksiyonu gözlemleyerek infüzyon hattında sıvının akışını görsel olarak doğrulayın.
- Bu ekleme sırasında kanül tıkanma nüfuz doku önleyecek gibi infüzyon hattında akış korurken, enjeksiyon ızgarası aracılığıyla hedef derinliğe kanül takın.
- Elde hızlı (2 dakika) flaş T1 ağırlıklı görüntüler (Flip açı = 30 °, tekrarlama süresi/Echo Time = 3,05, matris boyutu = 128 x 128, dilim kalınlığı = 1 mm, 64 dilim) Viral vektör infüzyon online izleme için.
- ~ 10 μL vektörünün, MR tarayıcısını tespit etmek için yeterince virüs bulaşmasının ardından, virüsün gözlenen yayılması tarafından belirgin olarak doğru kanül yerleşimi doğrulamak için MR görüntüleri elde edin. Eklenen kanülün derinliği yanlıştır, derinliği buna göre ayarlayın veya kanül yavaşça kaldırın ve 3,12 olarak ekleme yeniden deneyin.
- Çevrimiçi MR görüntülerinin rehberlik yoluyla infüzyon izleyin (flaş T1 ağırlıklı) ve birkaç dakikada 5 μL/dak ile infüzyon hızını artırmak 1 μL/dak adımları (Şekil 3A).
- Viral vektörden yaklaşık 40 μL 'ye bulaştıktan sonra, infüzyon hızını 1 μL/dak adımında azaltmaya başlar ve ~ 50 μL enjekte edildikten sonra infüzyonu durdurur ve kanulayı 10 dakika boyunca yerine bırakın.
- Yavaşça beyinden kanül çıkarın ve bir sonraki konuma taşıyın. 3,9 her konum için 3,19 için adımları yineleyin.
- Enjeksiyon sonunda steril bir örtü ile silindir kapak, hayvan taşımacılığı önce. Sonra hayvanı ameliyathane geri taşıma.
- Ya Mr uyumlu odası eksplant ve kemik flep ve aşırı kas değiştirerek ve standart aseptik teknikleri kullanarak cilt dikiş veya titanyum silindir ve yapay dura ile Oda yerine cerrahi kesi kapatın (bkz. Yazdan-Shahmorad ve ark. 20169) nöral kayıt ve stimülasyon için.
4. MR uyumlu Oda üretimi
- Naylon kanül enjeksiyon ızgarasını (Şekil 1a-B) belirtilen boyutlara göre işleme yoluyla imal ederler (Tamamlayıcı Şekil 1).
- 3B, Bay uyumlu silindiri Akrilonitril bütadien stiren (ABS0 plastik (Şekil 1C-E) (bkz. ek dosya 1 – 3; 3B yazıcı ve materyaller için malzeme tablosuna bakın).
Not: Bir tasarım, MR uyumlu silindir içinde sabit bir kanül enjeksiyon ızgarası tutar (Şekil 1C), diğeri ızgaranın dönüşü için izin verirken, enjeksiyon bölgesini genişletiyor (Şekil 1D-E). - Kanül enjeksiyon ızgarasını iplik ve Bay uyumlu odasının karşılık gelen boşluğuna dokunun, her iki parça da aynı iş parçacığını sergiler.
Not: Her iki bileşen de aynı iş parçacığına sahip olması koşuluyla, her tür iş parçacığı kullanılabilir. - MR uyumlu silindirin delikli deliğe vidalayarak naylon kanül enjeksiyon ızgarasını takın.
5. reflü-dirençli kanül üretimi13
- 0,32 mm ID ve 0,43 mm OD ile 30 cm uzunluğundaki silika tüpü, iç silika borusu için (bkz. malzeme tablosu) bir jilet kullanarak kes.
- 0,45 mm ID ve 0,76 mm OD ile dış silika borusu için 7,5 cm uzunluğunda ve 5 cm uzunluğunda silika tüpünü kesiniz (bkz. malzeme tablosu).
- 7,5 cm dış tüpüne siyanoakrilat ile 30 cm iç tüpüne, iç tüpün dış tüpün 1 mm ötesinde, reflü-dirençli basamaklarla (Şekil 2D) uzanmasını sağlayan şekilde uyur. Siyanoakrilgeç iç tüpün içine girmez emin olmak için, kanül ucu uzak iç tüp dışında siyanoakrilat yerleştirin.
- 5 cm uzunluğunda silika tüpünü, kelepçe stili kateter konektörüne iliştirmek için iç tüpün diğer ucuna yapıştırın (bkz. Adım 3,10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MRG rehberlik altında konveksiyon gelişmiş teslimat (CED)
Viral vektörünün yayılmasını, CED infüzyon sırasında online MR görüntüleri (Şekil 3A) rehberlik altında izleniyor. Bu çalışmada iki maymun S1 ve M1 hedeflenmiştir (Şekil 3B). Üç boyutlu dağıtım hacimleri MR görüntüleri bir post-hoc analiz tahmin edildi (Şekil 3c) tarafından açıklandığı gibi yazdan-Shahmorad ve al. 20169, korteks büyük alanların kapsamı teyit. Maymun G için M1 infüzyon zaman kısıtlamaları nedeniyle MR rehberlik olmadan yapıldı.
Viral Ifade doğrulama
Büyük kortikal optogenetik ifadesi, yazdan-shahmorad ve ark. 2016 tarafından açıklandığı gibi epifloresan görüntüleme, elektrofizyolojik kayıtlar ve histolojik analiz ile teyit edildi9. Floresan muhabiri2,9 ' nın yüzey epifluorescence görüntülemesi ile optogenetik ifadeyi takip ettik ve M1 'de kortikal yüzey ve sadece üç tane iki macsu S1 'de 130 mm2 ' den fazla ifade tahmini kortikal enjeksiyonları9,15. Işık stimülasyon (488 Nm, 20 MW 'lik güç ucu; bkz. malzeme tablosu) yarı şeffaf mikro-electrocorticographic diziler ile ölçülen ifade alanlarında güvenilir elektrofizyolojik tepkiler vermiştir8,9 ,16 (Şekil 4).
MR görüntülerinin Analizi tahmini 233 mm3 ve 433 mm3 vektör Spread M1 ve S1 maymun J, sırasıyla ve 317 mm3 , S1 Monkey G9vermiştir. Seri koronal bölümlerde histolojik analizler gerçekleştirdik ve M1 ve S1 (Şekil 5c-ı) infüzyon bölgeleri etrafında büyük ölçekli optogenetik ifadeler gözlenen ve% 70-80 ' lık hücrelerde opsin ifadesini ifade etmiştir. Histolojiden gözlenen ifade, epifloresan görüntüleme (Şekil 5A-D) ile tahmini ifade dağılımına hizalanır. Maymun G 'de MR tarayıcısının dışında gerçekleştirilen iki infüzyon, karşılık gelen bölgede hiçbir ifade veren (Şekil 5D) başarısız oldu. Mr görüntülemesinde tahmin edilen Spread, hem epifloresan hem de viral yayılım histolojik önlemlerinin sınırları içindedir (Şekil 5e-G). Mr tahmininin ötesinde epifloresan görüntüleme genişleme Adveksiyon bölgenin ötesinde viral partiküllerin difüzyon atfedilebilir. Dahası, histolojik tahmin kraniyotominin ötesinde optik erişim eksikliği nedeniyle epifluorescence tahmin ötesinde uzatılmış. Bu tekniklerin detayları önceki kağıt9' da yer almaktadır.
Şekil 1: Bay uyumlu silindir ve kanül enjeksiyon ızgarası. (A, B) özel tasarlanmış naylon enjeksiyon ızgarası. (C) Mr uyumlu sabit silindir. (D, E) Döner Bay uyumlu silindir. (F) sabit ızgara konumu ile Mr uyumlu infüzyon silindiri. Oklar, enjeksiyon süresi boyunca beynin nemli yüzeyini tutan, ıslak steril absorblenebilir jelatin ile doldurulacak şekilde tasarlanmış boşluklara işaret eder. (G) kanül ızgaraya takılı. Bu rakam yazdan-Shahmorad ve ark. 20169' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Temel Mr görüntüleme ve reflü dirençli kanül. (A) bize beyin yüzeyine (beyaz ok) mesafesini ölçmek için olanak sağlayan enjeksiyon ızgarasının üst bağlı olan E vitamini, T1 ağırlıklı görüntü. (B) beynin T2 ağırlıklı görüntüsü, serum ile dolu kanül ızgarası enjeksiyon konumunu planlamak için yardımcı olur. (C) infüzyon odasının ve tuz dolu kanül ızgarasının Bay görüntüsü. Ortogonal çizgiler sagittal (sarı) ve koronal (mor) düzlemleri temsil eder. (D) reflü dirençli adım (siyah ok) ile reflü dayanıklı enjeksiyon kanül ucu fotoğrafı. (E) infüzyon hatları. Bu rakam yazdan-Shahmorad ve ark. 20169' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: İnfüzyon sırasında Mr görüntüleme ve tahmini dağılım. (A) 50, maymun G 'nin koronal bölümlerinde viral vektörünün μL 'ye yayılması S1 'de bir enjeksiyon sitesi Için ( B'de bir ok ile gösterilir). (B) maymun G ve J için silindir altında kortikal yüzey MRG yüzey işleme, sırasıyla. S1 infüzyon konumları mavi, M1 yerlerde kırmızı renkte gösterilir. (C) Ced infüzyon sonra viral vektörünün yayılması Bay hacim yeniden yapılanma. Beyin açık gri gösterilir; S1 ve M1 infüzyon hacimleri sırasıyla mavi ve kırmızı renkte gösterilir. Onlar MR tarayıcıda yapılmadı çünkü Hayır MR hacim yeniden inşa maymun G için M1 infüzyon için kullanılabilir. Bu rakam yazdan-Shahmorad ve ark. 20169' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Hafif uyarılmış faaliyetin elektrofizyolojik kayıtları. Mikro-electrocortikografi (μECoG) kayıtları, darbeli optik stimülasyon sırasında oluştu. Kayıt izleri M1 (kırmızı) ve S1 (yeşil) stimülasyon konumları örnekleri için stimülasyon sitesine en yakın elektrot oldu. İzlemelerin çevresindeki gölgeli alanlar, 25 denemeler boyunca standart hatayı temsil eder. İzleri mavi kareler stimülasyon zamanlaması gösterir (1 MS). Uyarıcı ve kayıt siteleri hem örnek çiftleri için Stimulus tetiklenen dalga formları tam set panelin sol tarafında gösterildiği gibi ortalama dalga üzerine üst üste. Bu rakam yazdan-Shahmorad ve ark. 20169' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Histolojik analiz. (A) maymun G 'de temel koronal Mr görüntü (B) aynı Bay koronal dilim için infüzyon sonra kontrast Ajan yayılması a. (C) yaklaşık olarak aynı siteden bir koronal doku bölümü a ve B; peroksidaz boyama EYFP-Reporter ifadesini yansıtır. (D) yüzey epiflourescence (koyu yeşil alanlar) ve histolojik boyama (açık yeşil çizgiler) ile ölçülen EYFP ifade alanı arasında iyi hizalama görülür. Bunlar, MR görüntülerden tahmin edilen vektör yayılma bölgesini içerir (beyaz çizgi); beyaz noktalar enjeksiyon yerlerini gösterir ve tüm siyah bölge kraniyotomi tarafından maruz kalan alanı temsil eder. İki sol en enjeksiyon siteleri M1 bulunmaktadır, ve iki sağ çoğu site S1 bulunur. (E) maymun J somatoduyusal KORTEKS YFP ifade Medio-lateral yönü gösteren ANTI-Gfp antikor ile lekelenmiş koronal bölümün düşük büyütme görüntü (alanlar 1, 2, 3). Siyah ok ucu kanül parçanın yerini gösterir; bitişik doku (siyah çerçeve) F, YFP-pozitif hücrelerin laminar dağılımı göstermek için daha fazla büyütme olarak gösterilir. (F) YFP-pozitif hücrelerin yoğun nüfuslu bölgeleri AĞıRLıKLı olarak II-III ve V-VI katmanlarında yer almaktadır ve ayrıca tipik piramit morfolojisi (beyaz çerçevelerdeki hücreler daha çok panellerde büyütülmüştür (G-ı). Alt panellerde beyaz ok uçları G-ı katmanlarda tipik piramit hücrelerine işaret II-III (g); katman V (H); ve katman VI (ı). Ölçek çubukları = 2 mm (E); 200 μm (F); 100 μm (G-ı). Bu rakam, yazdan-Shahmorad ve al. 20169 ve yazdan-shahmorad ve ark. 201815' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1: diş açma öncesinde kanül enjeksiyon ızgarası. Enjeksiyon ızgarasının uzunluğu ve çapı sırasıyla 15,00 mm ve 12,00 mm 'dir. Enjeksiyon ızgarası deseni, ızgara merkezinin etrafında üç Eşmerkezli daire oluşturan 0,8 mm çaplı deliklerden oluşur (çap: 1,6, 3,2 ve 4,8 mm). Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı dosyalar. Bu dosyaları indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, Bay güdümlü CED tarafından NHP primer somatoduyusal ve motor korteks büyük ölçekli optogenetik ifade elde etmek için uygulanabilir ve verimli bir tekniği özetlemektedir. MR-güdümlü CED kullanımı NHP beynin geleneksel viral infüzyon yöntemleri üzerinde önemli avantajlar sunar. Böyle bir avantaj, daha az gerekli infüzyon ile büyük alanlarda ifade elde etme yeteneğidir. Örneğin, geleneksel yöntemlerle, 2-3 mm çap bölge1,2,5,17' de vektör verim ifadesinin 1-2 μL çoklu enjeksiyonları. Büyük ölçekli vektör Spread elde önceki girişimleri yaklaşık 10 mm3 birden fazla enjeksiyon ile ifade hacimleri vermiştir iken18, burada biz sadece birkaç infüzyon ile 200 mm3 üzerinde ifade elde etmek için bir yöntem sunuyoruz . Ced tarafından 50 μL 'nin tek bir infüzyonu, kortikal Ced9 ve talamik Ced14ile frontal kortikal alanların tam kapsama alanı için enjeksiyon bölgesinden 10 mm 'ye kadar vektör yayılması elde edebilir.
Ayrıca, Ced kullanarak enjekte ajan daha homojen dağılımı elde edebilirsiniz gösterilmiştir12,19,20,21,22, uniform ifade seviyeleri önde gelen Viral vektör infüzyon site etrafında, geleneksel Mikroenjeksiyonu ile karşılaştırıldığında. Ced 'deki deneyimizde, opsin8,9 (Şekil 5) ' i ifade eden nöronların yaklaşık% 70-80 ' ü ile eşit derecede yüksek ifade seviyeleri izlendi. Buna karşılık, konvansiyonel difüzyon bazlı enjeksiyonlar yüksek ifade çevre Enjeksiyon bölgeleri zayıflatma tarafından sarıldı yakın yoğunlaştı alanları4,5,17. Birden fazla enjeksiyon için azaltılmış ihtiyaç CED infüzyon büyük ölçekli, üniforma optogenetik ifade elde etmek için zaman verimli bir yöntem oluşturur. Enjeksiyon ve daha hızlı infüzyon oranlarının daha az sayıda nedeniyle, biz plan ve MRI rehberlik altında Viral vektör infüze başardık. Çevrimiçi MR görüntülerinin kullanımı infüzyon ve İnfüzyonlar hassas hedefleme sağlar Viral vektör yayılması sırasında Infüzyon sırasında izlenmesi. Ancak, eklenen kanül ilk derinliği yanlıştır, bu ifade istenmeyen yerlerde ilk infüzyon sonucu olarak verebilir ~ 10 μL görsel olarak MR ile infüzyonu algılamak için gerekli. alternatif olarak, ticari Nöroşirürji navigasyon sistemleri hem de MR rehberlik yerine istihdam edilebilir fiducial işaretçileri kullanarak. Ayrıca, çevrimiçi görüntüleme maliyetleri, ekleme ve infüzyon hattı ile tam infüzyon görsel olarak teyit önce kanül üzerine ekleme istenilen derinliği işaretleyerek kaçınılabilir, kanül yerleştirme doğruluğu olurdu rağmen Azaltılmış. Ancak, M1 maymun G (Şekil 5D) başarısız enjeksiyon tarafından görüldüğü gibi, Mr rehberlik başarılı infüzyon sağlamak için önemli olabilir.
Önceki çalışmalar kanül sistemi dışında hiçbir gözlenen doku hasarı ile hem viral olmayan ve viral partiküllerin Ced infüzyon güvenliğini göstermiştir ve hiçbir davranış açıkları9,11,12,13 ,14,15,20. Burada ve önceki yayınlarda9,14 biz optogenetic viral vektörler Ced infüzyon aşağıdaki benzer sonuçlar rapor. İnfüzyon aşağıdaki gözlenen davranışsal açıkları ek olarak, Neun ve nissl9,14,15 boyama nöronal hücre ölümü ortaya ve maddede gliozisi destekleyen sadece kanül yolu ile sınırlı olduğu, olduğu bildirildi Difüzyon tabanlı yöntemleri ile5. Kanül pistinden gelen hasarı en aza indirmek için, kanülün çapını potansiyel olarak azaltabiliriz. Ancak, büyük ifade alanlarına ulaşmada kanül boyutu azaltma etkisini değerlendirmek için daha fazla soruşturma gereklidir. Dahası, yüksek infüzyon oranları da doku hasarı13neden olabilir, çünkü 5 μL/dak altında veya altında bir infüzyon oranı korumak için tavsiye edilir. CED tekniği hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen önceki yayınımıza bakınız9.
Primat korteks içinde hedeflenen optogenetik ifade geniş bölgelere ulaşmak için Bay güdümlü CED kullanımı büyük ölçekli devre dinamikleri, nöral plastisite ve ağ bağlantısı daha fazla soruşturma yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS Nöralink Corp, beyin stimülasyon kullanarak klinik tedaviler gelişmekte olan bir şirket mali ilgi vardır.
Acknowledgments
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği doktora sonrası Bursu (AY), Savunma Gelişmiş Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) yeniden yapılanma ve plastisite yaralanma kurtarma hızlandırmak için (onarım; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ve UCSF Nörobilim görüntüleme Merkezi tarafından. Bu çalışma da Eunice Kennedy Shiver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı & ınsan gelişimi Sağlık Ulusal Enstitüleri ödül numarası K12HD073945, Washington Ulusal Primate Araştırma Merkezi (WaNPCR, P51 OD010425) altında tarafından desteklenmektedir ve Neuroteknoloji Merkezi (CNT, Grant EEC altında bir Ulusal Bilim Vakfı Mühendisliği Araştırma Merkezi-1028725). Biz, deneme ve Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz ve Toni haun teknik yardım için onların yardım için Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani ve Blakely Andrews teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
