Summary
Her viser vi magnetisk resonans (MR)-guidet konveksjon forbedret levering (CED) av viral vektorer i cortex som en effektiv og forenklet tilnærming for å oppnå optogenetic uttrykk på tvers av store kortikale områder i macaque hjernen.
Abstract
I ikke-menneskelige primater (NHP) optogenetics, infiserer store kortikale områder med viral vektorer er ofte en vanskelig og tidkrevende oppgave. Her viser vi bruken av magnetisk resonans (MR)-guidet konveksjon forbedret levering (CED) av optogenetic viral vektorer i primær somatosensory (S1) og motor (M1) Barken av aper å få effektiv, utbredt kortikale uttrykk for lysfølsomme ion-kanaler. Adeno-Associated viral (AAV) vektorer koding av rød-forskjøvet opsin C1V1 smeltet til gult fluorescerende protein (EYFP) ble injisert i cortex på rhesus aper under MR-guidet CED. Tre måneders etter infusjon bekreftet epifluorescent Imaging store områder av optogenetic uttrykk (> 130 mm2) i M1 og S1 i to aper. Videre var vi i stand til å spille inn pålitelige lys-fremkalt elektrofysiologi svar fra uttrykker områder ved hjelp av mikro-electrocorticographic arrays. Senere histologiske analyse og immunostaining mot reporteren avdekket utbredt og tett optogenetic uttrykk i M1 og S1 tilsvarende fordelingen indikert av epifluorescent Imaging. Denne teknikken gjør det mulig for oss å få uttrykk på tvers av store områder av cortex i løpet av en kortere periode med minimal skade i forhold til de tradisjonelle teknikkene og kan være en optimal tilnærming for optogenetic viral levering i store dyr som NHPs. Denne tilnærmingen demonstrerer stort potensial for nettverk-nivå manipulering av nevrale kretser med celle-type spesifisitet i dyremodeller evolutionarily nær mennesker.
Introduction
Optogenetics er et kraftig verktøy som gjør det mulig for manipulering av nevrale aktivitet og studiet av nettverkstilkoblinger i hjernen. Implementering av denne teknikken i ikke-menneskelige primater (NHPs) har potensial til å forbedre vår forståelse av storstilt nevrale beregning, kognisjon, og atferd i primater hjernen. Selv om optogenetics har blitt implementert i NHPs de siste årene1,2,3,4,5,6,7, en utfordring som Forskerne står overfor er å oppnå høye nivåer av uttrykk på tvers av store hjerneområder i disse dyrene. Her gir vi en effektiv og forenklet tilnærming for å oppnå høye nivåer av optogenetic uttrykk på tvers av store områder av cortex i aper. Denne teknikken har stort potensial for å forbedre dagens optogenetic studier i disse dyrene i kombinasjon med State-of-the-art innspillingen8,9 og optisk stimulering10 Technologies.
Konveksjon forbedret levering (CED) er en etablert metode for levering av farmakologiske midler og andre store molekyler, inkludert viral vektorer, til sentrale nervesystemet11,12,13. Mens konvensjonelle leveringsmetoder involverer flere infusjoner med lavt volum fordelt på små områder i hjernen, kan CED oppnå bredere og jevnere agent fordeling med færre infusjoner. Trykk drevet bulkvæske strømning (konveksjon) under infusjon gjør det mulig for mer utbredt og jevnt fordelt Transduction av målet vev når levere viral vektorer med CED. I nyere studier, demonstrerte vi Transduction og påfølgende optogenetic uttrykk for store områder av primær motor (M1) og somatosensory (S1) barken9 og thalamus14 ved hjelp av magnetisk resonans (Mr)-guidet CED.
Her skisserer vi bruken av CED for å oppnå optogenetic uttrykk på tvers av store kortikale områder med bare noen få kortikale injeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av University of California, San Francisco institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) og er i samsvar med guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr. Følgende prosedyre ble utført med to voksne mannlige rhesus aper på 8 og 7 år, som veier 17,5 kg og 16,5 kg (ape G og ape J), henholdsvis.
Merk: Bruk standard aseptisk teknikk for alle kirurgiske prosedyrer.
1. Baseline Imaging
- Sedate og intubere dyret og opprettholde generell anestesi under isoflurane (konsentrasjon endret mellom 0 til 5% etter behov, avhengig av vitale tegn som respirasjonsfrekvens og hjertefrekvens). Overvåk dyrets temperatur, hjertefrekvens, oksygenmetning, electrocardiographic responser og slutt tidevanns delvis Trykk på CO2 gjennom hele prosedyren.
- Plasser dyret i en MR-kompatibel stereotaxic ramme (se tabell over materialer) der det vil forbli gjennom hele prosedyren. Koble dyret til en bærbar MR-kompatibel isoflurane maskin og transporter det til MRI-skanneren (3 T).
- Erverve standard T1 (flip Angle = 9 °, repetisjon tid/ekko tid = 668,6, Matrix size = 192 x 192 x 80, Slice tykkelse = 1 mm) og T2 (flip Angle = 130 °, repetisjon tid/ekko tid = 52,5, Matrix size = 256 x 256 x 45, Slice tykkelse = 1 mm) anatomiske MR bilder som Baseline referanse og for kirurgisk planlegging.
- Gjenopprette dyret fra anestesi og transportere den til dyret boligområdet.
- Bruk de kjøpte T1-og T2-bildene til å bestemme plasseringen av kraniotomi. Plasseringen av kraniotomi kan presist bestemmes ved å matche kortikale området av interesse fra MR med macaque hjernen Atlas (Paxinos, Huang, Petride, toga 2nd utgave). I tillegg kan disse Baseline bildene gir et anslag for plasseringen av viral infusjon. Den kortikale regioner av interesse demonstrert her er M1 og S1.
2. MR-kompatibelt kammer implantation
- Sedate og intubere dyret og opprettholde generell anestesi med standard bedøvelse overvåking som i 1,1.
- Plasser dyret i MR-kompatible stereotaxic ramme der det vil forbli i hele kammeret implantation og viral vektor levering. Koble dyret til en bærbar MR-kompatibel isoflurane maskin.
- Lag en sagittal snitt ca 2 cm fra midtlinjen med en lengde på ca 5 cm med en skalpell.
- Fjern det underliggende bløtvevet fra hodeskallen ved hjelp av heiser (se tabell over materialer).
- Lag en sirkulær kraniotomi (2,5 cm diameter) for å dekke den forhåndsplanlagte baner for injeksjoner ved hjelp av en trephine (se tabell over materialer).
- Senk sentrering punktet av trephine forbi kanten av trephine. Lag et innrykk i sentrum av den planlagte kraniotomi tilstrekkelig dypt i skallen for å forankre trephine ved hjelp av den justerbare sentrering punktet av trephine. Vær forsiktig for å unngå helt trenge gjennom dybden av skallen da dette kan forårsake skade på underliggende nevrale vev.
- Med jevne mellomrom skylle området med saltvann etter behov for å opprettholde vev fuktighet gjennom hele kraniotomi.
- Når senteret er gjort, Senk trephine på skallen og roter trephine med klokken og mot klokken mens du påfører press til bein lokket kan fjernes med tang. Vær forsiktig slik at du unngår å skade det underliggende vevet med trephine.
- Thread en fin Sutur (størrelse 6-0) gjennom Dura i sentrum av kraniotomi og løft Dura ved å forsiktig trekke Sutur fra overflaten av hjernen å skape et telt i midten av kraniotomi.
- Deretter punktering av Dura nær midten av teltet ved hjelp av fine øyen-saks for å unngå å skade hjernen. Deretter kuttet Dura fra sentrum til kanten av kraniotomi og fortsette langs kanten med fine ophthalmic saks.
- Monter den sylindriske skreddersydde CED MR-kompatible kammeret (figur 1; se pkt. 4 for produksjonsinstruksjoner) til skallen på toppen av kraniotomi for å gi kanyle støtte under CED-infusjon slik at kurven til kammer flens justeres godt med krumning av skallen.
- Fest implantater til skallen ved hjelp av enten plast skruer og Dental akryl eller noen få Titan skruer.
3. viral Vector levering
- Kort tid etter implanting MR-kompatibelt kammer og innsetting av kanyle injeksjon rutenett (figur 1a-B, supplerende figur 1) inn i kammeret, fylle rutenettet med saltvann (0,9% NaCl) for å visualisere injeksjon steder via Mr anatomiske bilder og fylle kammeret hulrom med våt steril absorberbare gelatin for å opprettholde fuktigheten i hjernen (figur 1F).
- Dekk huden og sylinderen med en steril antimikrobielle incise gardin for å opprettholde sterilitet av sylindere under transport og MR infusjoner. Plasser en vitamin E kapsel for å markere toppen av injeksjons nettet for positiv identifisering.
- Mens dyret forblir intubert, løsne endotrakeal røret fra anestesi kretsen og fest den til en bærbar MR-kompatibel isoflurane maskin og transportere dyret til MRI-skanneren.
- Anskaffe T1-bilder (flip-vinkel = 9 °, repetisjons tid/ekko tid = 668,6, matrise størrelse = 192 x 192, skive tykkelse = 1 mm, 80 skiver) for å beregne avstanden fra toppen av injeksjon rutenettet og kortikale overflaten. Vitamin E kapselen er godt synlig i T1 bilder og bør brukes som en markør for toppen av injeksjon rutenettet (figur 2a). Bruk linjalverktøyet for MR Imaging-programvaren til å måle avstanden mellom toppen av injeksjons nettet og den kortikale overflaten.
- Skaff deg T2 bilder (flip Angle = 130 °, repetisjon tid/ekko tid = 52,5, Matrix size = 256 x 256, skive tykkelse = 1 mm, 45 skiver) for å bestemme den optimale kanyle guider for hvert nettsted basert på målrettede området av infusjon (figur 2b-C). Som nevnt tidligere, er kanyle rutenettet fylt med saltvann som er best synlig i T2 bilder. Ved hjelp av MR Imaging programvare, bla gjennom koronale og sagittal fly for å finne målet plassering av infusjon.
- Etter tine den viral vektor for et par timer ved romtemperatur, bland den virale vektoren med MR kontrast agent gadoteridol (ratio på 250:1; 2mM gd-DTPA, se tabell over materialer) ved pipette eller Vortex miksing.
Merk: Den presenterte teknikken ble testet for AAV vektorer med en CamKIIa promoter kjøring uttrykk for C1V1 smeltet til EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2,5 x 1012 virus molekyler/ml; se tabell over materialer). - Legg det blandede viruset i en 0,2 mL høytrykks IV-slange (se tabell over materialer).
- Etabler et sterilt felt utenfor MR-skanneren for tilberedning av viral infusjonslinje.
- Ved hjelp av høytrykks IV slange, koble en lang forlengelsesledning (ca 3-5 meter, avhengig av plasseringen av infusjon pumpen med hensyn til MR bore) til en MR-kompatibel 3 mL sprøyte og Prime med saltvann.
- Koble den andre enden av den lange forlengelseslinjen til den proksimale enden av 0,2 mL IV-slangen som er lastet med viruset, og fest det reflux-resistente kanyle med en 1 mm spiss tupp (figur 2D; se avsnitt 5 for kanyle produksjonsinstruksjoner) til den Denne forsamlingen med en klemme stil kateter kontakt (se tabell over materialer) (figur 2e).
- Til slutt setter du sprøyten i en MR-kompatibel pumpe (se tabell over materialer). Plasser pumpe kontrolleren i skanner kontrollrommet, siden den ikke er MR-kompatibel.
- Ved hjelp av grunnlinjen anatomiske MR bilder innhentet før, velger du kanyle injeksjon Rutenettplassering og innsetting dybden som trengs for å nå målet infusjonsstedet. Merk innsettings dybden på kanyle ved hjelp av steril tape.
- Start infusjonen med en hastighet på 1 μL/min og kontroller visuelt flyten av væsken i infusjons linjen ved å observere væske utstøting fra kanyle spissen.
- Sett inn kanyle manuelt gjennom injeksjons nettet til mål dybden og samtidig opprettholde flyten i infusjons linjen, da dette vil hindre at trengt vev tetter kanyle under innsetting.
- Tilegne seg rask (2 minutter) Flash T1 vektet bilder (flip vinkel = 30 °, repetisjon tid/ekko tid = 3,05, Matrix size = 128 x 128, skive tykkelse = 1 mm, 64 skiver) for online overvåking av viral vektor infusjon.
- Etter infusjonen ~ 10 μL av vektoren slik at nok virus er tilført å oppdage i MR scanner, få MR bilder for å verifisere korrekt kanyle plassering som tydelig av den observerte spredningen av viruset. Hvis dybden på den innsatte kanyle er feil, justerer du dybden tilsvarende eller sakte fjerner kanyle og prøver innsettingen på nytt som i 3,12.
- Monitor infusjonen via veiledning av online MR-bilder (Flash T1 vektet) og øke infusjonshastigheten til 5 μL/min med 1 μL/min trinn hvert femte minutt (figur 3a).
- Etter infusjonen ca. 40 μL av viral vektoren, begynne å redusere infusjonshastigheten med 1 μL/min trinn og stoppe infusjonen etter ~ 50 μL injiseres og la kanyle på plass i 10 minutter.
- Sakte fjerne kanyle fra hjernen og flytte til neste sted. Gjenta trinn 3,9 til 3,19 for hver lokasjon.
- Dekk sylinderen med en steril gardin på slutten av injeksjoner, før dyr transport. Deretter transportere dyret tilbake til operasjonsstuen.
- Enten explant MR-kompatible kammer og lukke kirurgisk snitt ved å erstatte bein klaff og overliggende muskel og suturing huden ved hjelp av standard aseptisk teknikker eller erstatte kammeret med en Titan sylinder og kunstig Dura (se Yazdan-Shahmorad et al. 20169) for nevrale opptak og stimulering.
4. MR-kompatibel kammer produksjon
- Dikte opp den nylon kanyle injeksjon rutenett (figur 1a-B) ved maskinering i henhold til de angitte dimensjonene (supplerende figur 1).
- 3D skrive ut MR-kompatibel sylinder ut av akrylnitril butadien styren (ABS0 plast (figur 1C-E) (se tilleggsfil 1 – 3; se tabell over materialer for 3D-skriver og-materialer).
Merk: En design opprettholder en fast kanyle injeksjon rutenett innenfor MR-kompatibel sylinder (figur 1C), mens en annen gir mulighet for rotasjon av rutenettet, utvide injeksjonsområdet (figur 1d-E). - Tråd kanyle injeksjon rutenettet og trykk på tilsvarende hulrom i MR-kompatible kammer slik at begge brikkene viser de samme Threading.
Merk: Alle typer tråder kan brukes, forutsatt at begge komponentene har samme Threading. - Sett i nylon kanyle injeksjon rutenett ved å skru inn det tappet hullet av MR-kompatibel sylinder.
5. reflux-motstandsdyktig kanyle produksjon13
- Skjær en 30 cm lang silica slange med 0,32 mm ID og 0,43 mm OD for den indre silica slange (se tabell over materialer) ved hjelp av et barberblad.
- Skjær en 7,5 cm lang og en 5 cm lang silica slange med 0,45 mm ID og 0,76 mm OD for den ytre silika slangen (se tabell over materialer).
- Hold den 7,5 cm ytre slangen til 30 cm indre rør med Cyanoacrylate slik at det indre røret strekker seg 1 mm utover den ytre rør, noe som gjør reflux-resistente trinn (figur 2D). For å sikre at Cyanoacrylate ikke kommer inn i innsiden av den indre slangen, plasser Cyanoacrylate på utsiden av den indre slangen langt fra kanyle spissen.
- Lim inn 5 cm lange silica slange til den andre enden av den indre slangen for festing til klemme stil kateter kontakten (se trinn 3,10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konveksjon forbedret levering (CED) under Mr-veiledning
Spredningen av viral vektoren ble overvåket under CED infusjon under veiledning av online MR bilder (figur 3a). I denne studien var S1 og M1 av to aper målrettet (figur 3b). De tre-dimensjonale distribusjons volumene ble anslått i en post-hoc-analyse av MR-bildene (figur 3c) som beskrevet av Yazdan-Shahmorad et al. 20169, som bekrefter dekning av store områder av cortex. M1 infusjoner for Monkey G ble gjort uten MR veiledning på grunn av tidspress.
Validering av viral Expression
Store kortikale optogenetic uttrykk ble bekreftet av epifluorescent avbildning, elektrofysiologisk innspillinger og histologiske analyser som beskrevet av Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vi overvåket optogenetic uttrykk ved overflaten epifluorescence Imaging av fluorescerende reporter2,9 og anslått mer enn 130 mm2 av uttrykket langs kortikale overflaten i M1 og S1 av to aper fra bare tre kortikale injeksjoner9,15. Lys stimulering (488 NM, 20 MW strøm på spissen; se tabell over materialer) gitt pålitelig elektrofysiologisk svar i uttrykker områder målt ved halvt gjennomsiktige mikro-electrocorticographic arrays8,9 ,16 (Figur 4).
Analyse av MR bilder gitt anslagsvis 233 mm3 og 433 mm3 av Vector spredt i M1 og S1 av Monkey J, henholdsvis, og 317 mm3 i S1 av Monkey G9. Vi utførte histologiske analyser på serielle koronale seksjoner og observerte stor skala optogenetic uttrykk rundt infusjons stedene i M1 og S1 (figur 5c-I), med anslagsvis 70-80% av cellene som uttrykker opsin. Uttrykket observert fra histologi på linje med den anslåtte uttrykks fordelingen fra epifluorescent avbildning (figur 5a-D). En av de to infusjoner utført utenfor MR skanneren i Monkey G var mislykket, gir ingen uttrykk i den tilsvarende regionen (figur 5D). Spredningen anslått fra MR Imaging var helt innenfor grensene for både epifluorescent og histologiske tiltak for viral spredning (figur 5e-G). Utvidelsen av epifluorescent Imaging utover MR anslaget kan tilskrives spredningen av viral partikler utover reservoarmekanikk regionen. Videre histologiske anslaget utvidet utover epifluorescence anslaget på grunn av mangel på optisk tilgang utover kraniotomi. Detaljene i disse teknikkene er inkludert i vår forrige papir9.
Figur 1: Mr-kompatibel sylinder og kanyle injeksjon rutenett. (A, B) spesialdesignet nylon injeksjon rutenettet. (C) Mr-kompatibel fast sylinder. (D, E) Roterende MR-kompatibel sylinder. (F) Mr-kompatibel infusjons sylinder med fast gitter posisjon. Pilene peker på hulrom som er designet for å være fylt med våt steril absorberbare gelatin holde overflaten av hjernen fuktig for varigheten av injeksjon. (G) kanyle satt inn i rutenettet. Dette tallet er blitt modifisert fra Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: BASELINE Mr Imaging og reflux motstandsdyktig kanyle. (A) T1-vektet bilde av vitamin E som var festet til toppen av injeksjon rutenettet som gjør det mulig for oss å måle avstanden til overflaten av hjernen (hvit pil). (B) T2-vektet bilde av hjernen bidrar til å planlegge plasseringen av injeksjon fra kanyle rutenettet fylt med saltvann. (C) Mr bilde av infusjons kammeret og saltvanns fylte kanyle gitter. De ortogonale linjene representerer sagittal (gult) og koronale (lilla) plan. (D) bilde av reflux motstandsdyktig injeksjon kanyle spissen med reflux motstandsdyktig trinn (svart pil). (E) infusjons linjer. Dette tallet er blitt modifisert fra Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mr Imaging under infusjon og anslått fordeling. (A) spredning av 50 μL av viral vektor i koronale seksjoner av ape G for ett injeksjonssted i S1 (vist med en pil i B). (B) MRI overflate gjengivelse av kortikale overflaten under sylinderen for aper G og J, henholdsvis. Infusjons stedene S1 vises i blått, M1 steder i rødt. (C) Mr Volume rekonstruksjon av spredningen av viral VEKTOR etter CED infusjon. Brain er vist i lys grå; Infusjons volumene S1 og M1 vises henholdsvis i blått og rødt. Ingen MR volum rekonstruksjon er tilgjengelig for M1 infusjoner for Monkey G siden de ikke ble gjort i MR skanneren. Dette tallet er blitt modifisert fra Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Elektrofysiologisk innspillinger av lys-fremkalt aktivitet. Mikro-electrocorticography (μECoG) innspillinger skjedde under pulserende optisk stimulering. Innspillingen spor var fra den nærmeste elektroden til stedet for stimulering for eksempler på M1 (rød) og S1 (grønn) stimulering steder. Skyggelagte områder rundt sporene representerer standard feil på tvers av 25 forsøk. De blå rutene på sporene viser tidspunktet for stimulering (1 MS). Det fullstendige settet med stimulans-utløst bølgeformer for både prøve par av stimulering og opptaks steder er lagt på gjennomsnittet bølgeform som vist på venstre side av panelet. Dette tallet er blitt modifisert fra Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Histologiske analyse. (A) BASELINE koronale Mr bilde i Monkey G. (B) spredning av kontrast agent etter infusjon for samme Mr koronale skive som i a. (C) en koronale vev delen fra omtrent samme sted som i a og B; peroksidase farging reflekterer uttrykk for EYFP-reporter. (D) god justering er observert mellom AREALET av EYFP uttrykk målt med overflate epiflourescence (mørke grønne områder) og med histologiske farging (lys grønne linjer). Disse inkluderer regionen av vektoren spredt anslått fra MR bilder (hvit linje); hvite prikker indikerer injeksjonssteder, og hele den svarte regionen representerer området eksponert av kraniotomi. De to venstre de fleste injeksjonssteder er plassert i M1, og de to riktige stedene er plassert i S1. (E) lav forstørrelse bilde av koronale delen beiset med anti-GFP antistoff som viser medio-lateral ASPEKT av YFP uttrykk i somatosensory cortex av ape J (områder 1, 2, 3). Den svarte pilspissen angir plasseringen av det kanyle sporet. det tilstøtende vevet (svart ramme) vises i F, ved større forstørrelse for å vise laminær fordeling av YFP-positive celler. (F) tett befolkede områder av YFP-positive celler er lokalisert hovedsakelig i lag II-III og V-vi, og viser også typisk pyramideformet morfologi (celler i hvite rammer er ytterligere forstørret i paneler (G-I). Hvite pilspisser på nederste paneler G-I peker til typiske pyramideformet celler i lag II-III (G); Lag V (H); og lag VI (I). Vektstenger = 2 mm (E); 200 μm (F); 100 μm (G-I). Dette tallet er blitt modifisert fra Yazdan-Shahmorad et al. 20169 og Yazdan-Shahmorad et al. 201815. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: den kanyle injeksjon rutenettet før Threading. Lengden og diameteren på injeksjons nettet er henholdsvis 15,00 mm og 12,00 mm. Injeksjons rutenettet mønsteret består av 0,8 mm diameter hull som danner tre konsentriske sirkler (diameter: 1,6, 3,2 og 4,8 mm) rundt midten av rutenettet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her skisserer vi en gjennomførbar og effektiv teknikk for å oppnå stor skala optogenetic uttrykk i NHP primære somatosensory og motor cortex av MR-guidet CED. Bruken av MR-guidede CED presenterer betydelige fordeler fremfor tradisjonelle metoder for viral infusjon i NHP hjernen. En slik fordel er evnen til å oppnå uttrykk over store områder med færre nødvendige infusjoner. For eksempel, med konvensjonelle metoder, flere injeksjoner av 1-2 μL av vektoren yield uttrykk i en 2-3 mm diameter region1,2,5,17. Mens tidligere forsøk på å oppnå stor skala vektor spredning har gitt uttrykk volumer på ca 10 mm3 med flere injeksjoner18, her presenterer vi en metode for å oppnå uttrykk over 200 mm3 med bare noen få infusjoner . En enkelt infusjon av 50 μL av CED kan oppnå vektor spredt opp til 10 mm fra injeksjonsstedet for kortikale CED9 og full dekning av frontal kortikale områder med thalamic CED14.
Videre har det vist seg at bruk av CED kan oppnå mer homogen distribusjon av injisert agent12,19,20,21,22, som fører til ensartede uttrykks nivåer rundt stedet av viral vektor infusjon, sammenlignet med tradisjonelle microinjections. I våre eksperimenter som sysselsetter CED, observerte vi jevnt høye uttrykks nivåer med omtrent 70-80% av nevroner som uttrykker opsin (figur 5). I kontrast, konvensjonelle diffusjon-baserte injeksjoner utstillingen regioner av høye uttrykk konsentrert nær injeksjonssteder innhyllet av svekkelse uttrykk nivåer4,5,17. Redusert behov for flere injeksjoner gjengir CED infusjon en tid-effektiv metode for å oppnå stor skala, uniform optogenetic uttrykk. På grunn av mindre antall injeksjoner og raskere infusjon priser, var vi i stand til å planlegge og sette mot viral vektor under veiledning av MRI. Bruken av online MR bilder muliggjør presis målretting av infusjoner og overvåking av spredningen av viral vektor under infusjon. Men hvis den innledende dybden på den innsatte kanyle er feil, kan dette gi uttrykk på uønskede steder som et resultat av den opprinnelige tilført ~ 10 μL som er nødvendig for å visuelt oppdage infusjonen via MR. Alternativt kan kommersielle nevrokirurgisk navigasjonssystemer bruker fiducial markører kan også være ansatt i stedet for MR veiledning. I tillegg kan kostnadene ved online Imaging bli omgås ved å merke den ønskede dybden av innsetting på kanyle før innsetting og visuelt bekrefter fullstendig infusjon gjennom infusjons linjen, selv om nøyaktigheten av kanyle plassering ville være Redusert. Men, som sett av den mislykkede injeksjon i M1 av ape G (figur 5D), Mr veiledning kan være avgjørende for å sikre vellykket infusjon.
Tidligere studier har vist at sikkerheten til CED infusjoner av både ikke-viral og viral partikler uten observert vevsskade utenfor kanyle-tarmkanalen og ingen atferds underskudd9,11,12,13 ,14,15,20. Her og i våre tidligere publikasjoner9,14 rapporterer vi lignende resultater etter CED infusjon av optogenetic viral vektorer. I tillegg til ingen observerte atferdsmessige underskudd etter infusjon, NeuN og Nissl9,14,15 farging avslørt neuronal celle død og gliosis var begrenset bare til kanyle luftveiene, som har blitt rapportert med diffusjon-baserte metoder5. For å minimere skaden fra kanyle spor, kan vi potensielt redusere diameteren på kanyle. Imidlertid er videre etterforskning nødvendig for å vurdere effekten av kanyle størrelsesreduksjon på å oppnå store uttrykks områder. Videre, fordi høye infusjons hastigheter også kan føre til vevsskade13, anbefales det å opprettholde en infusjonshastighet ved eller under 5 μL/min. Hvis du vil ha mer detaljert informasjon om CED-teknikken, kan du se forrige utgivelse9.
Bruken av MR-guidede CED for å oppnå brede områder av målrettede optogenetic uttrykk i primater cortex kan føre til ytterligere undersøkelser av stor skala krets dynamikk, neural plastisitet, og nettverkstilkobling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS har økonomisk interesse i Neuralink Corp, et selskap som utvikler klinisk behandling ved hjelp av hjernen stimulering.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association postdoktor fellesskap (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) omorganisering og plastisitet å akselerere skade utvinning (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, og av UCSF nevrovitenskap Imaging Center. Dette arbeidet ble også støttet av Eunice Kennedy skjelve National Institute of Child Health & Human utvikling av National Institutes of Health under Award Number K12HD073945, Washington National primater Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), og Center for Neurotechnology (CNT, en National Science Foundation engineering Research Center under Grant EØF-1028725). Vi takker Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel sølvsmed, Karen J. MacLeod, Juliana Milani, og Blakely Andrews for deres hjelp med eksperimenter og Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz, og Toni Haun for teknisk hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al.
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
