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Neuroscience

ऑनलाइन एमआरआई छवियों के मार्गदर्शन के तहत Rhesus Macakue के कोर्टेक्स के लिए Optogenetic Adeno-संबद्ध वायरल वेक्टर की Convection बढ़ी डिलीवरी

Published: May 23, 2019 doi: 10.3791/59232
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 1,2,3,4
1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

Summary

यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (CED) कॉर्टेक्स में वायरल वैक्टर के एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शित करने के लिए बड़े cortical क्षेत्रों में macacue मस्तिष्क में optogenetic अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए.

Abstract

गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी) ऑप्टोजेनेटिक्स में, वायरल वैक्टर के साथ बड़े cortical क्षेत्रों को संक्रमित करना अक्सर एक कठिन और समय लेने वाला कार्य होता है। यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (सीईडी) के प्राथमिक somatosensory में optogenetic वायरल वैक्टर के उपयोग का प्रदर्शन (S1) और मोटर (M1) macacues के cortices के कुशल प्राप्त करने के लिए, व्यापक cortical अभिव्यक्ति प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनल. एडीनो-संबद्ध वायरल (एएवी) वेक्टर्स को लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन सी1वी 1 को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईईएफपी) में शामिल किया गया था, एमआर-गाइडेड सीईडी के तहत रीसस मैकैक के प्रांतस्था में इंजेक्ट किया गया था। तीन महीने के बाद infusion, epifluorescent इमेजिंग optogenetic अभिव्यक्ति के बड़े क्षेत्रों की पुष्टि की (gt; 130 मिमी2) M1 में और S1 दो macacues में. इसके अलावा, हम माइक्रो-इलेक्ट्रोकोर्टिकोग्राफिक सरणियों का उपयोग कर व्यक्त क्षेत्रों से विश्वसनीय प्रकाश-evoked इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने में सक्षम थे। बाद में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और रिपोर्टर के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग ने एम 1 और एस 1 में व्यापक और घने ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति का खुलासा किया जो एपिफ्लोरेसेंट इमेजिंग द्वारा इंगित वितरण के अनुरूप था। इस तकनीक हमें पारंपरिक तकनीकों की तुलना में कम से कम नुकसान के साथ समय की एक छोटी अवधि के भीतर प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है और ऐसे NHPs के रूप में बड़े जानवरों में optogenetic वायरल वितरण के लिए एक इष्टतम दृष्टिकोण हो सकता है. इस दृष्टिकोण पशु मॉडल developmentally मनुष्यों के करीब में सेल प्रकार विशिष्टता के साथ तंत्रिका सर्किट के नेटवर्क स्तर हेरफेर के लिए महान क्षमता को दर्शाता है.

Introduction

Optogenetics एक शक्तिशाली उपकरण है कि तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर और मस्तिष्क में नेटवर्क कनेक्शन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. गैर मानव primates में इस तकनीक को लागू करने (NHPs) प्राइमेट मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर तंत्रिका गणना, अनुभूति, और व्यवहार की हमारी समझ को बढ़ाने की क्षमता है. यद्यपि हाल के वर्षों में एन एच पी में ओपीपी में ऑप्टोजेनेटिक्स को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है1,2,3,4,5,6,7, एक चुनौती है कि शोधकर्ताओं का सामना इन जानवरों में बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों में अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त कर रहा है. यहाँ, हम एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण प्रदान कर रहे हैं macacues में प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए. इस तकनीक के राज्य के अत्याधुनिक रिकॉर्डिंग8,9 और ऑप्टिकल उत्तेजना10 प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में इन जानवरों में वर्तमान optogenetic अध्ययन में सुधार करने के लिए महान क्षमता है।

Convection बढ़ाया वितरण (सीईडी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र11,12,13के लिए वायरल वैक्टर सहित औषधीय एजेंटों और अन्य बड़े अणुओं की डिलीवरी की एक स्थापित विधि है। जबकि पारंपरिक वितरण विधियों मस्तिष्क के छोटे क्षेत्रों में वितरित कई कम मात्रा अर्क शामिल, CED कम अर्क के साथ व्यापक और अधिक भी एजेंट वितरण प्राप्त कर सकते हैं. जलसेक के दौरान दबाव संचालित थोक तरल प्रवाह (संवहन) सीईडी के साथ वायरल वैक्टर पहुंचाने पर लक्ष्य ऊतक के अधिक व्यापक रूप से और समान रूप से वितरित ट्रांसडक्शन के लिए अनुमति देता है। हाल के अध्ययनों में, हम ट्रांसडक्शन और बाद में optogenetic प्राथमिक मोटर के बड़े क्षेत्रों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन (M1) और somatosensory (S1) cortices9 और thalamus14 चुंबकीय अनुनाद का उपयोग (एमआर) निर्देशित सी.डी.

यहाँ, हम केवल कुछ cortical इंजेक्शन के साथ बड़े cortical क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए सीईडी के उपयोग की रूपरेखा.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप हैं. निम्नलिखित प्रक्रिया क्रमशः 17.5 किलो और 16.5 किलो (बंदर जी और बंदर जे) का वजन 8 और 7 साल की उम्र के दो वयस्क पुरुष रीसस मैकैक का उपयोग करके किया गया था।

नोट: सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए मानक aseptic तकनीक का उपयोग करें.

1. बेसलाइन इमेजिंग

  1. जानवर को शांत और intubate और isoflurane के तहत सामान्य संज्ञाहरण बनाए रखने (संकेंद्रण के बीच बदल 0 करने के लिए 5% के रूप में की जरूरत है, इस तरह के श्वसन दर और दिल की दर के रूप में महत्वपूर्ण संकेत पर निर्भर करता है). प्रक्रिया के दौरान पशु के तापमान, दिल की दर, ऑक्सीजन संतृप्ति, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफिक प्रतिक्रियाओं, और सीओ2 के अंत-ज्वार आंशिक दबाव की निगरानी करें।
  2. एक एमआर संगत स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में जानवर प्लेस (सामग्री की मेजदेखें) जिसमें यह प्रक्रिया के दौरान रहेगा. एक पोर्टेबल एमआर संगत isoflurane मशीन के लिए जानवर कनेक्ट और एमआरआई स्कैनर (3 टी) के लिए परिवहन।
  3. मानक T1 प्राप्त करें (फ्लिप कोण $ 9 ], पुनरावृत्ति समय / इको समय ] 668.6, मैट्रिक्स आकार ] 192 x 192 x 80 , टुकड़ा मोटाई ] 1 मिमी) और T2 (फ्लिप कोण ] 130 डिग्री, पुनरावृत्ति समय / संदर्भ और शल्य योजना के लिए.
  4. संज्ञाहरण से पशु को पुनर्प्राप्त करें और इसे पशु आवास क्षेत्र में ले जाएं।
  5. अधिग्रहीत T1 और T2 छवियों का उपयोग करने के लिए craniotomy की नियुक्ति निर्धारित करते हैं. craniotomy के स्थान ठीक मैके मस्तिष्क एटलस (Paxinos, Huang, Petride, तोगा 2एन डी संस्करण) के साथ एमआर से ब्याज की cortical क्षेत्र मिलान द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इसके अलावा, इन आधारभूत छवियों वायरल जलसेक के स्थानों के लिए एक अनुमान प्रदान कर सकते हैं. यहाँ प्रदर्शित ब्याज के cortical क्षेत्रों M1 और S1 हैं.

2. एमआर-संगत चैंबर प्रत्यारोपण

  1. जानवर को शांत और intubate और 1.1 में के रूप में मानक संवेदनाहारी निगरानी के साथ सामान्य संज्ञाहरण बनाए रखने.
  2. यह कक्ष प्रत्यारोपण और वायरल वेक्टर वितरण भर में रहेगा, जिसमें एमआर-संगत स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में जानवर रखें। एक पोर्टेबल एमआर संगत isoflurane मशीन के लिए जानवर कनेक्ट करें।
  3. एक स्केलपेल के साथ लगभग 5 सेमी की लंबाई के साथ मिडलाइन से लगभग 2 सेमी एक सैगिटल चीरा बनाएं।
  4. लिफ्ट का उपयोग कर खोपड़ी से अंतर्निहित नरम ऊतक निकालें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. एक ट्रेफिन का उपयोग कर इंजेक्शन के लिए पूर्व-नियोजित त्रासदियों को कवर करने के लिए एक परिपत्र craniotomy (2.5 सेमी व्यास) बनाएँ (सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. ट्रेफिन के किनारे पिछले ट्रेफिन के केंद्र बिंदु को कम करें। ट्रेफिन के समायोज्य केंद्र बिंदु का उपयोग करके ट्रेफिन को स्थिर करने के लिए खोपड़ी में पर्याप्त रूप से गहरी नियोजित क्रैनियोटोमी के केंद्र में एक इंडेंटेशन बनाएं। खोपड़ी की गहराई के माध्यम से पूरी तरह से मर्मज्ञ से बचने के लिए सावधानी बरतें क्योंकि इससे अंतर्निहित तंत्रिका ऊतक को नुकसान हो सकता है।
    2. समय-समय पर कपाल विज्ञान के दौरान ऊतक नमी बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में लवण के साथ क्षेत्र फ्लश।
    3. एक बार केंद्र बना दिया गया है, खोपड़ी पर ट्रेफिन कम और trephine दक्षिणावर्त बारी बारी से और counterclockwise जबकि नीचे दबाव लागू करने जब तक हड्डी टोपी forceps के साथ हटाया जा सकता है. ट्रेफिन के साथ अंतर्निहित ऊतक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
  6. क्रैनिओटोमी के केंद्र में ड्यूरा के माध्यम से एक ठीक सीवन (आकार 6-0) धागा और धीरे craniotomy के केंद्र में एक तम्बू बनाने मस्तिष्क की सतह से सीवन खींच कर ड्यूरा उठा.
  7. इसके बाद, मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ठीक नेत्र कैंची का उपयोग करके तम्बू के केंद्र के करीब ड्यूरा को पंचर करें। फिर केंद्र से craniotomy के किनारे करने के लिए ड्यूरा में कटौती और ठीक opthalmic कैंची के साथ किनारे के साथ जारी है.
  8. सीईडी जलसेक के दौरान कैनुला समर्थन प्रदान करने के लिए कपाल के शीर्ष पर कपाल के ऊपर कपाल को बेलनाकार कस्टम-निर्मित सीईडी एमआर-संगत कक्ष (चित्र 1; उत्पादन निर्देशों के लिए अनुभाग 4 देखें) को माउंट करें ताकि सीईडी जलसेक के दौरान कैनुला सहायता प्रदान की जा सके ताकि कक्ष फ्लेंग की वक्रता संरेखित हो सके खोपड़ी की वक्रता के साथ अच्छी तरह से.
  9. या तो प्लास्टिक शिकंजा और दंत एक्रिलिक या कुछ टाइटेनियम शिकंजा का उपयोग खोपड़ी के लिए प्रत्यारोपण सुरक्षित.

3. वायरल वेक्टर डिलिवरी

  1. एमआर-संगत कक्ष को प्रत्यारोपित करने और कैनुला इंजेक्शन ग्रिड डालने के तुरंत बाद (चित्र 1A-B, अनुपूरक चित्रा 1) कक्ष में, एमआर शारीरिक छवियों के माध्यम से इंजेक्शन स्थानों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए नमकीन (0.9% NaCl) के साथ ग्रिड भरें और मस्तिष्क की नमी बनाए रखने के लिए गीले बाँझ अवशोषक जिलेटिन के साथ कक्ष गुहाओं को भरें (चित्र 1 एफ) .
  2. परिवहन और एमआर जलसेक के दौरान सिलेंडरों की बाँझपन बनाए रखने के लिए त्वचा और सिलेंडर को बाँझ एंटीमाइक्रोबियल छेदा के साथ कवर करें। सकारात्मक पहचान के लिए इंजेक्शन ग्रिड के शीर्ष को चिह्नित करने के लिए एक विटामिन ई कैप्सूल रखें।
  3. जबकि जानवर intubated रहता है, संज्ञाहरण सर्किट से endotracheal ट्यूब अलग और यह एक पोर्टेबल एमआर संगत isoflurane मशीन के लिए reattach और एमआरआई स्कैनर के लिए पशु परिवहन.
  4. इंजेक्शन ग्रिड और cortical सतह के ऊपर से दूरी की गणना करने के लिए T1 छवियों (फ्लिप कोण $ 9 ], पुनरावृत्ति समय / इको समय $ 668.6, मैट्रिक्स आकार $ 192 x 192, टुकड़ा मोटाई $ 1 मिमी, 80 स्लाइस) प्राप्त करें। विटामिन ई कैप्सूल टी 1 छवियों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और इंजेक्शन ग्रिड के शीर्ष के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए (चित्र 2A) . इंजेक्शन ग्रिड और cortical सतह के शीर्ष के बीच की दूरी को मापने के लिए एमआर इमेजिंग सॉफ्टवेयर के शासक उपकरण का उपयोग करें।
  5. T2 छवियों का अधिग्रहण (फ्लिप कोण [ 130 डिग्री, पुनरावृत्ति समय / इको समय ] 52.5, मैट्रिक्स आकार ] 256 x 256, टुकड़ा मोटाई $ 1 मिमी, 45 स्लाइस) जलसेक के लक्षित साइट के आधार पर प्रत्येक साइट के लिए इष्टतम cannula गाइड निर्धारित करने के लिए (चित्र 2B-C)। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, कैनुला ग्रिड लवण से भरा होता है जो टी 2 छवियों में सबसे अच्छा दिखाई देता है। एमआर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, कोरोनल और sagittal विमानों के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए जलसेक के लक्ष्य स्थान खोजने के लिए.
  6. कमरे के तापमान पर कुछ घंटों के लिए वायरल वेक्टर thwing के बाद, MR कंट्रास्ट एजेंट gadoteridol के साथ वायरल वेक्टर मिश्रण (250:1 के अनुपात; 2mM Gd-DTPA, सामग्री की तालिकादेखें) pippette या भंवर मिश्रण द्वारा.
    नोट: प्रस्तुत तकनीक एक CamKIIa प्रमोटर के साथ AAV वेक्टर्स के लिए परीक्षण किया गया था C1V1 की ड्राइविंग अभिव्यक्ति EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 वायरस अणुओं /
  7. मिश्रित वायरस को 0ण्2 एमएल उच्च दाब IV ट्यूबिंग में लोड करें (सामग्री की सारणीदेखें )
  8. वायरल जलसेक लाइन तैयार करने के लिए एमआर स्कैनर के बाहर एक बाँझ क्षेत्र की स्थापना करें।
  9. उच्च दबाव चतुर्थ टयूबिंग का उपयोग करना, एक लंबी विस्तार लाइन कनेक्ट (लगभग 3-5 मीटर, एमआर बोर के संबंध में जलसेक पंप के स्थान पर निर्भर करता है) एक एमआर संगत 3 एमएल सिरिंज और नमकीन के साथ प्रधानमंत्री के लिए.
  10. वायरस के साथ भरी हुई 0.2 एमएल चतुर्थ ट्यूबिंग के समीपवर्ती अंत करने के लिए लंबी विस्तार लाइन के डिस्टल अंत कनेक्ट करें और एक 1 मिमी कदम रखा टिप के साथ भाटा प्रतिरोधी cannula देते हैं (चित्र 2 डी; कैनुला उत्पादन निर्देशों के लिए अनुभाग 5 देखें) के distal अंत करने के लिए एक क्लैम्प शैली कैथेटर कनेक्टर के साथ इस विधानसभा (सामग्री की तालिकादेखें ) (चित्र 2E) .
  11. अंत में, एक MR-संगत पंप में सिरिंज सेट (सामग्री की तालिकादेखें). स्कैनर नियंत्रण कक्ष में पंप नियंत्रक रखें क्योंकि यह एमआर-संगत नहीं है।
  12. आधार भूतपूर्व शारीरिक एमआर छवियों का उपयोग पहले प्राप्त, cannula इंजेक्शन ग्रिड स्थान और डालने की गहराई लक्ष्य जलसेक साइट तक पहुँचने के लिए आवश्यक का चयन करें. बाँझ टेप का उपयोग कर कैनुला पर सम्मिलन गहराई को चिह्नित करें।
  13. जलसेक को 1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से प्रारंभ करें तथा कैनुला टिप से द्रव के निष्कासन को देखकर जलसेक रेखा में द्रव के प्रवाह को विज़ुअल रूप से मान्य करें।
  14. जलसेक लाइन में प्रवाह को बनाए रखते हुए, इंजेक्शन ग्रिड के माध्यम से मैन्युअल रूप से कैनुला को सम्मिलित करें, क्योंकि यह प्रविष्टि के दौरान कैनुला को बंद करने से प्रवेश ऊतक को रोक देगा।
  15. तेजी से प्राप्त (2 मिनट) फ़्लैश T1 भारित छवियों (फ्लिप कोण $ 30 डिग्री, पुनरावृत्ति समय / इको समय ] 3.05, मैट्रिक्स आकार ] 128 x 128, टुकड़ा मोटाई $ 1 मिमी, 64 स्लाइस) वायरल वेक्टर जलसेक की ऑनलाइन निगरानी के लिए।
  16. सदिश के 10 डिग्री सेल्सियस को इस प्रकार समाविष् ट करने के बाद कि एमआर स्कैनर में पता लगाने के लिए पर्याप्त वायरस का संचार किया जाता है, वायरस के प्रेक्षित प्रसार द्वारा स्पष्ट रूप से सही कैनुला प्लेसमेंट सत्यापित करने के लिए एमआर छवियों को प्राप्त करें। सम्मिलित cannula की गहराई गलत है, तो गहराई तदनुसार समायोजित करें या धीरे-धीरे cannula निकालें और 3.12 में के रूप में सम्मिलन पुन: प्रयास करें।
  17. ऑनलाइन एमआर छवियों के मार्गदर्शन के माध्यम से जलसेक की निगरानी करें (फ्लैश टी 1 भारित) औरजलसेक दर को बढ़ाकर 5 डिग्री सेल्सियस/
  18. वायरल वेक्टर के लगभग 40 डिग्री सेल्सियस को निवेश करने के बाद, जलसेक दर को 1 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम चरणों तक कम करना शुरू करें और $50 डिग्री सेल्सियस के इंजेक्शन के बाद जलसेक को रोक दें और 10 मिनट के लिए कैनुला को छोड़ दें।
  19. धीरे-धीरे मस्तिष्क से cannula को हटाने और अगले स्थान पर ले जाएँ. प्रत्येक स्थान के लिए चरण 3.9 से 3.19 तक दोहराएँ.
  20. पशु परिवहन से पहले, इंजेक्शन के अंत में एक बाँझ कपड़ा के साथ सिलेंडर कवर। फिर जानवर को वापस ऑपरेटिंग रूम में ले जाएं।
  21. या तो एमआर संगत कक्ष explant और हड्डी फ्लैप और overlying मांसपेशियों की जगह और मानक aseptic तकनीक का उपयोग कर त्वचा suturing या एक टाइटेनियम सिलेंडर और कृत्रिम ड्यूरा के साथ कक्ष की जगह द्वारा शल्य चीरा बंद (देखें Yazdan-Shahmorad एट अल 20169) तंत्रिका रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए.

4. एमआर संगत चैंबर उत्पादन

  1. नायलॉन कैनुला इंजेक्शन ग्रिड तैयार करें (चित्र 1क-बी) निर्दिष्ट आयामों के अनुसार मशीनिंग द्वारा (अनुपूरक चित्र 1)।
  2. 3D print MR-संगत सिलेंडर acrylonitrile butadiene styrene (ABS0 प्लास्टिक (चित्र 1C-E) (देखें अनुपूरक फ़ाइल 1-3; 3 डी प्रिंटर और सामग्री के लिए सामग्री की तालिका देखें).
    नोट: एक डिजाइन एमआर-संगत सिलेंडर के भीतर एक निश्चित कैनुला इंजेक्शन ग्रिड को बनाए रखता है (चित्र 1C),जबकि दूसरा ग्रिड के रोटेशन के लिए अनुमति देता है, इंजेक्शन क्षेत्र का विस्तार (चित्र 1D-E)।
  3. कैनुला इंजेक्शन ग्रिड को थ्रेड करें और एमआर-संगत चैम्बर की इसी गुहा को इस तरह टैप करें कि दोनों टुकड़े एक ही थ्रेडिंग का प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: थ्रेडिंग के किसी भी प्रकार का उपयोग किया जा सकता बशर्ते कि दोनों घटकों में समान थ्रेडिंग हो.
  4. MR-संगत सिलेंडर के टेप छेद में पेंच द्वारा नायलॉन cannula इंजेक्शन ग्रिड डालें।

5. reflux प्रतिरोधी Cannula उत्पादन13

  1. आंतरिक सिलिका ट्यूबिंग के लिए 0.32 मिमी आईडी और 0.43 मिमी ओडी के साथ 30 सेमी लंबी सिलिका ट्यूबिंग काटें (सामग्री की तालिकादेखें) एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर।
  2. एक 7.5 सेमी लंबी और एक 5 सेमी लंबी सिलिका ट्यूबिंग के साथ कट 0.45 मिमी आईडी और बाहरी सिलिका ट्यूबिंग के लिए 0.76 मिमी OD (सामग्री की तालिकादेखें).
  3. सायनोक्रिलेट के साथ 30 सेमी आंतरिक ट्यूबिंग के लिए 7.5 सेमी बाहरी ट्यूबिंग का पालन करें ताकि भीतरी ट्यूब बाहरी ट्यूब से 1 मिमी तक फैली हो, जिससे रिफ्लक्स-प्रतिरोधी चरण (चित्र 2D) बनाते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि साइनोऐक्रिलेट आंतरिक ट्यूबिंग के अंदर प्रवेश नहीं करता है, कैनुला टिप से दूर आंतरिक ट्यूबिंग के बाहर साइनोऐक्रिलेट रखें।
  4. दबाना शैली कैथेटर कनेक्टर के लिए लगाव के लिए भीतरी ट्यूबिंग के दूसरे छोर पर 5 सेमी लंबी सिलिका टयूबिंग पेस्ट करें (चरण 3.10 देखें)।

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Representative Results

एमआरआई मार्गदर्शन के तहत Convection बढ़ी हुई वितरण (सीईडी)

ऑनलाइन एमआर छवियों के मार्गदर्शन में सीईडी जलसेक के दौरान वायरल वेक्टर के प्रसार की निगरानी की गई थी (चित्र 3क) । इस अध्ययन में दो बंदरों के S1 और M1 को लक्षित किया गया था (चित्र 3ख) । तीन आयामी वितरण मात्रा MR छवियों के एक पोस्ट-हॉक विश्लेषण में अनुमान लगाया गया था (चित्र 3C) के रूप में Yazdan-Shahmorad एट अल द्वारा वर्णित 20169,प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों के कवरेज की पुष्टि. बंदर जी के लिए M1 अर्क समय की कमी के कारण एमआर मार्गदर्शन के बिना किया गया.

वायरल अभिव्यक्ति का सत्यापन

बड़े cortical optogenetic अभिव्यक्ति epifluorescent इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, और यजदान-शाहमुराद एट अल द्वारावर्णित के रूप में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी. हम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर2,9 की सतह epifluorscence इमेजिंग द्वारा optogenetic अभिव्यक्ति की निगरानी कीऔरकेवल तीन से M1 में cortical सतह और S1 में cortical सतह के साथ अभिव्यक्ति के 130 मिमी2 से अधिक का अनुमान वल्कुट इंजेक्शन9,15. प्रकाश उत्तेजना (488 एनएम, टिप पर 20 mW शक्ति; सामग्री की तालिकादेखें) अर्द्ध पारदर्शी सूक्ष्म electrocorticographic arrays8,9 द्वारा मापा के रूप में व्यक्त क्षेत्रों में विश्वसनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं का परिणाम ,16 (चित्र 4)

एमआर छवियों के विश्लेषण से क्रमशः म1 और बंदर जे के एस 1 में वेक्टर के 233 मिमी3 और 433 मिमी3 तथा बंदर जी9के एस1 में 317 मिमी3 का अनुमान लगाया गया। हमने सीरियल कोरोनल सेक्शनपर हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण किया और एम 1 और एस 1 (चित्र 5C-I)में जलसेक स्थलों के चारों ओर बड़े पैमाने पर ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति का अवलोकन किया, जिसमें लगभग 70-80% कोशिकाओं ने ऑप्सिन व्यक्त किया। ऊतक विज्ञान से अभिरूपित अभिव्यंजना -तत्सम इमेजिंग से अनुमानित व्यंजक वितरण के साथ मेल खाती है (चित्र 5क-डी)। बंदर जी में एमआर स्कैनर के बाहर किए गए दो अर्कों में से एक असफल रहा, इसी क्षेत्र में कोई अभिव्यक्ति नहीं दे रहा था (चित्र 5D) . एमआर इमेजिंग से अनुमानित प्रसार पूरी तरह से एपिफ्लोरेसेंट और वायरल प्रसार के हिस्टोलॉजिकल उपायों दोनों की सीमाओं के भीतर था (चित्र 5ई- जी) . एमआर अनुमान से परे एपिफ्लोरेसेंट इमेजिंग के विस्तार को अभिवहन क्षेत्र से परे वायरल कणों के प्रसार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल अनुमान craniotomy से परे ऑप्टिकल का उपयोग की कमी के कारण एपिफ्लोरेसेंस अनुमान से परे विस्तारित. इन तकनीकों का विवरण हमारे पिछले समाचार पत्र9में शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एमआर संगत सिलेंडर और कैनुला इंजेक्शन ग्रिड| (ए, बी) कस्टम डिजाइन नायलॉन इंजेक्शन ग्रिड। (सी) एमआर-संगत निश्चित सिलेंडर। (डी, ई) एमआर-संगत सिलेंडर घुमाते हुए। (च) निश्चित ग्रिड स्थिति के साथ एमआर संगत जलसेक सिलेंडर। तीर गुहाओं को इंगित करते हैं जो इंजेक्शन की अवधि के लिए मस्तिष्क की सतह को नम रखते हुए गीले बाँझ अवशोषित जिलेटिन से भरे जाने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। (जी) कैनुला ग्रिड में डाला गया। यह आंकड़ा यजदान-शाहमुराद एट अल से संशोधित किया गया है 20169. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: बेसलाइन एमआर इमेजिंग और भाटा प्रतिरोधी कैनुला। (ए) विटामिन ई की T1-भारित छवि जो इंजेक्शन ग्रिड के शीर्ष से जुड़ी हुई थी जो हमें मस्तिष्क की सतह (सफेद तीर) की दूरी को मापने में सक्षम बनाती है। (बी) मस्तिष्क की T2-भारित छवि लवण से भरे कैनुला ग्रिड से इंजेक्शन के स्थान की योजना बनाने में मदद करती है। (ग) जलसेक कक्ष और लवण से भरे कैनुला ग्रिड की एमआर छवि। लंबकोणीय रेखाएँ धनु (पीला) और कोरोनल (पूर्ण) तलों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (घ) भाटा प्रतिरोधी इंजेक्शन कैनुला टिप की फोटो रिफ्लक्स प्रतिरोधी कदम (काला तीर) के साथ। (ई) इन्फ्यूजन लाइनों. यह आंकड़ा यजदान-शाहमुराद एट अल से संशोधित किया गया है 20169. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: जलसेक और अनुमानित वितरण के दौरान एमआर इमेजिंग। (क) S1 में एक इंजेक्शन स्थल के लिए बंदर जी के कोरोनल खंडों में वायरल सदिश के 50 प्र.ल का फैलाव (बी में तीर से दिखाया गया है ) .  (ख) क्रमशः बंदर जी और जे के लिए बेलन के नीचे कॉर्टिकल सतह का एमआरआई सतह प्रतिपादन। S1 जलसेक स्थानों नीले, लाल रंग में M1 स्थानों में दिखाए जाते हैं. (ग) एमआर आयतन सीईडी जलसेक के बाद वायरल वेक्टर के प्रसार का पुनर्निर्माण। मस्तिष्क हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है; S1 और M1 जलसेक मात्रा क्रमशः नीले और लाल रंग में दिखाए जाते हैं। कोई एमआर मात्रा पुनर्निर्माण बंदर जी के लिए M1 अर्क के लिए उपलब्ध है क्योंकि वे एमआर स्कैनर में नहीं किया गया. यह आंकड़ा यजदान-शाहमुराद एट अल से संशोधित किया गया है 20169. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रकाश-उत्तेजित गतिविधि की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग। माइक्रो-इलेक्ट्रोकोर्टिकोग्राफी (जेडईसीओजी) रिकॉर्डिंग स्पंदित ऑप्टिकल उत्तेजना के दौरान हुई। रिकॉर्डिंग निशान M1 (लाल) और S1 (हरा) उत्तेजना स्थानों के उदाहरण के लिए उत्तेजना की साइट के लिए निकटतम इलेक्ट्रोड से थे. निशान के आस-पास छायाक्षेत्र 25 परीक्षणों में मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। निशान पर नीले वर्गों उत्तेजना के समय (1 एमएस) दिखाते हैं. उत्तेजना और रिकॉर्डिंग साइटों के दोनों नमूना जोड़े के लिए उत्तेजना ट्रिगर waveforms का पूरा सेट के रूप में पैनल के बाईं ओर दिखाया मतलब तरंग पर आरोपित कर रहे हैं. यह आंकड़ा यजदान-शाहमुराद एट अल से संशोधित किया गया है 20169. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण| (ए) बंदर जी (बी) में बेसलाइन कोरोनल एमआर छवि , एक ही एमआर कोरोनल स्लाइस के लिए जलसेक के बाद विपरीत एजेंट का प्रसार ए (सी) ए और बी में लगभग एक ही साइट से एक कोरोनल ऊतक अनुभाग ; peroxidase धुंधला EYFP-रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को दर्शाता है. (घ) EYFP अभिव्यक्ति के क्षेत्र के बीच अच्छा संरेखण सतह epiflourscence (अंधेरे हरे क्षेत्रों) के साथ और हिस्टोलॉजिकल धुंधला (प्रकाश हरी लाइनों) के साथ मापा जाता है मनाया जाता है। इनमें एमआर छवियों (सफेद रेखा) से अनुमानित वेक्टर प्रसार का क्षेत्र शामिल है; सफेद डॉट्स इंजेक्शन साइटों से संकेत मिलता है, और पूरे काले क्षेत्र craniotomy द्वारा उजागर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. दो छोड़ दिया सबसे इंजेक्शन साइटों M1 में स्थित हैं, और दो सही सबसे साइटों S1 में स्थित हैं. (ई) बंदर जम्मू (क्षेत्र 1, 2, 3) के सोमेटोसेंसरी प्रांतस्था में YFP अभिव्यक्ति के मध्य-पक्षीय पहलू को दिखाने वाले एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ दाग वाले कोरोनल अनुभाग की कम आवर्धन छवि। काला ऐरोहेड कैनुला ट्रैक का स्थान इंगित करता है; आसन्न ऊतक (काला फ्रेम) एफमें दिखाया गया है, अधिक आवर्धन पर YFP सकारात्मक कोशिकाओं के पटलीय वितरण को दिखाने के लिए. (च) वाईएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के घनी आबादी वाले क्षेत्र मुख्य रूप से परतों में स्थित हैं II-III और V-VI, और यह भी विशिष्ट पिरामिडी आकृति विज्ञान दिखाते हैं (सफेद फ्रेम में कोशिकाओं को पैनलों (जी-I) में और अधिक बढ़ा दिया जाता है । नीचे पैनलों पर सफेद arrowheads जी -I परतों मेंविशिष्ट पिरामिड कोशिकाओं को इंगित द्वितीय-III (जी); परत V (H); और परत VI (मैं) स्केल बार्स - 2 मिमी (ई);  200 डिग्री (एफ); 100 डिग्री (जी-I)। यह आंकड़ा यजदान-शाहमुराद एट अल 20169 और यजदान-शाहमुराद एटअल से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: थ्रेडिंग से पहले कैनुला इंजेक्शन ग्रिड। इंजेक्शन ग्रिड की लंबाई और व्यास क्रमशः 15.00 मिमी और 12.00 मिमी हैं। इंजेक्शन ग्रिड पैटर्न ग्रिड के केंद्र के आसपास तीन गाढ़ा हलकों (व्यास: 1.6, 3.2 और 4.8 मिमी) बनाने 0.8 मिमी व्यास छेद के होते हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइलें. कृपया इन फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.  

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Discussion

यहाँ, हम MR निर्देशित सीईडी द्वारा एनएचपी प्राथमिक somatosensory और मोटर प्रांतस्था में बड़े पैमाने पर optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक व्यावहारिक और कुशल तकनीक रूपरेखा. MR निर्देशित सीईडी का उपयोग एनएचपी मस्तिष्क में वायरल जलसेक के पारंपरिक तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है। ऐसा ही एक लाभ कम आवश्यक अर्क के साथ बड़े क्षेत्रों पर अभिव्यक्ति प्राप्त करने की क्षमता है. उदाहरण के लिए, पारंपरिक विधियों के साथ, 2-3 मिमी व्यास क्षेत्र1,2,5,17में वेक्टर उपज अभिव्यक्ति के 1-2 डिग्री सेल्सियस के कई इंजेक्शन । जबकि बड़े पैमाने पर वेक्टर प्रसार को प्राप्त करने मेंपिछले प्रयासों से कई इंजेक्शन 18 के साथ लगभग 10 मिमी3 की अभिव्यक्ति की मात्रा प्राप्त हुई है, यहां हम केवल कुछ जलसेक के साथ 200 मिमी3 पर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं .  सीईडी द्वारा 50 डिग्री सेल्सियस का एकल जलसेक को कॉर्टिकल सीईडी9 के लिए इंजेक्शन स्थल से 10 मिमी तक फैलने वाले वेक्टर को प्राप्त किया जा सकता है और थैलेमिक सीईडी14के साथ ललाट कॉर्टिकल क्षेत्रों का पूर्ण कवरेज किया जा सकता है .

इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि सीईडी का उपयोग करने से इंजेक्शन एजेंट12,19,20,21,22, एक समान अभिव्यक्ति के स्तर के लिए अग्रणी के अधिक सजातीय वितरण प्राप्त कर सकते हैं वायरल वेक्टर जलसेक की साइट के आसपास, पारंपरिक माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में। सीईडी को नियोजित करने के हमारे प्रयोगों में हमने समान रूप से उच्च व्यतिकाक्षियों को देखा जिसमें लगभग 70-80% न्यूरॉन्स ने ओप्सिन8,9 ( चित्र5) व्यक्त किया। इसके विपरीत, पारंपरिक प्रसार आधारित इंजेक्शन कमजोर अभिव्यक्ति के स्तर 4 ,5,17से घिरा इंजेक्शन साइटों के पास केंद्रित उच्च अभिव्यक्ति के क्षेत्रों को दर्शाती है। कई इंजेक्शन के लिए कम की जरूरत CED जलसेक बड़े पैमाने पर प्राप्त करने का एक समय कुशल विधि renders, वर्दी optogenetic अभिव्यक्ति. इंजेक्शन और तेजी से जलसेक दरों की छोटी संख्या के कारण, हम योजना और एमआरआई के मार्गदर्शन के तहत वायरल वेक्टर infuse करने में सक्षम थे. ऑनलाइन एमआर छवियों का उपयोग अर्क का सटीक लक्ष्यीकरण और जलसेक के दौरान वायरल वेक्टर के प्रसार की निगरानी में सक्षम बनाता है। हालांकि, अगर सम्मिलित cannula की प्रारंभिक गहराई गलत है, यह प्रारंभिक संचार का एक परिणाम के रूप में अवांछित स्थानों में अभिव्यक्ति उपज हो सकता है $10 $L नेत्रहीन MR के माध्यम से जलसेक का पता लगाने के लिए आवश्यक वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक neurosurgical नेविगेशन सिस्टम परिनुष मार्कर का उपयोग भी एमआर मार्गदर्शन के स्थान पर नियोजित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ऑनलाइन इमेजिंग की लागत सम्मिलन से पहले कैनुला पर प्रविष्टि की वांछित गहराई को चिह्नित करने और नेत्रहीन जलसेक लाइन के माध्यम से पूरा जलसेक की पुष्टि करके दरकिनार किया जा सकता है, हालांकि cannula प्लेसमेंट की सटीकता होगी कम. तथापि, जैसा कि बंदर जी (चित्र 5D)के M1 में असफल इंजेक्शन द्वारा देखा गया है, एमआर मार्गदर्शन सफल जलसेक सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

पिछले अध्ययनों से दोनों गैर वायरल और वायरल कणों के सीईडी जलसेक की सुरक्षा का प्रदर्शन किया है कैनुला पथ के बाहर कोई मनाया ऊतक क्षति और कोई व्यवहार घाटे9,11,12,13 ,14,15,20. यहाँ और हमारे पिछले प्रकाशनों में9,14 हम optogenetic वायरल वैक्टर के सीईडी जलसेक के बाद इसी तरह के परिणामों की रिपोर्ट. जलसेक के बाद कोई मनाया व्यवहार घाटे के अलावा, NeuN और Nissl9,14,15 धुंधला पता चला न्यूरॉन सेल मौत और ग्लियोसिस केवल cannula पथ तक ही सीमित था, के रूप में सूचित किया गया है प्रसार आधारित तरीकों के साथ5| cannula ट्रैक से नुकसान को कम करने के लिए, हम संभावित cannula के व्यास को कम कर सकते हैं. तथापि, अभिव्यक्ति के बड़े क्षेत्रों को प्राप्त करने पर कैनुला आकार में कमी के प्रभाव का आकलन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, क्योंकि उच्च जलसेकदर भी ऊतक क्षति 13 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह पर या नीचे एक जलसेक दर बनाए रखने के लिए सिफारिश की है 5 $L/ CED तकनीक के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए कृपया हमारे पिछले प्रकाशन9देखें.

प्राइमेट कॉर्टेक्स में लक्षित ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति के व्यापक क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए एमआर निर्देशित सीईडी का उपयोग बड़े पैमाने पर सर्किट गतिशीलता, तंत्रिका प्लास्टिक, और नेटवर्क कनेक्टिविटी की आगे जांच करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

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Disclosures

पीएनएस Neuralink कॉर्प, एक कंपनी है कि मस्तिष्क उत्तेजना का उपयोग कर नैदानिक उपचार विकसित कर रहा है में वित्तीय रुचि है.

Acknowledgments

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप (AY), रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाओं एजेंसी (DARPA) पुनर्गठन और प्लास्टिक द्वारा समर्थित किया गया था चोट वसूली में तेजी लाने के लिए (REPAIR; N66001-10-सी-2010), R01. NS073940, और UCSF तंत्रिका विज्ञान इमेजिंग सेंटर द्वारा. यह काम भी यूनिस कैनेडी शिवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के पुरस्कार संख्या K12HD073945, वाशिंगटन राष्ट्रीय प्राइमेट अनुसंधान केंद्र (WaNPCR, P51 OD010425) के तहत, और न्यूरोटेक्नोलॉजी के लिए केंद्र (CNT, अनुदान EEC-1028725) के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इंजीनियरिंग अनुसंधान केंद्र. हम Camilo Diaz-Botia, टिम Hanson, विक्टर Kharazia, डैनियल Silvermith, करेन जे MacLeod, Juliana मिलानी, और ब्लेकली एंड्रयूज प्रयोगों और नान Tian, Jiwei वह, पीटर Ledochowitsch, मिशेल Mahrbiz, और टोनी Haun तकनीकी मदद के लिए उनकी मदद के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL High Pressure IV Tubing Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA 533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing Polymicro Technologies 1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing Polymicro Technologies 1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP Penn Vector Core, University of Pennsylvania
ABS plastic Stratasys, MN, USA ABSplus-P430
Antimicrobial incise drape 3M 6650EZ Ioban Drape
Dental Acrylic Henry Schein, Inc. 1013117 Acrylic Bonding Agent
Elevators VWR International, LLC. 10196-564 Langenbeck Elevator, Wide Tip
Fine suture McKesson Medical-Surgical Inc. 1034505
Gadoteridol Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ 0270-1111-04
Laser for light stimulation Omicron-Laserage, Germany PhoxX 488-60
MR compatible 3 cc syringe Harvard apparatus, Holliston, MA, USA 59-8377
MR Imaging Software Pixmeo OsiriX MD 10.0
MR-Compatible Pump Harvard apparatus, Holliston, MA, USA Harvard PHD 2000
MR-compatible stereotaxic frame KOPF 1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter Connector B-Braun, Bethlehem, PA, USA N/A
Plastic Screws Plastics 1 0-80 x 1/8N Nylon screws
Titanium screws Crist Instrument Co., Inc. 6-YCX-0312 Self-tapping bone screws
Trephine GerMedUSA Inc, SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D printer Stratasys, MN, USA N/A
Vitamin E Capsule Pure Encapsulations, LLC. DE1
Wet sterile absorbable gelatin Pfizer Inc. AZL0009034201 Gelfoam

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 147 ऑप्टोजेनेटिक्स गैर-मानव प्राइमेट रीसस मकाक वायरल वेक्टर डिलीवरी ओपिनियन अभिव्यक्ति प्राथमिक मोटर प्रांतस्था प्राथमिक सोमेटोसेंसरी कॉर्टेक्स
ऑनलाइन एमआरआई छवियों के मार्गदर्शन के तहत Rhesus Macakue के कोर्टेक्स के लिए Optogenetic Adeno-संबद्ध वायरल वेक्टर की Convection बढ़ी डिलीवरी
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Khateeb, K., Griggs, D. J., Sabes,… More

Khateeb, K., Griggs, D. J., Sabes, P. N., Yazdan-Shahmorad, A. Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images. J. Vis. Exp. (147), e59232, doi:10.3791/59232 (2019).

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