Summary
Här demonstrerar vi magnetisk resonans (MR)-guidad konvektion förbättrad leverans (CED) av virala vektorer i cortex som en effektiv och förenklad metod för att uppnå optogenetiska uttryck över stora kortikala områden i makak hjärnan.
Abstract
I icke-mänskliga primater (NHP) optogenetik, infekterar stora kortikala områden med virala vektorer är ofta en svår och tidskrävande uppgift. Här visar vi användningen av magnetisk resonans (MR)-guidad konvektion förbättrad leverans (CED) av optogenetiska virala vektorer i primär somatosensorisk (S1) och motor (M1) cortices av makaker för att få effektiva, utbredda kortikala uttryck av ljuskänsliga jonkanaler. Adeno-Associated viral (AAV) vektorer kodning den rödskiftade opsin C1V1 smält till gult fluorescerande protein (EYFP) injicerades i cortex av Rhesus makaker under MR-ledda CED. Tre månader efter infusion bekräftade epilys Imaging stora regioner av optogenetiskt uttryck (> 130 mm2) i M1 och S1 i två makaker. Dessutom kunde vi spela in tillförlitlig ljus-framkallade elektrofysiologi svar från att uttrycka områden med mikro-elektrokortikographic arrayer. Senare histologisk analys och immunofärgning mot reportern avslöjade omfattande och täta optogenetiska uttryck i M1 och S1 som motsvarar den fördelning som indikeras av epilys Imaging. Denna teknik gör det möjligt för oss att få uttryck över stora delar av cortex inom en kortare tid med minimal skada jämfört med de traditionella teknikerna och kan vara en optimal metod för optogenetisk viral leverans hos stora djur som NHPs. Denna metod visar stor potential för nätverk-nivå manipulation av neurala kretsar med cell-typ specificitet i djurmodeller evolutionärt nära människor.
Introduction
Optogenetics är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för manipulation av neurala aktivitet och studiet av nätverksanslutningar i hjärnan. Implementera denna teknik i icke-mänskliga primater (NHPs) har potential att förbättra vår förståelse av storskaliga neurala beräkningar, kognition, och beteende i primater hjärnan. Även om optogenetik har genomförts framgångsrikt i NHPS under de senaste åren1,2,3,4,5,6,7, en utmaning som forskare ansikte uppnår höga uttrycks nivåer över stora hjärnområden hos dessa djur. Här ger vi en effektiv och förenklad metod för att uppnå höga halter av optogenetiska uttryck över stora delar av cortex i makaker. Denna teknik har stor potential att förbättra nuvarande optogenetiska studier hos dessa djur i kombination med State-of-the-art inspelning8,9 och optisk stimulering10 Technologies.
Konvektion förbättrad leverans (CED) är en etablerad metod för leverans av farmakologiska medel och andra stora molekyler, inklusive virala vektorer, till centralanervsystemet11,12,13. Medan konventionella leveransmetoder innebär flera låg volym infusioner fördelas över små regioner i hjärnan, CED kan uppnå bredare och jämnare agentdistribution med färre infusioner. Tryck driven bulk Fluid Flow (konvektion) under infusion möjliggör en mer utbredd och jämnt fördelad transduktion av målvävnaden vid leverans av virala vektorer med CED. I nyare studier, vi visade transduktion och efterföljande optogenetiska uttryck för stora områden av primär motor (M1) och somatosensorisk (S1) cortices9 och thalamus14 med hjälp av magnetisk resonans (Mr)-guidad CED.
Här, vi beskriver användningen av CED att uppnå optogenetiska uttryck över stora kortikala områden med endast ett fåtal kortikala injektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer har godkänts av University of California, San Francisco institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) och är förenliga med guiden för vård och användning av försöksdjur. Följande procedur utfördes med två vuxna manliga rhesusmakaker på 8 och 7 års ålder, som väger 17,5 kg och 16,5 kg (Monkey G och Monkey J), respektive.
Anmärkning: Använd standard aseptiska tekniker för alla kirurgiska ingrepp.
1. bildbehandling vid baseline
- Sedate och intubera djuret och bibehålla narkos under isofluran (koncentrationen förändrades mellan 0 till 5% efter behov, beroende på vitala tecken såsom andningsfrekvens och hjärtfrekvens). Övervaka djurets temperatur, hjärtfrekvens, syremättnad, elektrokardiografiska svar, och end-Tidal partiellt tryck av CO2 under hela förfarandet.
- Placera djuret i en MR-kompatibel stereotaxic ram (se tabellen av material) där det kommer att förbli under hela förfarandet. Anslut djuret till en bärbar MR-kompatibel isofluran-maskin och transportera den till MRI-skannern (3 T).
- Förvärva standard T1 (Flip Angle = 9 °, repetitionstid/ECHO tid = 668,6, Matrix storlek = 192 x 192 x 80, slice tjocklek = 1 mm) och T2 (Flip Angle = 130 °, repetitionstid/ECHO tid = 52,5, Matrix storlek = 256 x 256 x 45, slice tjocklek = 1 mm) anatomiska MR bilder som baslinjen referens och för kirurgisk planering.
- Återvinna djuret från anestesi och transportera det till djur bostadsområdet.
- Använd de förvärvade T1-och T2-avbildningarna för att bestämma placeringen av kraniotomi. Placeringen av kraniotomi kan bestämmas exakt genom att matcha det kortikala området av intresse från Mr med makak Brain Atlas (paxinos, Huang, petride, Toga 2nd utgåva). Dessutom kan dessa baslinje bilder ger en uppskattning för platserna för viral infusion. De kortikala områden av intresse som visas här är M1 och S1.
2. MR-kompatibla kammare implantation
- Sedate och intubera djuret och underhålla narkos med standard bedövningsmedel övervakning som i 1,1.
- Placera djuret i MR-kompatibla stereotaxic ram där det kommer att förbli i hela kammaren implantation och viral vektor leverans. Anslut djuret till en bärbar MR-kompatibel isofluran maskin.
- Skapa en sagittal snitt ca 2 cm från mittlinjen med en längd av ca 5 cm med en skalpell.
- Ta bort underliggande mjuk vävnad från skallen med hjälp av hissar (se tabell över material).
- Skapa en cirkulär kraniotomi (2,5 cm diameter) för att täcka de förplanerade trajectorier för injektioner med hjälp av en trefin (se tabell över material).
- Sänk centreringspunkten för trefin förbi trefinens kant. Skapa en fördjupning i mitten av den planerade kraniotomi tillräckligt djupt i skallen för att förankra trefin med hjälp av justerbara centrering punkt trefin. Iaktta försiktighet för att undvika att helt tränga igenom djupet av skallen eftersom detta kan orsaka skador på den underliggande nervvävnad.
- Regelbundet spola området med saltlösning som behövs för att bibehålla vävnad fukt i hela kraniotomi.
- När centret har gjorts, sänk trefin på skallen och rotera trefin medurs och moturs medan du applicerar tryck nedåt tills ben locket kan tas bort med tång. Iaktta försiktighet för att undvika att skada den underliggande vävnaden med trefin.
- Trä en fin sutur (storlek 6-0) genom Dura i mitten av kraniotomi och lyfta Dura genom att försiktigt dra suturen från ytan av hjärnan skapa ett tält i mitten av kraniotomi.
- Nästa, punktera Dura nära mitten av tältet med hjälp av fina oftalmologiska sax för att undvika att skada hjärnan. Skär sedan Dura från mitten till kanten av kraniotomi och fortsätt längs kanten med fina oftalmologiska sax.
- Montera den cylindriska måttbeställda MR-kompatibla kammaren (figur 1; se avsnitt 4 för produktionsinstruktioner) till skallen ovanpå kraniotomi för att ge kanylstöd under CED infusion så att krökningen av kammar flänsen justerar väl med krökningen av skallen.
- Säkra implantaten till skallen med antingen plastskruvar och Dental akryl eller några titanskruvar.
3. viral vektor leverans
- Strax efter implantera MR-kompatibla kammaren och sätta in kanyl injektion rutnät (figur 1a-B, kompletterande figur 1) i kammaren, Fyll i rutnätet med saltlösning (0,9% NaCl) för att visualisera injektionsställen via Mr anatomiska bilder och Fyll kammaren håligheter med våt steril absorberbara gelatin för att bibehålla fukt i hjärnan (figur 1f).
- Täck över huden och cylindern med en steril antimikrobiell incisionsfilm draperi för att bibehålla steriliteten hos cylindrarna under transporten och infusioner. Placera en vitamin E-kapsel för att markera toppen av injektion rutnätet för positiv identifiering.
- Medan djuret förblir intubated, lossa endotrakealröret från anestesi kretsen och sätt tillbaka det till en bärbar MR-kompatibel isofluran maskin och transportera djuret till MRI-skannern.
- Förvärva T1 bilder (vänd vinkel = 9 °, repetitionstid/ECHO tid = 668,6, Matrix storlek = 192 x 192, slice tjocklek = 1 mm, 80 skivor) för att beräkna avståndet från toppen av injektion nätet och den kortikala ytan. Vitamin E-kapseln är tydligt synlig i T1-bilder och bör användas som markör för den övre delen av injektions rutnätet (figur 2A). Använd MR Imaging Softwares linjal verktyg för att mäta avståndet mellan toppen av injektion nätet och den kortikala ytan.
- Förvärva T2-bilder (Flip Angle = 130 °, repetitionstid/ECHO tid = 52,5, Matrix storlek = 256 x 256, slice tjocklek = 1 mm, 45 skivor) för att bestämma de optimala kanylguiderna för varje plats baserat på den riktade platsen för infusion (figur 2b-C). Som tidigare nämnts är kanyl Grid fylld med saltlösning som är bäst synlig i T2-bilder. Med MR Imaging programvara, bläddra igenom den koronala och sagittal plan för att hitta målplatsen för infusion.
- Efter upptining av viral Vector i ett par timmar vid rumstemperatur, blanda viral Vector med MR kontrastmedel gadoteridol (förhållandet 250:1; 2mM GD-DTPA, se tabell över material) med pipett eller blandning av Vortex.
Anmärkning: Den presenterade tekniken testades för AAV vektorer med en CamKIIa promotor drivande uttryck för C1V1 smält till EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2,5 x 1012 virus molekyler/ml; se tabell över material). - Ladda det blandade viruset i en 0,2 mL högtrycks IV slang (se tabell över material).
- Upprätta ett sterilt fält utanför MR-skannern för beredning av den virala infusionsslang.
- Använd högtrycks dropp slangen för att ansluta en lång förlängnings ledning (cirka 3-5 meter, beroende på placeringen av infusionspumpen med avseende på MR Bore) till en MR-kompatibel 3 mL spruta och Prime med saltlösning.
- Anslut den distala änden av den långa förlängnings ledningen till den proximala änden av 0,2 mL IV-slangen laddad med viruset och fäst refluxresistenta kanyl med en 1 mm stegad spets (figur 2D; se avsnitt 5 för produktionsinstruktioner för kanyl) till den distala änden av denna församling med en kläm stil kateter kontakt (se tabell över material) (figur 2e).
- Slutligen, Ställ in sprutan i en MR-kompatibel pump (se tabell över material). Placera pumpstyrningen i skanner kontrollrummet eftersom den inte är MR-kompatibel.
- Med hjälp av de anatomiska MR-bilder som erhållits före, Välj kanylens injektions rutnät och inläggnings djup som behövs för att nå mål infusionsstället. Markera insättnings djupet på kanyl med steril tejp.
- Börja infusionen med en hastighet av 1 μL/min och visuellt validera flödet av vätskan i infusionspåsen genom att observera utmatning av vätska från kanylspetsen.
- För in kanyl manuellt genom insprutnings nätet till mål djupet och samtidigt bibehålla flödet i infusionsslang, eftersom detta kommer att förhindra den penetrera vävnaden från igensättning av kanyl under insättning.
- Förvärva snabb (2 minuter) Flash T1 viktade bilder (vänd vinkel = 30 °, repetitionstid/ECHO tid = 3,05, Matrix storlek = 128 x 128, slice tjocklek = 1 mm, 64 skivor) för online-övervakning av viral Vector infusion.
- Efter infusion ~ 10 μL av vektorn så att tillräckligt med virus är infunderas att upptäcka i MR scanner, få MR bilder för att kontrollera korrekt kanyl placering som framgår av den observerade spridningen av viruset. Om djupet av den införda kanyl är felaktig, justera djupet i enlighet med detta eller långsamt ta bort kanyl och åter försöka införandet som i 3,12.
- Övervaka infusionen via online MR-bilder (Flash T1-viktad) och öka infusionshastigheten till 5 μL/min med 1 μL/min steg med några minuter (figur 3a).
- Efter infusion av cirka 40 μL av virus vektorn, börja minska infusionshastigheten med 1 μL/min steg och stoppa infusionen efter ~ 50 μL injiceras och lämna kanylen på plats i 10 minuter.
- Ta långsamt bort kanyl från hjärnan och flytta till nästa plats. Upprepa steg 3,9 till 3,19 för varje plats.
- Täck cylindern med en steril drapera i slutet av injektioner, före djurtransporter. Transportera sedan djuret tillbaka till operationssalen.
- Antingen explantat den MR-kompatibla kammaren och Stäng det kirurgiska snittet genom att ersätta ben luckan och överliggande muskler och suturering huden med hjälp av standard aseptiska tekniker eller ersätta kammaren med en Titan cylinder och konstgjord Dura (se Yazdan-Shahmorad et al. 20169) för neurala inspelning och stimulering.
4. MR-kompatibel kammare produktion
- Fabricera nylonkanyl insprutnings nätet (figur 1a-B) genom bearbetning enligt de specificerade dimensionerna (kompletterande figur 1).
- 3D-tryck den MR-kompatibla cylindern av akrylnitrilbutadienstyren (ABS0 plast (figur 1c-E) (se kompletterande fil 1 – 3; se tabell över material för 3D-skrivare och-material).
Anmärkning: En konstruktion upprätthåller en fast kanyl injektion rutnät inom MR-kompatibel cylinder (figur 1c), medan en annan möjliggör rotation av nätet, utvidga injektionsområdet (figur 1d-E). - Trä kanylens injektion rutnät och knacka på motsvarande hålighet i MR-kompatibla kammaren så att båda delarna uppvisar samma gängning.
Anmärkning: Alla typer av gängning kan användas under förutsättning att båda komponenterna har samma gängning. - För in nylonkanyl insprutnings nätet genom att skruva in det gängade hålet på MR-kompatibla cylindern.
5. reflux-resistent Kanylproduktion13
- Skär en 30 cm lång kiseldioxid slangar med 0,32 mm ID och 0,43 mm OD för den inre kiseldioxid slangar (se tabell över material) med hjälp av ett rakblad.
- Skär en 7,5 cm lång och en 5 cm långa kiseldioxid slangar med 0,45 mm ID och 0,76 mm OD för den yttre kiseldioxid slangen (se tabell över material).
- Följ 7,5 cm ytterslangar till 30 cm innerslangar med cyanoakrylat så att innerröret sträcker sig 1 mm bortom det yttre röret, vilket gör det reflux-resistenta steget (figur 2D). För att säkerställa att cyanoakrylat inte in insidan av innerslangar, placera cyanoakrylat på utsidan av innerslangar långt från kanyl spetsen.
- Klistra in 5 cm långa kiseldioxid slangar till andra änden av den inre slangen för fastsättning på klämman stil kateter kontakt (se steg 3,10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konvektion förbättrad leverans (CED) under MRI-vägledning
Spridningen av virus vektorn övervakades under CED-infusion under ledning av MR-bilder online (figur 3a). I denna studie var S1 och M1 av två apor riktade (figur 3b). De tredimensionella distributions volymerna beräknades i en post-hoc-analys av MR-bilder (figur 3c) enligt yazdan-shahmorad et al. 20169, vilket bekräftar täckningen av stora områden av cortex. M1-infusionerna för Monkey G utfördes utan MR-vägledning på grund av tidsbegränsningar.
Validering av viral Expression
Stora kortikala optogenetiska uttryck bekräftades genom epilys Imaging, elektrofysiologiska inspelningar, och histologisk analys som beskrivs av Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vi övervakade optogenetiska uttryck genom ytepifluorescens avbildning av fluorescerande reporter2,9 och uppskattade mer än 130 mm2 uttryck längs den kortikala ytan i M1 och S1 av två makaker från endast tre kortikala injektioner9,15. Ljus stimulering (488 nm, 20 MW effekt vid spetsen; se tabell över material) gav tillförlitliga elektrofysiologiska svar i de uttrycks områden som mäts av semi-transparent mikro-elektrokortikografiska arrayer8,9 ,16 (figur 4).
Analys av MR-bilder gav uppskattningsvis 233 mm3 och 433 mm3 av vektor spridning i M1 och S1 av monkey J, respektive 317 mm3 i S1 av Monkey G9. Vi utförde histologiska analyser på seriella koronalt sektioner och observerade storskaliga optogenetiska uttryck runt infusionsstället i M1 och S1 (figur 5c-i), med uppskattningsvis 70-80% av cellerna som uttrycker opsin. Det uttryck som observerats från histologi i linje med den uppskattade uttrycks fördelningen från epifluorescerande avbildning (figur 5a-D). En av de två infusioner utförs utanför MR scanner i Monkey G misslyckades, vilket ger inget uttryck i motsvarande region (figur 5D). Spridningen uppskattas från MR Imaging var helt inom gränserna för både epilys och histologiska åtgärder av viral spridning (figur 5E-G). Utbyggnaden av epilys Imaging bortom Mr uppskattning kan hänföras till spridningen av virala partiklar bortom termen regionen. Dessutom, den histologiska uppskattningen sträckte sig bortom epifluorescensmikroskopi uppskattning på grund av bristande optisk tillgång bortom kraniotomi. Detaljerna i dessa tekniker ingår i vår tidigare Paper9.
Figur 1: Mr-kompatibel cylinder och kanyl injektion rutnät. (A, B) specialdesignade nyloninjektionsgaller. C) Mr-kompatibel fast cylinder. (D, E) Roterande MR-kompatibel cylinder. (F) Mr-kompatibel infusioncylinder med fast rutnäts position. Pilarna pekar på håligheter som är utformade för att fyllas med våt steril absorberbara gelatin hålla ytan av hjärnan fuktig under varaktigheten av injektionen. (G) kanyl införd i rutnätet. Denna siffra har modifierats från Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BASELINE Mr Imaging och reflux resistenta kanyl. (A) T1-vägd bild av vitamin E som var fäst vid toppen av injektion nätet som gör det möjligt för oss att mäta avståndet till ytan av hjärnan (vit pil). (B) T2-vägd bild av hjärnan hjälper till att planera placeringen av injektion från kanyl rutnät fylld med saltlösning. C) Mr-bild av infusionskammaren och det saltfyllda kanylgallret. De rätvinkliga linjerna representerar sagittal (gula) och koronala (lila) flygplan. (D) foto av reflux resistenta injektion kanyl spets med reflux resistenta steg (svart pil). E) infusionslinjer. Denna siffra har modifierats från Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mr Imaging under infusion och beräknad distribution. (A) spridning av 50 μl av virus vektorn i koronala avsnitt av Monkey G för ett injektionsställe i S1 (visas med en pil i B). B) Mr-ytbeläggning av den kortikala ytan under cylindern för apor G respektive J. S1 infusionsställen visas i blått, M1 platser i rött. (C) Mr-volym rekonstruktion av spridningen av viral Vector efter CED infusion. Hjärnan visas i ljusgrå; S1-och M1-infusionsvolymerna visas i blått respektive rött. Ingen MR Volume rekonstruktion är tillgänglig för M1 infusioner för Monkey G eftersom de inte gjordes i MR scanner. Denna siffra har modifierats från Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Elektrofysiologiska inspelningar av ljus-framkallat aktivitet. Mikroelektrokortikografi (μECoG) inspelningar inträffade under pulsad optisk stimulering. Inspelning spår var från närmaste elektrod till platsen för stimulering för exempel på M1 (röd) och S1 (grön) stimulering platser. Skuggade områden runt spåren representerar standardfel i 25 försök. De blå fyrkanterna på spåren visar tidpunkten för stimulering (1 MS). Den fullständiga uppsättningen av stimulans-utlöst vågformer för båda prov par av stimulering och inspelningsplatser är ovanpå den genomsnittliga vågformen som visas på vänster sida av panelen. Denna siffra har modifierats från Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Histologisk analys. A) baslinje för koronans Mr-bild i Monkey G.B) spridning av kontrastmedel efter infusionen för samma Mr koronalt slice som i a.Cen koronarsektion från ungefär samma plats som i a och B. peroxidasfärgning återspeglar uttrycket av EYFP-reportern. D) god justering observeras mellan det område av eyfp-uttryck som mäts med ytepiflourescens (Mörkgrön områden) och med histologisk färgning (ljusgröna linjer). Dessa inkluderar den region av vektor spridning uppskattas från MR images (vit linje); vita prickar indikerar injektionsställen, och hela svarta regionen representerar det område som exponeras av kraniotomi. De två vänstra injektionsställen finns i M1, och de två högra platserna ligger i S1. (E) låg förstoring bild av den koronala sektionen färgade med anti-GFP antikropp visar Medio-laterala aspekten av yfp uttryck i somatosensoriska cortex av Monkey J (områden 1, 2, 3). Den svarta pilspetsen indikerar placeringen av kanylspåret; den intilliggande vävnaden (svart ram) visas i F, vid större förstoring för att Visa laminärt fördelning av yfp-positiva celler. Ftätbefolkade regioner i yfp-positiva celler är huvudsakligen belägna i lager II-III och V-vi, och visar även typiska pyramidala morfologi (celler i vita ramar utvidgas ytterligare i paneler (G-i). Vita pilspetsar på botten paneler G-jag pekar på typiska pyramidala celler i lager II-III (G); lager V (H); och Layer VI (I). Skalstreck = 2 mm (E); 200 μm (F); 100 μm (G-I). Denna siffra har modifierats från Yazdan-Shahmorad et al. 20169 och yazdan-shahmorad et al. 201815. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: kanylinjektionsgallret före gängningen. Insprutnings rutnätets längd och diameter är 15,00 mm respektive 12,00 mm. Den injektion rutnät mönstret består av 0,8 mm diameter hål som bildar tre koncentriska cirklar (diameter: 1,6, 3,2 och 4,8 mm) runt mitten av nätet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande filer. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här skisserar vi en genomförbar och effektiv teknik för att uppnå storskaliga optogenetiska uttryck i NHP primära somatosensoriska och motoriska cortex av MR-guidad CED. Användningen av MR-Guided CED presenterar betydande fördelar jämfört med traditionella metoder för viral infusion i NHP hjärnan. En sådan fördel är förmågan att uppnå uttryck över stora områden med färre nödvändiga infusioner. Till exempel, med konventionella metoder, multipla injektioner av 1-2 μl av vektor avkastning uttryck i en 2-3 mm diameter region1,2,5,17. Medan tidigare försök att uppnå storskalig vektor spridning har gett uttrycks volymer på cirka 10 mm3 med flera injektioner18, här presenterar vi en metod för att uppnå uttryck över 200 mm3 med bara några infusioner . En enda infusion av 50 μL av CED kan uppnå vektor sprids upp till 10 mm från injektionsstället för kortikala CED9 och full täckning av frontal kortikala områden med thalamic CED14.
Dessutom har det visats att användning av CED kan åstadkomma en mer homogen fördelning av det injicerade medlet12,19,20,21,22, vilket leder till enhetliga uttrycks nivåer runt platsen för viral Vector infusion, jämfört med traditionella mikroinjektioner. I våra experiment som sysselsätter CED, observerade vi jämnt höga uttrycks nivåer med cirka 70-80% av nervceller som uttrycker opsin8,9 (figur 5). Konventionella diffusions baserade injektioner uppvisar däremot regioner med hög uttrycks grad koncentrerade nära injektionsställen som är höljeförsedda genom att försvaga uttrycksnivåerna4,5,17. Det minskade behovet av multipla injektioner gör infusion till en tidseffektiv metod för att uppnå ett omfattande, enhetligt optogenetiskt uttryck. På grund av det mindre antalet injektioner och snabbare infusionshastighet, kunde vi planera och ingjuta viral Vector under ledning av MRI. Användningen av online MR-bilder möjliggör exakt inriktning av infusioner och övervakning av spridningen av viral Vector under infusion. Men om det initiala djupet av den införda kanyl är felaktig, detta kan ge uttryck i oönskade platser som ett resultat av den initiala infunderas ~ 10 μL behövs för att visuellt upptäcka infusionen via MR. Alternativt kommersiella Neurokirurgiska navigationssystem använda relaterat markörer kan också användas i stället för Mr vägledning. Dessutom kan kostnaderna för online-avbildning kringgås genom att markera det önskade djupet för insättning på kanyl innan insättning och visuellt bekräfta fullständig infusion genom infusionsslang, även om noggrannheten i kanylens placering skulle vara Minskad. Men, som framgår av den misslyckade injektionen i M1 av Monkey G (figur 5D), Mr vägledning kan vara avgörande för att säkerställa en lyckad infusion.
Tidigare studier har visat säkerheten för CED-infusioner av både icke-virala och virala partiklar utan observerade vävnadsskador utanför kanylområdet och inga beteendemässiga underskott9,11,12,13 ,14,15,20. Här och i våra tidigare publikationer9,14 vi rapporterar liknande resultat efter CED infusion av optogenetiska virala vektorer. Förutom att inga observerade beteendemässiga underskott efter infusion, Neun och Nissl9,14,15 färgning avslöjade neuronala celldöd och glios begränsades endast till kanyl tarmkanalen, som har rapporterats med diffusions-baserade metoder5. För att minimera skadorna från kanylspåret kan vi potentiellt minska kanylens diameter. Det behövs dock ytterligare undersökningar för att bedöma effekten av kanyl storleksminskning på att uppnå stora uttrycks områden. Dessutom, eftersom höga infusionshastigheter också kan leda till vävnadsskada13, det rekommenderas att hålla en infusionshastighet på eller under 5 μl/min. För mer detaljerad information om CED-tekniken, se vår tidigare publikation9.
Användningen av MR-ledda för att uppnå breda regioner av riktade optogenetiska uttryck i primater cortex kan leda till ytterligare utredningar av storskaliga krets dynamik, neurala plasticitet, och nätverksanslutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS har ekonomiska intressen i Neuralink Corp., ett företag som utvecklar kliniska terapier med hjälp av hjärn stimulering.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Heart Association postdoktorala Fellowship (AY), Defense Advanced forskningsprojekt Agency (DARPA) omorganisation och plasticitet att påskynda skada återhämtning (reparation; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, och av UCSF Neuroscience Imaging Center. Detta arbete stöddes också av Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & mänsklig utveckling av National Institutes of Health under tilldelning nummer K12HD073945, Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), och Centrum för neuroteknik (CNT, en National Science Foundation Engineering Research Center under Grant EEG-1028725). Vi tackar Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel silversmed, Karen J. MacLeod, Juliana Milani, och Blakely Andrews för deras hjälp med experiment och Nan Tian, Jiwei han, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz, och Toni Haun för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al.
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
