Summary

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Published: August 27, 2019
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Summary

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Abstract

Die Singlefaseraufzeichnung war in den letzten Jahrzehnten aufgrund ihrer spezifischen Anwendung für Nervenfasern im zentralen und peripheren Nervensystem eine klassische und effektive elektrophysiologische Technik. Diese Methode ist besonders auf dorsale Wurzelganglien (DRG) anwendbar, die primäre sensorische Neuronen sind, die eine pseudo-unipolare Struktur von nervenaufworastrien Prozessen aufweisen. Die Muster und Merkmale der Aktionspotentiale, die entlang von Axonen weitergegeben werden, sind in diesen Neuronen nachweisbar. Die vorliegende Studie verwendet in vivo Singlefaser-Aufnahmen, um das Leitungsversagen von Ischiasnerven bei vollständig Freunds adjuvant (CFA)-behandelten Ratten zu beobachten. Da der zugrunde liegende Mechanismus nicht mit in vivo Singlefaser-Aufnahmen untersucht werden kann, werden Patch-Clamp-Aufnahmen von DRG-Neuronen auf Präparaten intakter DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv durchgeführt. Diese Aufnahmen zeigen eine positive Korrelation zwischen Leitungsversagen und der steigenden Steigung des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von DRG-Neuronen bei CFA-behandelten Tieren. Das Protokoll für in vivo Einzelfaser-Aufnahmen ermöglicht die Klassifizierung von Nervenfasern über die Messung der Leitungsgeschwindigkeit und die Überwachung von abnormalen Erkrankungen in Nervenfasern bei bestimmten Krankheiten. Intaktes DRG mit angeschlossenem peripheren Nerv ermöglicht die Beobachtung der Aktivität von DRG-Neuronen unter den meisten physiologischen Bedingungen. Abschließend ist die Singlefaseraufzeichnung in Kombination mit der elektrophysiologischen Aufzeichnung intakter DRGs eine effektive Methode, um die Rolle des Leitungsversagens während des analgetischen Prozesses zu untersuchen.

Introduction

Die normale Übertragung von Informationen entlang der Nervenfasern garantiert die normale Funktion des Nervensystems. Abnormale Funktion des Nervensystems spiegelt sich auch in der elektrischen Signalübertragung von Nervenfasern wider. Beispielsweise kann der Grad der Demyelination bei zentralen Demyelinationenläsionen durch Vergleich von Veränderungen der Nervenleitungsgeschwindigkeit vor und nach der Intervention anwendung1klassifiziert werden. Es ist schwierig, Nervenfasern intrazellulär aufzuzeichnen, außer bei speziellen Präparaten wie dem Tintenfischriesen Axon2. Daher ist die elektrophysiologische Aktivität nur über die extrazelluläre Aufzeichnung einzelner Fasern beschreibbar. Als eine der klassischen elektrophysiologischen Methoden hat die Singlefaseraufzeichnung eine längere Geschichte als andere Techniken. Allerdings greifen trotz ihrer umfangreichen Anwendung weniger Elektrophysiologen nach dieser Methode. Daher ist eine detaillierte Einführung des Standardprotokolls für die Singlefaseraufzeichnung für die entsprechende Anwendung erforderlich.

Obwohl verschiedene Patch-Clamp-Techniken die moderne elektrophysiologische Studie dominiert haben, spielt die Singlefaseraufzeichnung immer noch eine unersetzliche Rolle bei der Aufzeichnung der Aktivitäten von Nervenfasern, insbesondere Fasern, die periphere Empfindungen mit ihren Sinneszellkörper in Dorsalwurzelganglion (DRG). Der Vorteil der Verwendung von Singlefaser-Aufzeichnung hier ist, dass in vivo Faseraufzeichnung bietet eine lange Beobachtungszeit mit der Fähigkeit, Reaktionen auf natürliche Reize in präklinischen Modellen ohne Störung der intrazellulären Umgebung3 , 4.

Eine zunehmende Anzahl von Studien in den letzten zwei Jahrzehnten hat komplexe Funktionen entlang der Nervenfasern untersucht5, und Leitungsversagen, das als ein Zustand der erfolglosen Nervenimpulsübertragung entlang des Axons definiert ist, war in vielen verschiedenen periphere Nerven6,7. Das Vorhandensein von Leitungsversagen in unserer Untersuchung diente als intrinsischer Selbsthemmungsmechanismus für die Modulation persistenter nozizeptiver Eingaben entlang der C-Fasern8. Dieser Leitungsfehler wurde unter Bedingungen der Hyperalgesie4,9signifikant abgeschwächt. Daher kann die Ausrichtung auf die Faktoren, die an einem Leitungsversagen beteiligt sind, eine neue Behandlung für neuropathische Schmerzen darstellen. Um Leitungsfehler zu beobachten, sollte das Brennmuster auf der Grundlage sequenziell entladener Spitzen auf der Grundlage von Singlefaseraufzeichnungen aufgezeichnet und analysiert werden.

Um den Mechanismus des Leitungsversagens gründlich zu verstehen, ist es notwendig, die Transmissionseigenschaften des Axons, genauer gesagt, die Membraneigenschaften von DRG-Neuronen zu identifizieren, basierend auf ihren pseudo-unipolaren anatomischen Eigenschaften. Viele frühere Studien in diesem Bereich wurden an dissoziierten DRG-Neuronen10,11durchgeführt, die für die Untersuchung von Leitungsversagen aufgrund von zwei Hindernissen möglicherweise nicht durchführbar sind. Zunächst werden verschiedene mechanische und chemische Methoden im Dissoziationsprozess verwendet, um DRG-Neuronen zu befreien, was zu ungesunden Zellen führen oder den Phänotyp/die Eigenschaften der Neuronen verändern kann und die Befunde verwirrt. Zweitens werden die angeschlossenen peripheren Nerven im Grunde entfernt, und Leitungsversagen Phänomene sind in diesen Präparaten nicht beobachtbar. Daher wurde eine Vorbereitung von intakten DRG-Neuronen mit einem angeschlossenen Nerv verbessert, um die oben genannten Hindernisse zu vermeiden.

Protocol

Das aktuelle Protokoll folgte dem Leitfaden für die Politik des United States Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren, und das Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Vierten Militärmedizin-Universität billigte das Protokoll. 1. Tiere Teilen Sie 24 Sprague-Dawley-Ratten (4-8 Wochen alt) in zwei Gruppen auf. Produzieren Sie das vollständige Freund-Adjuvans-Modell (CFA) durch intraplantare Injektion von 100 l CFA in einer Gruppe von 14 Ratten un…

Representative Results

Das Ergebnis des Single-Faser-Aufnahmeprotokolls hängt von der Qualität der Fasersektion ab. Das Tier für In-vivo-Experimente muss in einer guten Situation sein, um den Nervenstamm gesund zu halten, um eine einfache Zerlegung zu erhalten (siehe Rat schlagesinimt im Diskussionsteil). Ein Drogenanwendungsbad ist in vielen Fällen für die Medikamentenabgabe auf Fasern erforderlich. Abbildung 1 zeigt, wie die In-vivo-Einzelfaseraufzeichnung betrieben wurde (Abbildung 1A) und…

Discussion

Obwohl neuere Studien Kalzium-Bildgebung von DRG-Neuronen in vivo16erreicht haben, bleibt die Durchführung von in vivo Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen DRG-Nozizeptoren äußerst anspruchsvoll. Daher ist ein in vivo Singlefaser-Ansatz für das Schmerzfeld von anhaltendem Bedeutung. Die Einzelfaseraufzeichnung im vorliegenden Protokoll ermöglicht eine objektive Beobachtung von Leitungsversagensphänomenen, und die Kombination dieser Technik mit der in der aktuellen Studie entwickelten Ex-vivo-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Natural Science Foundation of China (31671089 und 81470060) und des Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250) unterstützt.

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

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Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

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