Summary
A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.
Abstract
A gravação da único-fibra foi uma técnica eletrofisiológicos clássica e eficaz sobre as últimas décadas por causa de sua aplicação específica para fibras de nervo nos sistemas nervosos centrais e periféricos. Este método é particularmente aplicável aos gânglios da raiz dorsal (DRG), que são neurônios sensoriais primários que exibem uma estrutura pseudounipolar de processos nervosos. Os padrões e características dos potenciais de ação passados ao longo de axônios são graváveis nesses neurônios. O presente estudo utiliza gravações in vivo de fibra única para observar a falha de condução dos nervos ciáticos em ratos tratados com adjuvante completo de Freund (CFA). Porque o mecanismo subjacente não pode ser estudado usando gravações in vivo da único-fibra, remendo-grampo-gravações de neurônios de DRG são executados em preparações de DRG intact com o nervo ciático Unido. Estas gravações revelam uma correlação positiva entre a falha da condução e a inclinação de aumentação do potencial After-hyperpolarization (AHP) de neurônios de DRG em animais CFA-tratados. O protocolo para gravações in vivo de fibra única permite a classificação das fibras nervosas através da mensuração da velocidade de condução e monitorização das condições anormais nas fibras nervosas em determinadas doenças. DRG intact com nervo periférico Unido permite a observação da atividade de neurônios de DRG em a maioria de circunstâncias physiological. Conclusivamente, a gravação de fibra única combinada com a gravação eletrofisiológica de DRGs intactos é um método eficaz para examinar o papel da falha de condução durante o processo analgésico.
Introduction
A transmissão normal da informação ao longo das fibras nervosas garante a função normal do sistema nervoso. O funcionamento anormal do sistema nervoso também é refletido na transmissão do sinal elétrico de fibras nervosas. Por exemplo, o grau de desmielinização nas lesões de desmielinização central pode ser classificado através da comparação das alterações na velocidade de condução nervosa antes e após a aplicação da intervenção1. É difícil de registrar as fibras nervosas intracellularmente, exceto em preparações especiais, como o AXON gigante de Lula2. Portanto, a atividade eletrofisiológica só é gravável através do registro extracelular de fibras únicas. Como um dos métodos electrofisiológicos clássicos, a gravação da único-fibra tem uma história mais longa do que outras técnicas. No entanto, menos eletrofisiologistas agarrando este método apesar de sua extensa aplicação. Portanto, uma introdução detalhada do protocolo padrão para gravação de fibra única é necessária para sua aplicação apropriada.
Embora as várias técnicas da remendo-braçadeira dominem o estudo eletrofisiológicos moderno, a gravação da único-fibra ainda joga um papel insubstituível em registrar as atividades de fibras de nervo, especial fibras que transmitem a sensação periférica com seus corpo de células sensoriais localizado no gânglio da raiz dorsal (DRG). A vantagem de usar a gravação da único-fibra aqui é que a gravação in vivo da fibra fornece um tempo longo da observação com a capacidade para gravar respostas aos estímulos naturais em modelos pré-clínicos sem violação do ambiente intracelular3 , a 4.
Um número crescente de estudos nas duas últimas décadas examinou funções complexas ao longo das fibras nervosas5, e a falha de condução, que é definida como um estado de transmissão de impulso do nervo mal sucedido ao longo do axão, estava presente em muitos diferentes nervos periféricos6,7. A presença de falha de condução em nossa investigação serviu como mecanismo intrínseco de autoinibição para a modulação da entrada nociceptiva persistente ao longo das fibras C8. Esta falha da condução foi atenuada significativamente condições de hiperalgesia4,9. Portanto, direcionar os fatores envolvidos na falha de condução pode representar um novo tratamento para a dor neuropática. Para observar a falha de condução, o padrão de queima deve ser gravado e analisado com base em picos sequencialmente descarregados com base na gravação de fibra única.
Para compreender completamente o mecanismo da falha da condução, é necessário identificar as propriedades da transmissão do axônio, ou mais precisamente, as propriedades da membrana de neurônios de DRG, baseadas em suas propriedades anatômicas pseudounipolares. Muitos estudos prévios neste campo foram realizados em neurônios dissociados de DRG10,11, oque pode não ser viável para a investigação da falha de condução devido a dois obstáculos. Em primeiro lugar, vários métodos mecânicos e químicos são usados no processo de dissociação para libertar neurônios DRG, o que pode resultar em células não saudáveis ou alterar o fenótipo/propriedades dos neurônios e confundir os achados. Em segundo, os nervos periféricos anexados são removidos basicamente, e os fenômenos da falha da condução não são observáveis nestas preparações. Conseqüentemente, uma preparação de neurônios intactos de DRG com um nervo Unido foi melhorada para evitar os obstáculos acima mencionados.
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Protocol
O protocolo atual seguiu o guia para a política do serviço de saúde pública dos Estados Unidos sobre a assistência humanitária e o uso de animais de laboratório, e o Comitê de ética em experimentos com animais da quarta universidade militar de medicina aprovou o protocolo.
1. os animais
- Divida 24 ratos Sprague-Dawley (4-8 semanas de idade) em dois grupos. Produzir o modelo adjuvante completo de Freund (CFA) por injeção intraplantar de 100 μL de CFA em um grupo de 14 ratos e outro grupo de 10 ratos por tratamento com soro fisiológico.
Nota: todos os animais foram adquiridos do centro animal da quarta universidade militar de medicina. Foram utilizados ratos machos e fêmeas adultos de Sprague-Dawley (150-200 g) para todos os procedimentos, e os ratos foram distribuídos aleatoriamente em gaiolas. Dois ratos foram alojados por gaiola um ciclo claro/escuro de 12-12-hour a uma temperatura constante (25 ± 1 ° c) com livre acesso a alimentos e água.
2. in vivo single-gravação de fibra
- Prepare e desinfete todos os instrumentos cirúrgicos (bisturi, pinça, tesoura oftálmicas, tesoura de corte, agulha de separação de vidro, agulha de sutura, Rongeur ósseo) antes da cirurgia. Prepare 1 L ou 2 L de solução extracelular de Ringer normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CAcl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glucose 15; pH 7,4 e 305 mOsm). Conservar a 4 ° c até à utilização.
- Anestesiem ratos. Nos dias 3 a 7 após a injeção de CFA, use injeção intraperitoneal de uma solução mista (1% de cloralose e 17% de uretano, 5 mL/kg de peso corporal) para manter os animais em uma condição estética estável durante o experimento. Aplicar a injeção suplementar de anestésicos, se necessário, após a verificação dos alunos e a resposta à estimulação da dor. Monitore e mantenha uma temperatura corporal perto de 37 ° c.
-
Exposição do tronco do nervo ciático para gravação
- Corte abrir a pele e o músculo na parte dorsal da coxa. Realize uma dissecção sem corte ao longo do bíceps femoral. Isole com cuidado o tronco do nervo ciático usando tesouras oftálmica e uma agulha de vidro da separação. Mantenha o tecido molhado usando a solução de Ringer.
- Fixar o animal em um aro de metal caseiro (3 cm de comprimento, 2 mm de largura aro de metal com um fio de ferro 1 mm de diâmetro) através da costura da pele para o slot em torno dele. Puxe a pele para cima um pouco de modo a estabelecer um banho de fluido.
- Expor 1 cm de tronco do nervo ciático no lado proximal. Coloc uma plataforma marrom pequena o tronco de nervo para realçar o contraste e para observar claramente o tronco de nervo fino. Aqueça a parafina líquida em um banho de água a 37 ° c e deixe-a cair na parte superior do tronco de nervo para impedir a secagem da superfície da fibra. Retire a pia mater espinhal e dura-máter em torno do nervo ciático.
-
Gravação
- Selecione um filamento de platina (29 μm de diâmetro) como o eletrodo de gravação. Aqueça sobre para o molde mais fácil, e crie um gancho pequeno na extremidade muito. Prenda o eletrodo a um micromanipulador para mover o eletrodo conforme necessário.
- No banho, coloque um eletrodo de referência no tecido subcutâneo adjacente. Divida a dura espinhal e a pia mater. Separe o nervo ciático em uma única fibra (15-20 μm de diâmetro) na piscina de gravação. Em seguida, pegue um fascículo fino de AXON e suspender a extremidade proximal do AXON no gancho do eletrodo de gravação um estereoscópio em 25x ampliação.
Nota: Os filamentos apenas dissecados tendem a ser mais grossos e exigem uma separação mais adicional até que uma única unidade possa ser gravada. - Identifique o campo receptivo de uma única C-fibra nociceptiva usando um estímulo mecânico (pêlos de von Frey) e estímulo térmico (bola de algodão pequena com água de 50-55 ° c). Momentaneamente, se o acendimento da fibra de nervo responder aos estímulos mecânicos e à água quente, considere-o então como um C-fibra nociceptiva polimodais4. Em seguida, insira dois eletrodos de estímulo de agulha (intervalo de 2 mm) na pele do campo identificado para a entrega de estímulos elétricos.
- Exibir a forma de onda de um potencial de ação no osciloscópio e empregar uma placa de computador A/D com uma taxa de amostragem de sinal de 20 kHz para amplificar e gravar os picos.
- Coletar dados usando software de aquisição de dados (tabela de materiais). Salvar dados em um computador e analisar mais tarde com software profissional (tabela de materiais).
3. medição de falha de condução
- Entregar os estímulos elétricos repetitivos (duração de 0,8 MS, intensidade do limiar de 1,5 x) em diferentes frequências (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) a uma C-fibra para 60 s4,8,9. Permita um intervalo de 10 minutos para que a fibra relaxe entre estímulos. Calcule a proporção do número de falhas para o número de pulsos de estímulo repetitivo entregues e multiplicar por 100% para obter o grau de falha de condução.
4. preparação de DRG Iintact anexado com nervo ciático
- Prepare as ferramentas cirúrgicas e a solução extracelular de Ringer, conforme descrito na etapa 2,1.
- Separe o DRG com o nervo ciático anexado.
- Anestesie os ratos como descrito na etapa 2,2 (nos dias 3 a 7 após a injeção de CFA). Corte o cabelo nas costas e perna com tesoura de cisalhamento, e esterilizar a pele com tintura de iodo.
- Para a exposição de DRG, primeiro corte Abra a pele da linha média da parte traseira no nível do segmento L4 a L5. Remova os músculos, o processo da espinha, a placa da vértebra, e o processo transversal usando um Rongeur do osso para expor a medula espinal e o corpo de DRG. Cubra a medula espinhal exposta e o DRG com algodos infiltrados pela solução extracelular de Ringer normal para manter a atividade neural. Pare o sangramento e limpe o sangue no tempo.
- Exponha o nervo ciático de duas direções: Remova a estrutura óssea L4 a S1 acima do forame vertebral usando tesouras oftálmicas para expor o nervo espinhal conectado à DRG que está na extremidade proximal do nervo ciático. Corte abrir a pele para expor o nervo ciático na coxa média. Separe e desconecte o nervo ciático da extremidade longe do ponto de origem do nervo onde vai dentro do músculo, e ligadura o tronco do nervo com a linha cirúrgica na extremidade do nervo antes do corte.
- Separe o nervo ciático do tecido conexivo subjacente usando tesouras oftálmica através do levantamento do ponto da ligadura do nervo. Retire a dura da medula espinhal e separe o DRG do tecido conjuntivo subjacente através do levantamento da raiz dorsal até atingir a parte adjacente do nervo ciático. Assim, isole a preparação inteira de DRG com um nervo ciático Unido.
- Limpe a superfície do DRG.
- Remova com cuidado a dura espinal nas superfícies de L4 − L6 DRG usando a pinça um estereoscópio na ampliação 4x.
- Coloque o DRG com o nervo ciático anexado em um tubo de vidro contendo 1 mL de enzimas mistas (0,2% proteinase e 0,32% Collagenase) e digerir em um banho de água de 37 ° c por 15 min (golpe ligeiramente com um conta-gotas de plástico em um intervalo de 5 min).
- Levante a extremidade da linha de ligadura e mova a preparação para um prato preenchido com uma solução extracelular de Ringer normal para lavar a enzima. Em seguida, transfira o DRG digerido para um recipiente (Figura 1a) preenchido com solução extracelular de Ringer oxigenada para gravação.
- Gravação
- Prepare a solução intracelular (em mM: gluconato de potássio 120, KCl 18, MgCl2 2, etileno glicol-bis (éter β-aminoetílico)-n, N, n ', n'-ácido tetraacético [EGTA] 5, HEPES 10, na2-ATP 5, na-GTP 0,4, CAcl2 1; pH 7,2 e 300 mOsm). Manter a 0 ° c até ao uso.
- Estabilize os gânglios usando uma âncora de fatia e conecte a extremidade do nervo a um eletrodo estimulante de sucção (Figura 1a). Visualize e selecione um neurônio DRG com um objetivo de imersão em água a uma ampliação de 40x.
- Puxe um eletrodo (tabela de materiais) e preenchê-lo com solução intracelular. Insira o eletrodo no suporte e aplique pressão positiva na pipeta com uma resistência final de 4-7 MΩ.
- Aproxime o eletrodo da célula e toque-o. Dê uma pressão negativa na pipeta, uma vez que o selo de GΩ é alcangado, ajuste o potencial da membrana em aproximadamente-60 milivolt e estabeleça então a modalidade da gravação da todo-pilha.
- Entregar estímulos repetitivos de 5-50 Hz ao nervo ciático através do eletrodo de sucção para a tela para falha de condução. Meça a amplitude do potencial de pós-hiperpolarização (AHP) desde o início até o pico, e a duração de 80% de AHP.
Nota: Utilizou-se a análise de variância unidirecional (ANOVA; para mais de dois grupos) ou o teste t de Student (para apenas dois grupos) para analisar os dados. Os dados são apresentados como médias ± erro padrão da média (MEV). O nível estatístico significante foi fixado em p < 0, 5.
- Terminando o experimento
- Quando a tarefa experimental é terminada quando os ratos forem ainda a situação anestésica, os ratos são eutanasiados humanamente com injeções intracardiac do sódio pentobarbital da dose excessiva.
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Representative Results
O resultado do protocolo de gravação de fibra única depende da qualidade da dissecção da fibra. O animal para experimentos in vivo deve estar em uma boa situação para manter o tronco nervoso saudável para fácil dissecção (ver conselhos na seção de discussão). Um banho da aplicação da droga é necessário em muitos casos para a entrega da droga em fibras. A Figura 1 ilustra como o registro de fibra única in vivo foi operado (Figura 1a) e apresenta uma gravação clássica do nervo ciático de animais tratados com CFA (Figura 1b).
Os experimentos a seguir investigaram a existência de falência de condução em animais tratados com CFA. Esta investigação baseou-se no pressuposto de que a falha de condução ao longo das C-fibras nociceptivas foi um fenômeno comum, e o grau de falha de condução foi significativamente atenuado em condições de hiperalgesia, que são apoiadas pelo nosso estudos prévios4,8,9,12. A Figura 2a mostra que a falha da condução da C-fibra foi observada em animais normais. No entanto, o grau de falha de condução foi reduzido significativamente após o estabelecimento de hiperalgesia induzida pelo CFA após a injeção de CFA no pé comparado ao controle (Figura 2b). Estes dados demonstram que a falha da condução de C-fibras nociceptiva polimodais dor-relevantes é atenuada no modelo do CFA da dor inflamatório.
Para examinar o mecanismo intracelular durante a falha de condução, utilizou-se a preparação de DRG intacto com nervo ciático anexado (Figura 3a,B). A Figura 3C mostra que dentro da série de estímulos, picos em resposta a estímulos repetitivos empilhados no potencial pós-hiperpolarização anterior (AHP) e resultaram em uma diminuição na inclinação ascendente do AHP seguinte (Figura 3C,D ). A presença de AHP em pequenos neurônios DRG potencialmente ativa os canais de nucleotídeo-modulados (HCN) ativados por hiperpolarização, cíclico13,14,15. O efeito cumulativo do AHP desempenha um papel na ocorrência de falha de condução. Conseqüentemente, nós supor que obstruir canaletas de HCN melhoraria significativamente o efeito da falha da condução. O experimento a seguir utilizou um bloqueador de canais HCN, ZD7288. As gravações contínuas revelaram um aumento na falha da condução na presença de ZD7288 em uma maneira concentração-dependente. Os Insets mostram traços expandidos para os intervalos especificados. Observou-se correlação positiva entre a falha de condução e a inclinação ascendente do AHP em pequenos neurônios DRG de animais tratados com CFA (Figura 3E).
Figura 1: gravações in vivo de fibra única de nervos ciáticos de ratos. (A) diagrama esquemático da gravação de fibra única indicando as regiões para gravação (R) (antes de dividir um filamento para gravação, a pia mater espinhal e a dura-máter foram removidas aqui), aplicação de medicamentos (D), estimulação (S) e o local da CFA Injeção. (B) registro representativo de uma fibra única ciática exibindo um padrão de queima tônico. Este número foi modificado de Wang et al.9 por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: a falha de condução em ratos tratados com CFA foi atenuada em comparação com os ratos controle. (A) gravações consecutivas originais de acendimentos da C-fibra do único dos ratos do controle em resposta à estimulação elétrica de 10 hertz. Cada 20 varredura é mostrada (varreduras consecutivas estavam em intervalos de 2 s) e exibido de cima para baixo. O Inset mostra um potencial de ação representativo. B) gravações de fibras C únicas de ratos com injeção de CFA em resposta à mesma estimulação que no painel A. Este número foi modificado de Wang et al.9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: medida da falha da condução da C-fibra usando preparações de DRG intact com nervo ciático Unido. (A) diagrama esquemático ilustrando a instalação e colocação de preparações de DRG. SE: eletrodo de estimulação; SN: nervo ciático; FM: microscópio de fluorescência; RE: eletrodo de gravação. (B) o espécime inteiro de DRG observado uma vista de 40x, um microeletrodo (sombra direita) foi usado para remendar um Neuron pequeno de DRG. (C) gravações contínuas de respostas de queima de série para estimulação de 5 Hz condições de controle ou administração de diferentes concentrações de ZD7288 em um neurônio DRG de pequeno diâmetro de ratos tratados com CFA. Os inserções mostram traços expandidos para os períodos de gravação especificados. Manchas escuras representam falhas de pico. D) vestígios representativos utilizados para medir a inclinação ascendente do AHP. A inclinação ascendente foi igual à diferença de amplitude entre as tensões máximas e mínimas de AHP (mV) divididas por duração (intervalo de estímulos, em segundos). O painel esquerdo ilustra uma inclinação ascendente mais grande (do primeiro traço no painel C marcado com "*"), e o painel direito mostra uma inclinação de aumentação menor (do quarto traço no painel C marcado com o "#") após a aplicação ZD7288 (125 μM). (E) relação entre o grau de falha de condução e a inclinação ascendente do AHP em resposta a diferentes concentrações de ZD7288. * e # P < 0, 5 vs. controle. Este número foi modificado de Wang et al.9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora os estudos recentes alcangaram a imagem latente do cálcio de neurônios de DRG in vivo16, realizando a gravação in vivo da remendo-braçadeira dos nociceptores individuais de DRG permanecem extremamente desafiantes. Conseqüentemente, uma aproximação in vivo da único-fibra para o campo da dor é da importância de continuação. A gravação da único-fibra no protocolo atual permite a observação objetiva de fenômenos da falha da condução, e a combinação desta técnica com a preparação ex vivo desenvolvida no estudo atual permite a examinação de mecanismos subjacentes no alterações da excitabilidade do nociceptor em modelos pré-clínicos. Três etapas do protocolo de gravação de fibra única são críticas para gravações bem-sucedidas. Primeiro, é fundamental prestar atenção à anestesia do animal. Em experimentos de gravação elaborados in vivo, o comprimento da fibra fina que é enrolado em torno do eletrodo de platina de 29 μm é de apenas 2-3 mm, o que é facilmente interferido durante o processo de gravação. Se a condição anestésica não é particularmente estável, pequenos movimentos dos animais podem levar a falhas de gravação de atividades eletrofisiológicas. Em segundo lugar, a preparação deve ser continuamente coberta com parafina. A finalidade desta manipulação é manter a atividade das fibras. Um entalhe apropriado da gravação foi construído geralmente usando a pele dos animais. Para evitar vazamento de óleo de parafina, a parede do slot pode ser reforçada usando cola super, e óleo de parafina deve ser adicionado sempre que necessário. A fibra não pode secar durante todo o teste. Finalmente, o ambiente em torno do tronco do nervo deve ser mantido saudàvel. Há sempre algum líquido da efusão atual em torno da área da gravação, e esta efusão é um obstáculo para gravações da boa qualidade. A amplitude da atividade da fibra continuará a declinar e tornar-se-á finalmente indistinguível do ruído da linha de base extremo, que causa uma falha da gravação. Um tubo caseiro da seringa é exigido para alcangar profundamente na parte inferior da ranhura para sugar para fora o líquido da efusão. Às vezes, uma bola de algodão Semidry embebido em soro fisiológico também é útil.
No presente estudo, aplicou-se o modelo CFA que produz inflamação dos pés e hiperalgesia após injeção de CFA. Para investigar as propriedades de secreção aferente periférica, bem como os mecanismos subjacentes, nenhum analgésico foi utilizado no experimento, que é uma prática rotineira na pesquisa da dor e é aprovado pelo Comitê de ética/IACUC. O presente estudo apresenta uma técnica de gravação de fibra única in vivo para observar alterações no processo de transmissão que ocorrem nas fibras C nociceptivas fornecidas com estímulos elétricos repetitivos. Demonstrou-se que o grau de falha de condução foi significativamente atenuado em condições hiperalgesicas, mas não foi possível investigar o mecanismo subjacente usando a gravação de fibra única por causa de dificuldades técnicas em remendo-aperto Fibras C. Conseqüentemente, a investigação da relação entre a falha da condução e as mudanças no potencial da membrana de neurônios do pequeno-diâmetro DRG foi detectada usando a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido. Em vez da gravação da único-fibra, remendo-grampo usando tais preparações explora mecanismos AHP-dependentes para a produção de falha da condução. Usando este protocolo, embora somente alguns neurônios de superfície pudessem ser selecionados, o grau de falha da condução a nível de neurônios de DRG era ainda capaz de ser gravado, mesmo com a administração da droga.
O DRG tem duas membranas exteriores: a pia mater espinhal e a dura-máter. A dura-máter deve ser removida usando pinças espiral, e a pia mater espinhal deve ser digerida (digestão moderada, não como série como usado no isolamento de células DRG única) para garantir que os eletrodos de remendo-braçadeira pode chegar à superfície das células DRG para formar um selo; caso contrário, é impossível obter gravações de patch-Clamp. A aproximação atual preserva mais completamente a entrada periférica do nervo comparada às fatias de DRG mais o nervo e assegura-se de que a gravação da remendo-braçadeira de neurônios de DRG seja conseguida facilmente. Este protocolo tem perspectivas de aplicação amplas para melhorar a compreensão do sistema nervoso periférico relacionado à dor, como a investigação de alterações eletrofisiológicas em diferentes neurônios DRG em diferentes modelos de dor crônica17 ,18 e mecanismos moleculares subjacentes à atividade espontânea anormal em DRG com axônios mielinizadas ou não mielinizadas19,20.
A preparação de DRG intacto com o nervo ciático anexado apresentado aqui tem muitas vantagens comparadas ao método dissociada tradicional do gânglio, porque a estrutura do DRG remanesce basicamente ininterrupta nesta preparação. Portanto, simula condições reais in vivo e fornece um microambiente preferível para a atividade fisiológica. A preparação de DRG intacto com nervo ciático anexado produz menos dano neuronal do que a preparação de DRG dissociada porque o último processo usa mais enzimas digestivas e ações físicas externas (por exemplo, cisalhamento e sopro das células), que causa mais danos às células. A maioria dos Estudos eletrofisiológicos ainda são realizados em neurônios de DRG dissociados21,22, e o próprio processo de dissociação danifica as células, o que resulta em hiperexcitações anormais de neurônios23. Outra vantagem deste protocolo é que as atividades eletrofisiológicas aferentes extracelulares também são obtidas porque as projeções nervosas permanecem, o que permite investigações de interações entre picos aferentes e DRG somática espontânea Descargas. Finalmente, esta preparação preserva neurônios DRG e células gliais satélites, e apenas os neurônios DRG permanecem em protocolos de dissociação. As pilhas glial satélites, que são essenciais para manter o microambiente do DRG, são uma barreira que proteja neurônios individuais de DRG24, e estas pilhas justificam um estudo mais adicional.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31671089 e 81470060) e Shaanxi Provincial de desenvolvimento social ciência e tecnologia projeto de pesquisa (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
