Summary
La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.
Abstract
La grabación de una sola fibra ha sido una técnica electrofisiológica clásica y eficaz en las últimas décadas debido a su aplicación específica para las fibras nerviosas en los sistemas nerviosos central y periférico. Este método es particularmente aplicable a los ganglios de raíz dorsal (DRG), que son neuronas sensoriales primarias que exhiben una estructura pseudo-unipolar de los procesos nerviosos. Los patrones y características de los potenciales de acción pasados a lo largo de los axons son grabables en estas neuronas. El presente estudio utiliza grabaciones in vivo de una sola fibra para observar el fallo de conducción de los nervios ciáticos en ratas tratadas con adyuvantes (CFA) completas de Freund. Como el mecanismo subyacente no se puede estudiar utilizando grabaciones in vivo de una sola fibra, las grabaciones de abrazaderas de parche de las neuronas DRG se realizan en preparaciones de DRG intacto con el nervio ciático adjunto. Estas grabaciones revelan una correlación positiva entre la falla de conducción y la pendiente creciente del potencial de hiperpolarización posterior (AHP) de las neuronas DRG en animales tratados con CFA. El protocolo para las grabaciones de fibra individualin vivo permite la clasificación de las fibras nerviosas a través de la medición de la velocidad de conducción y el seguimiento de condiciones anormales en las fibras nerviosas en ciertas enfermedades. El DRG intacto con el nervio periférico conectado permite la observación de la actividad de las neuronas DRG en la mayoría de las condiciones fisiológicas. De manera concluyente, la grabación de una sola fibra combinada con el registro electrofisiológico de DRG intactos es un método eficaz para examinar el papel de la falla de conducción durante el proceso analgésico.
Introduction
La transmisión normal de información a lo largo de las fibras nerviosas garantiza el funcionamiento normal del sistema nervioso. El funcionamiento anormal del sistema nervioso también se refleja en la transmisión de la señal eléctrica de las fibras nerviosas. Por ejemplo, el grado de desmielinización en lesiones de desmielinización central se puede clasificar mediante la comparación de los cambios en la velocidad de conducción nerviosa antes y después de la aplicación de intervención1. Es difícil registrar intracelularmente las fibras nerviosas, excepto en preparaciones especialescomo el axón gigante calamar 2. Por lo tanto, la actividad electrofisiológica sólo se puede grabar a través de la grabación extracelular de fibras individuales. Como uno de los métodos electrofisiológicos clásicos, la grabación de una sola fibra tiene una historia más larga que otras técnicas. Sin embargo, menos electrofisiólogos que entienden este método a pesar de su amplia aplicación. Por lo tanto, se necesita una introducción detallada del protocolo estándar para la grabación de una sola fibra para su aplicación adecuada.
Aunque varias técnicas de abrazaderade parche han dominado el estudio electrofisiológico moderno, la grabación de una sola fibra sigue desempeñando un papel insustituible en el registro de las actividades de las fibras nerviosas, especialmente las fibras que transmiten la sensación periférica con sus cuerpo de células sensoriales ubicado en ganglio de la raíz dorsal (DRG). La ventaja de utilizar la grabación de una sola fibra aquí es que la grabación de fibra in vivo proporciona un largo tiempo de observación con la capacidad de registrar respuestas a estímulos naturales en modelos preclínicos sin perturbación del entorno intracelular3 , 4.
Un número creciente de estudios en las últimas dosdécadas ha examinado funciones complejas a lo largo de las fibras nerviosas 5, y la falla de conducción, que se define como un estado de transmisión de impulso nervioso sin éxito a lo largo del axón, estuvo presente en muchos nervios periféricos6,7. La presencia de fallo de conducción en nuestra investigación sirvió como un mecanismo autoinhibitorio intrínseco para la modulación de la entrada nociceptiva persistente a lo largo de las fibras C8. Esta falla de conducción se atenuó significativamente encondiciones de hiperalgesia 4,9. Por lo tanto, apuntar a los factores involucrados en la insuficiencia de conducción puede representar un nuevo tratamiento para el dolor neuropático. Para observar el fallo de conducción, el patrón de disparo debe registrarse y analizarse sobre la base de picos descargados secuencialmente basados en la grabación de una sola fibra.
Para entender a fondo el mecanismo de fallo de conducción, es necesario identificar las propiedades de transmisión del axón, o más precisamente, las propiedades de la membrana de las neuronas DRG, en función de sus propiedades anatómicas pseudo-unipolares. Muchos estudios previos en este campo se han realizado en neuronas DRG disociadas10,11, que pueden no ser factibles para la investigación de falla de conducción debido a dos obstáculos. En primer lugar, varios métodos mecánicos y químicos se utilizan en el proceso de disociación a las neuronas DRG libres, que puede resultar en células insalubres o alterar el fenotipo / propiedades de las neuronas y confundir los hallazgos. En segundo lugar, los nervios periféricos conectados se eliminan básicamente, y los fenómenos de falla de conducción no son observables en estas preparaciones. Por lo tanto, se ha mejorado una preparación de las neuronas DRG intactas con un nervio unido para evitar los obstáculos antes mencionados.
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Protocol
El protocolo actual siguió la Guía para la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio, y el Comité de la ética de los experimentos con animales de la Cuarta Universidad Médica Militar aprobó el protocolo.
1. Animales
- Divida 24 ratas Sprague-Dawley (4-8 semanas de edad) en dos grupos. Producir el modelo completo de adyuvante de Freund (CFA) mediante inyección intraplantar de 100 ml de CFA en un grupo de 14 ratas y otro grupo de 10 ratas mediante tratamiento con salina.
NOTA: Todos los animales fueron adquiridos del Centro Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar. Las ratas adultas macho y hembra Sprague-Dawley (150-200 g) fueron utilizadas para todos los procedimientos, y las ratas fueron asignadas aleatoriamente a jaulas. Dos ratas fueron alojados por jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas a una temperatura constante (25 o1 oC) con acceso gratuito a alimentos y agua.
2. Grabación in Vivo de una sola fibra
- Preparar y desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos (escalpelo, pinzas, tijeras oftálmicas, tijeras cortantes, aguja de separación de vidrio, aguja de sutura, rongeur óseo) antes de la cirugía. Preparar 1 L o 2 L de la solución extracelular normal de Ringer (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucosa 15; pH 7.4 y 305 mOsm). Conservar a 4oC hasta su uso.
- Anestetizar ratas. Los días 3 a 7 después de la inyección de CFA, utilice la inyección intraperitoneal de una solución mixta (1% de cloralosa y 17% de uretano, 5 ml/kg de peso corporal) para mantener a los animales en una condición estética estable durante el experimento. Aplicar inyección suplementaria de anestésicos, si es necesario, después de comprobar las pupilas y la respuesta a la estimulación del dolor. Controlar y mantener una temperatura corporal cercana a los 37oC.
-
Exposición del tronco del nervio ciático para la grabación
- Cortar la piel y el músculo en la parte dorsal del muslo. Realizar una disección contundente a lo largo de bíceps femoral. Aísle cuidadosamente el tronco del nervio ciático con tijeras oftálmicas y una aguja de separación de vidrio. Mantenga el tejido húmedo con la solución de Ringer.
- Fije al animal en un aro de metal casero (3 cm de largo, aro de metal de 2 mm de ancho con un alambre de hierro de 1 mm de diámetro) a través de la costura de la piel en la ranura a su alrededor. Tire de la piel ligeramente hacia arriba para establecer un baño de líquido.
- Exponga 1 cm de tronco del nervio ciático en el lado proximal. Coloque una pequeña plataforma marrón debajo del tronco nervioso para mejorar el contraste y observar claramente el tronco nervioso fino. Calienta la parafina líquida en un baño de agua a 37oC y colócala en la parte superior del tronco nervioso para evitar el secado de la superficie de la fibra. Retire la pia mater spinalis y dura mater alrededor del nervio ciático.
-
Sesión de grabación
- Seleccione un filamento de platino (29 m de diámetro) como electrodo de grabación. Caliente para facilitar el moldeo y cree un pequeño gancho al final. Conecte el electrodo a un micromanipulador para mover el electrodo según sea necesario.
- En el baño, coloque un electrodo de referencia en el tejido subcutáneo adyacente. Divide la columna vertebral dura y la pia mater. Separe el nervio ciático en una sola fibra (15-20 m de diámetro) en la piscina de registro. A continuación, recoger un fascículo fino de axón y suspender el extremo proximal del axón en el gancho del electrodo de grabación bajo un estereoscopio con aumento de 25x.
NOTA: Los filamentos diseccionados tienden a ser más gruesos y requieren una mayor separación hasta que se puede grabar una sola unidad. - Identificar el campo receptivo de una sola fibra C nociceptiva usando un estímulo mecánico (pelos Von Frey) y estímulo térmico (pequeña bola de algodón con agua de 50-55 oC). Brevemente, si la cocción de la fibra nerviosa responde a los estímulos mecánicos y el agua caliente, entonces considérelo como una fibra C nociceptiva polimodal4. A continuación, inserte dos electrodos de estímulo de aguja (intervalo de 2 mm) en la piel del campo identificado para la administración de estímulos eléctricos.
- Muestre la forma de onda de un potencial de acción en el osciloscopio y emplee una placa A/D de computadora con una frecuencia de muestreo de señal de 20 kHz para amplificar y registrar los picos.
- Recopilar datos utilizando el software de adquisición de datos (Tabla de materiales). Guardar datos en un ordenador y analizar más tarde con software profesional (Tablade Materiales).
3. Medición del fallo de conducción
- Entregar los estímulos eléctricos repetitivos (0,8 ms de duración, intensidad umbral 1,5x) en diferentes frecuencias (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) a una fibra C para 60 s4,8,9. Deje un intervalo de 10 minutos para que la fibra se relaje entre los estímulos. Calcular la relación entre el número de fallos y el número de pulsos de estímulo repetitivo entregados y multiplicar por 100% para obtener el grado de fallo de conducción.
4. Preparación de Iintact DRG Unido con nervio ciático
- Prepare las herramientas quirúrgicas y la solución extracelular de Ringer como se describe en el paso 2.1.
- Separe el DRG con el nervio ciático conectado.
- Anestesiar a las ratas como se describe en el paso 2.2 (En los días 3 a 7 después de la inyección de CFA). Corta el cabello en la espalda y la pierna con tijeras cortantes, y esteriliza la piel con tintura de yodo.
- Para la exposición a DRG, primero corte la piel desde la línea media de la espalda a nivel de segmento L4 a L5. Retire los músculos, el proceso de la columna vertebral, la tabla de vértebras y el proceso transversal utilizando un rongeur óseo para exponer la médula espinal y el cuerpo de DRG. Cubre la médula espinal expuesta y el DRG con algodón infiltrado por la solución extracelular normal de Ringer para mantener la actividad neuronal. Detenga el sangrado y despeje la sangre a tiempo.
- Exponer el nervio ciático desde dos direcciones: eliminar la estructura ósea L4 a S1 por encima del foramen vertebral usando tijeras oftálmicas para exponer el nervio espinal conectado al DRG que está en el extremo proximal del nervio ciático. Abre la piel para exponer el nervio ciático en el muslo medio. Separe y desconecte el nervio ciático del extremo distal del nervio donde va dentro del músculo, y ligar el tronco nervioso con la línea quirúrgica en el extremo del nervio antes de cortar.
- Separe el nervio ciático del tejido conectivo subyacente usando tijeras oftálmicas a través del levantamiento del punto de ligadura nerviosa. Retire la dura de la médula espinal y separe el DRG del tejido conectivo subyacente levantando la raíz dorsal hasta que llegue a la parte adyacente del nervio ciático. Por lo tanto, aislar toda la preparación de DRG con un nervio ciático unido.
- Despeje la superficie del DRG.
- Retire con cuidado la dura espinal en las superficies de L4-L6 DRG usando pinzas bajo un estereoscopio con aumento de 4x.
- Colocar el DRG con nervio ciático unido en un tubo de vidrio que contenga 1 ml de enzimas mixtas (0,2% de proteinasa y 0,32% de colagenasa) y digerir en un baño de agua de 37 oC durante 15 minutos (sopla ligeramente con un gotero de plástico a un intervalo de 5 min).
- Levante el extremo de la línea de ligadura y mueva la preparación a un plato lleno de una solución extracelular normal de Ringer para lavar la enzima. A continuación, transfiera el DRG digerido a un recipiente (Figura1A)lleno de solución extracelular de Ringer oxigenado para la grabación.
- Sesión de grabación
- Preparar la solución intracelular (en mM: gluconato de potasio 120, KCl 18, MgCl2 2, etilenglicol-bis(éter de aminoetilo)-N,N,N',N'ácido tetraacético [EGTA] 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 y 300 mOs). Mantener a 0 oC hasta su uso.
- Estabilice los ganglios usando un ancla de corte y conecte el extremo nervioso a un electrodo que estimula la succión (Figura1A). Visualice y seleccione una neurona DRG con un objetivo de inmersión en agua a aumento de 40x.
- Tire de un electrodo (Tablade Materiales)y llénelo con solución intracelular. Inserte el electrodo en el soporte y aplique presión positiva en la pipeta con una resistencia final de 4-7 M.
- Acerque el electrodo a la célula y tóquelo. Dar una presión negativa en la pipeta, una vez que se alcanza el sello de la g, establecer el potencial de la membrana en unos -60 mV y luego establecer el modo de grabación de células enteras.
- Entregar estímulos repetitivos de 5-50 Hz al nervio ciático a través del electrodo de succión para detectar fallas de conducción. Mida la amplitud del potencial de posthiperpolarización (AHP) desde el inicio hasta el pico, y la duración del 80% del AHP.
NOTA: El análisis unidireccional de varianza (ANOVA; para más de dos grupos) o la prueba t del estudiante (para sólo dos grupos) se utilizó para analizar los datos. Los datos se presentan como medios de error estándar de la media (SEM). El nivel estadístico significativo se estableció en p < 0.05.
- Poner fin al experimento
- Cuando la tarea experimental termina mientras las ratas todavía están en situación anestésica, las ratas son humanmente eutanasiadas con una inyección intracardiaca de sodio pentobarbital por sobredosis.
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Representative Results
El resultado del protocolo de grabación de una sola fibra depende de la calidad de la disección de fibra. El animal para experimentos in vivo debe estar en una buena situación para mantener el tronco nervioso sano para facilitar la disección (ver consejos en la sección de discusión). Un baño de aplicación de drogas es necesario en muchos casos para el suministro de drogas en fibras. La Figura 1 ilustra cómo se accionó la grabación in vivo de una sola fibra (Figura1A)y presenta una grabación clásica del nervio ciático de los animales tratados con CFA (Figura1B).
Los siguientes experimentos investigaron la existencia de un fallo de conducción en animales tratados con CFA. Esta investigación se basó en la suposición de que el fallo de conducción a lo largo de las fibras C nociceptivas era un fenómeno común, y el grado de fallo de conducción se atenuó significativamente en condiciones de hiperalgesia, que son apoyadas por estudios anteriores4,8,9,12. La Figura 2A muestra que se observó un fallo de conducción de fibra C en animales normales. Sin embargo, el grado de fallo de conducción se redujo significativamente después del establecimiento de hiperalgesia inducida por CFA después de la inyección de CFA en el pie en comparación con el control (Figura2B). Estos datos demuestran que la falla de conducción de las fibras C nociceptivas polimodales relevantes para el dolor se atenúa en el modelo CFA del dolor inflamatorio.
Para examinar el mecanismo intracelular durante la falla de conducción, se utilizó lapreparación de DRG intacto con nervio ciático conectado (Figura3A,B). La Figura 3C muestra que dentro de la serie de estímulos, los picos en respuesta a estímulos repetitivos se amontonaron en el potencial anterior de hiperpolarización (AHP) y resultaron en una disminución en la pendiente ascendente del siguiente AHP (Figura3C,D ). La presencia de AHP en pequeñas neuronas DRG potencialmente activa los canales 13, 14, 15 activados por hiperpolarización y modulados por nucleótidos cíclicos (HCN)13,14,15. El efecto acumulativo de AHP desempeña un papel en la ocurrencia de falla de conducción. Por lo tanto, hipotetizó que el bloqueo de canales DE HCN mejoraría significativamente el efecto de fallo de conducción. El siguiente experimento utilizó un bloqueador de canales HCN, ZD7288. Las grabaciones continuas revelaron un aumento en el fallo de conducción en presencia de ZD7288 de una manera dependiente de la concentración. Los recuadros muestran seguimientos expandidos para los intervalos especificados. Se observó una correlación positiva entre la falla de conducción y la pendiente creciente del AHP en pequeñas neuronas DRG de animales tratados con CFA (Figura3E).
Figura 1: Grabaciones in vivo de un solo fibra de los nervios ciáticos de rata. (A) Diagrama esquemático de registro de una sola fibra que indica las regiones para el registro (R) (antes de dividir un filamento para el registro, la pia mater spinalis y la dura mater se eliminaron aquí), la aplicación de fármacos (D), la estimulación (S) y el sitio de CFA Inyección. (B) Registro representativo de una fibra ciática de una sola fibra que exhibe un patrón de disparo tónico. Esta figura ha sido modificada de Wang et al.9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se atenuó el fallo de conducción en ratas tratadas con CFA en comparación con las ratas de control. (A) Grabaciones consecutivas originales de disparos de fibra C individuales de ratas de control en respuesta a la estimulación eléctrica de 10 Hz. Se muestra cada 20o barrido (los barridos consecutivos estaban a intervalos de 2 s) y se muestra de arriba a abajo. El recuadro muestra un potencial de acción representativo. (B) Grabaciones de fibras C individuales de ratas inyectadas en CFA en respuesta a la misma estimulación que en el panel A. Esta cifra ha sido modificada de Wang et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición de la falla de conducción de fibra C utilizando preparaciones de DRG intacto con nervio ciático conectado. (A) Diagrama esquemático que ilustra la configuración y colocación de los preparados DRG. SE: electrodo de estimulación; SN: nervio ciático; FM: microscopio de fluorescencia; RE: electrodo de grabación. (B) Espécimen DRG entero observado bajo una vista 40x, un microelectrodo (sombra derecha) fue utilizado para parchear una pequeña neurona DRG. (C) Grabaciones continuas de respuestas de disparo en serie a estimulación de 5 Hz en condiciones de control o administración de diferentes concentraciones de ZD7288 en una neurona DRG de pequeño diámetro de ratas tratadas con CFA. Los recuadros muestran seguimientos expandidos para los períodos de grabación especificados. Las manchas oscuras representan fallas de pico. (D) Rastros representativos utilizados para medir la pendiente ascendente del AHP. La pendiente ascendente era igual a la diferencia de amplitud entre las tensiones AHP máximas y mínimas (mV) divididas por duración (intervalo de estímulos, en segundos). El panel izquierdo ilustra una pendiente ascendente más grande (a partir del primer trazado en el panel C marcado con "*"), y el panel derecho muestra una pendiente ascendente más pequeña (a partir del cuarto trazado en el panel C marcado con "-") después de la aplicación ZD7288 (125 M). (E) Relación entre el grado de fallo de conducción y la pendiente ascendente del AHP en respuesta a diferentes concentraciones de ZD7288. * y - P < 0.05 contra control. Esta cifra ha sido modificada de Wang et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque estudios recientes han logrado imágenes de calcio de las neuronas DRG in vivo16, realizar la grabación in vivo parche-clamp de nociceptores DRG individuales sigue siendo extremadamente difícil. Por lo tanto, un enfoque in vivo de una sola fibra para el campo del dolor es de importancia continua. El registro de una sola fibra en el presente protocolo permite la observación objetiva de los fenómenos de fallo de conducción, y la combinación de esta técnica con la preparación ex vivo desarrollada en el estudio actual permite el examen de los mecanismos subyacentes en cambios en la excitabilidad del nociceptor en los modelos preclínicos. Tres pasos del protocolo de grabación de una sola fibra son críticos para grabaciones exitosas. En primer lugar, es fundamental prestar atención a la anestesia del animal. En los experimentos de grabación in vivo elaborados, la longitud de la fibra delgada que se envuelve alrededor del electrodo de platino de 29 m es de sólo 2-3 mm, que se interfiere fácilmente durante el proceso de grabación. Si la condición anestésica no es particularmente estable, los pequeños movimientos de los animales pueden conducir a fallos de registro de las actividades electrofisiológicas. En segundo lugar, la preparación debe estar continuamente cubierta con parafina. El propósito de esta manipulación es mantener la actividad de las fibras. Una ranura de grabación apropiada fue generalmente construida usando la piel de los animales. Para evitar fugas de aceite de parafina, la pared de la ranura puede fortalecerse con súper pegamento, y se debe añadir aceite de parafina siempre que sea necesario. La fibra no se puede secar durante toda la prueba. Finalmente, el ambiente alrededor del tronco nervioso debe mantenerse saludablemente. Siempre hay algún líquido de derrame presente alrededor del área de grabación, y este derrame es un obstáculo para grabaciones de buena calidad. La amplitud de la actividad de la fibra seguirá disminuyendo y, en última instancia, se volverá indistinguible del ruido de línea de base extrema, lo que provoca un fallo de grabación. Se requiere un tubo de jeringa casero para llegar profundamente a la parte inferior de la ranura para aspirar el líquido de derrame. A veces, una bola de algodón semiseco empapada en salina también es útil.
En el presente estudio, se aplicó el modelo CFA que produce inflamación del pie e hiperalgesia después de la inyección de CFA. Con el fin de investigar las propiedades de la descarga periférica aferente, así como los mecanismos subyacentes, no se utilizaron analgésicos en el experimento, que es una práctica rutinaria en la investigación del dolor y está aprobado por el comité de IACUC /Ethics. El presente estudio introduce una técnica de grabación in vivo de una sola fibra para observar alteraciones en el proceso de transmisión que se producen en fibras C nociceptivas provistas de estímulos eléctricos repetitivos. Se demostró que el grado de fallo de conducción se atenuó significativamente en condiciones hiperalgésicas, pero no pudimos investigar el mecanismo subyacente utilizando el registro de una sola fibra debido a dificultades técnicas en la sujeción de parches Fibras C. Por lo tanto, la investigación de la relación entre la falla de conducción y los cambios en el potencial de membrana de las neuronas DRG de pequeño diámetro se detectaron utilizando la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto. En lugar de la grabación de una sola fibra, la abrazadera de parche utilizando tales preparaciones explora los mecanismos dependientes de AHP para la producción de fallas de conducción. Usando este protocolo, aunque sólo unas pocas neuronas de superficie podrían ser seleccionadas, el grado de fracaso de conducción a nivel de neuronas DRG todavía era capaz de ser registrado, incluso con la administración de drogas.
DrG tienen dos membranas externas: la pia mater spinalis y dura mater. La dura mater debe eliminarse utilizando pinzas de espiral, y la pia mater spinalis debe ser digerida (digestión moderada, no como se utiliza en el aislamiento de células DRG únicas) para asegurar que los electrodos de abrazadera de parche puedan llegar a la superficie de las células DRG para formar un sello; de lo contrario, es imposible obtener grabaciones de abrazaderas de parche. El enfoque actual preserva más completamente la entrada del nervio periférico en comparación con las rebanadas de DRG más nervio y asegura que la grabación de la abrazadera de parche de las neuronas DRG se logra fácilmente. Este protocolo tiene amplias perspectivas de aplicación para mejorar la comprensión del sistema nervioso periférico perteneciente al dolor, como la investigación de cambios electrofisiológicos en diferentes neuronas DRG en diferentes modelos de dolor crónico17 ,18 y mecanismos moleculares subyacentes a la actividad espontánea anormal en DRG con axones mielinados o no mielinizados19,20.
La preparación de DRG intacto con nervio ciático adjunto presentado aquí tiene muchas ventajas en comparación con el método tradicional de ganglionar disociado, porque la estructura del DRG permanece básicamente ininterrumpida en esta preparación. Por lo tanto, simula condiciones reales in vivo y proporciona un microambiente preferible para la actividad fisiológica. La preparación de DRG intacto con nervio ciático adjunto produce menos daño neuronal que la preparación de DRG disociada porque este último proceso utiliza más enzimas digestivas y acciones físicas externas (por ejemplo, cizallamiento y soplado de las células), que causa más daño a las células. La mayoría de los estudios electrofisiológicos todavía se realizan en las neuronas DRG disociadas21,22, y el proceso de disociación en sí daña las células, lo que resulta en hiperexcitaciones anormales de las neuronas23. Otra ventaja de este protocolo es que también se obtienen actividades electrofisiológicas extracelulares aferentes porque las proyecciones nerviosas permanecen, lo que permite investigaciones de interacciones entre picos aferentes y DRG somático espontáneo Descargas. Finalmente, esta preparación preserva las neuronas DRG y las células gliales satelitales, y sólo las neuronas DRG permanecen en protocolos de disociación. Las células gliales satelitales, que son esenciales para mantener el microambiente del DRG, son una barrera que protege las neuronas DRG individuales24,y estas células justifican un estudio adicional.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31671089 y 81470060) y el Proyecto Provincial de Investigación científica y tecnológica de desarrollo social de Shaanxi (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
