Summary
L'enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s'applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l'échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.
Abstract
L'enregistrement à fibre unique a été une technique électrophysiologique classique et efficace au cours des dernières décennies en raison de son application spécifique pour les fibres nerveuses dans les systèmes nerveux central et périphérique. Cette méthode est particulièrement applicable aux ganglions de racines dorsales (DRG), qui sont des neurones sensoriels primaires qui présentent une structure pseudo-unipolaire des processus nerveux. Les modèles et les caractéristiques des potentiels d'action transmis le long des axones sont enregistrés dans ces neurones. La présente étude utilise des enregistrements in vivo à fibre unique pour observer l'échec de conduction des nerfs sciatiques chez les rats traités par Freund (CFA) traités par Freund's adjuvant complet (CFA). Comme le mécanisme sous-jacent ne peut pas être étudié à l'aide d'enregistrements in vivo à fibre unique, les enregistrements patch-clamp des neurones DRG sont effectués sur les préparations de DRG intact avec le nerf sciatique attaché. Ces enregistrements révèlent une corrélation positive entre l'échec de conduction et la pente montante du potentiel d'après-hyperpolarisation (AHP) des neurones dRG chez les animaux TRAITÉS par CFA. Le protocole pour les enregistrements in vivo de fibres uniques permet la classification des fibres nerveuses par la mesure de la vitesse de conduction et la surveillance des conditions anormales dans les fibres nerveuses dans certaines maladies. DRG intact avec le nerf périphérique attaché permet l'observation de l'activité des neurones de DRG dans la plupart des conditions physiologiques. De façon concluante, l'enregistrement à fibre unique combiné à l'enregistrement électrophysiologique de DrGs intacts est une méthode efficace pour examiner le rôle de l'échec de conduction pendant le processus analgésique.
Introduction
La transmission normale de l'information le long des fibres nerveuses garantit la fonction normale du système nerveux. Le fonctionnement anormal du système nerveux se reflète également dans la transmission du signal électrique des fibres nerveuses. Par exemple, le degré de démyélinisation dans les lésions centrales de démyélinisation peutêtre classifié par comparaison des changements dans la vitesse de conduction de nerf avant et après application d'intervention 1. Il est difficile d'enregistrer intracellulairement les fibres nerveuses, sauf dans les préparations spéciales telles que l'axone géant de calmar2. Par conséquent, l'activité électrophysiologique n'est enregistrable que par l'enregistrement extracellulaire de fibres uniques. Comme l'une des méthodes électrophysiologiques classiques, l'enregistrement à fibre unique a une histoire plus longue que d'autres techniques. Cependant, moins d'électrophysiologistes saisissent cette méthode en dépit de son application étendue. Par conséquent, une introduction détaillée du protocole standard pour l'enregistrement à fibre unique est nécessaire pour son application appropriée.
Bien que diverses techniques de patch-clamp aient dominé l'étude électrophysiologique moderne, l'enregistrement d'une seule fibre joue toujours un rôle irremplaçable en enregistrant les activités des fibres nerveuses, en particulier les fibres transmettant la sensation périphérique avec leur corps cellulaire sensoriel situé dans le ganglion de racine dorsal (DRG). L'avantage d'utiliser l'enregistrement à fibre unique ici est que l'enregistrement in vivo de fibre fournit un long temps d'observation avec la capacité d'enregistrer des réponses aux stimulus normaux dans les modèles précliniques sans perturbation de l'environnement intracellulaire3 , 4.
Un nombre croissant d'études au cours des deux dernières décennies a examiné des fonctions complexes le long des fibres nerveuses5, et l'échec de conduction, qui est défini comme un état de transmission infructueuse d'impulsion nerveuse le long de l'axone, était présent dans beaucoup de différents différents nerfs périphériques6,7. La présence de l'échec de conduction dans notre enquête a servi de mécanisme intrinsèque d'auto-inhibiteur pour la modulation de l'entrée nociceptive persistante le long des c-fibres8. Cette défaillance de conduction a été significativement atténuée dans des conditions d'hyperalgésie4,9. Par conséquent, le ciblage des facteurs impliqués dans l'échec de conduction peut représenter un nouveau traitement pour la douleur neuropathique. Pour observer la défaillance de conduction, le modèle de tir doit être enregistré et analysé sur la base des pointes séquentiellement déchargées basées sur l'enregistrement d'une seule fibre.
Pour bien comprendre le mécanisme de l'échec de conduction, il est nécessaire d'identifier les propriétés de transmission de l'axone, ou plus précisément, les propriétés membranaires des neurones DRG, en fonction de leurs propriétés anatomiques pseudo-unipolaires. Beaucoup d'études précédentes dans ce domaine ont été exécutées sur les neurones dissociés de DRG10,11, qui peuvent ne pas être faisables pour l'étude de l'échec de conduction dû à deux obstacles. Tout d'abord, diverses méthodes mécaniques et chimiques sont utilisées dans le processus de dissociation pour libérer les neurones DRG, ce qui peut entraîner des cellules malsaines ou modifier le phénotype / propriétés des neurones et confondre les résultats. Deuxièmement, les nerfs périphériques attachés sont fondamentalement enlevés, et les phénomènes de défaillance de conduction ne sont pas observables dans ces préparations. Par conséquent, une préparation des neurones dRG intacts avec un nerf attaché a été améliorée pour éviter les obstacles mentionnés ci-dessus.
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Protocol
Le protocole actuel faisait suite à la Politique du Guide for United States Public Health Service sur les soins sans cruauté et l'utilisation des animaux de laboratoire, et le Comité sur l'éthique des expériences animales de la quatrième université médicale militaire a approuvé le protocole.
1. Animaux
- Diviser 24 rats Sprague-Dawley (4-8 semaines) en deux groupes. Produire le modèle complet d'adjuvant de Freund (CFA) par injection intraplantaire de 100 OL de CFA dans un groupe de 14 rats et un autre groupe de 10 rats par traitement à la saline.
REMARQUE : Tous les animaux ont été acquis du Centre animalier de la Quatrième Université Médicale Militaire. Des rats mâles et femelles adultes de Sprague-Dawley (150-200 g) ont été employés pour toutes les procédures, et les rats ont été aléatoirement assignés aux cages. Deux rats ont été logés par cage sous un cycle de lumière/obscurité de 12/12 heures à une température constante (25 o1 oC) avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau.
2. In Vivo Single-fiber Recording
- Préparer et désinfecter tous les instruments chirurgicaux (scalpel, pince à épiler, ciseaux ophtalmiques, ciseaux de cisaillement, aiguille de séparation de verre, aiguille de suture, rongeur d'os) avant la chirurgie. Préparer 1 L ou 2 L de la solution extracellulaire normale de Ringer (en mM : NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glucose 15; pH 7.4 et 305 mOsm). Conserver à 4 oC jusqu'à utilisation.
- Anesthésiez les rats. Les jours 3 à 7 après l'injection de CFA, utilisez l'injection intrapéritonéale d'une solution mixte (1 % de chloralose et 17 % d'uréthane, 5 mL/kg de poids corporel) pour maintenir les animaux dans un état esthétique stable pendant l'expérience. Appliquer l'injection supplémentaire d'anesthésiques, si nécessaire, après avoir vérifié les pupilles et la réponse à la stimulation de la douleur. Surveiller et maintenir une température corporelle proche de 37 oC.
-
Exposition du tronc sciatique de nerf pour l'enregistrement
- Couper la peau et les muscles sur la partie dorsale de la cuisse. Effectuer une dissection émoussée le long des biceps fémoraux. Isoler soigneusement le tronc du nerf sciatique à l'aide de ciseaux ophtalmiques et d'une aiguille de séparation en verre. Gardez le tissu humide à l'aide de la solution de Ringer.
- Fixez l'animal sur un cerceau métallique fait maison (3 cm de long, 2 mm de large cerceau métallique avec un fil de fer de 1 mm de diamètre) en cousant la peau dans la fente autour d'elle. Tirez légèrement la peau vers le haut afin d'établir un bain fluide.
- Exposer 1 cm de tronc nerveux sciatique du côté proximal. Placez une petite plate-forme brune sous le tronc nerveux pour améliorer le contraste et observez clairement le tronc nerveux fin. Chauffer la paraffine liquide dans un bain d'eau à 37 oC et la déposer sur le dessus du tronc nerveux pour empêcher le séchage de la surface de la fibre. Enlever la pia mater spinalis et dura mater autour du nerf sciatique.
-
séance
- Sélectionnez un filament de platine (29 m de diamètre) comme électrode d'enregistrement. Chauffer pour faciliter le moulage, et créer un petit crochet à la toute fin. Fixez l'électrode à un micromanipulateur pour déplacer l'électrode au besoin.
- Dans le bain, placez une électrode de référence dans le tissu sous-cutané adjacent. Diviser la dura spinale et la pia mater. Séparer le nerf sciatique en une seule fibre (15-20 m de diamètre) dans la piscine d'enregistrement. Ensuite, prenez un fascicle fin d'axone et suspendez l'extrémité proximale de l'axone sur le crochet de l'électrode d'enregistrement sous un stéréoscope au grossissement 25x.
REMARQUE: Les filaments juste disséqués ont tendance à être plus épais et nécessitent une séparation plus poussée jusqu'à ce qu'une seule unité puisse être enregistrée. - Identifier le champ réceptif d'une seule fibre C nociceptive à l'aide d'un stimulus mécanique (poils de Von Frey) et d'un stimulus thermique (petite boule de coton avec de l'eau de 50 à 55 oC). En bref, si le tir de la fibre nerveuse répondre aux stimuli mécaniques et à l'eau chaude, puis le considérer comme une polymodal nociceptive C-fibre4. Ensuite, insérez deux électrodes de stimulus d'aiguille (intervalle de 2 mm) dans la peau du champ identifié pour la livraison de stimuli électriques.
- Affichez la forme d'onde d'un potentiel d'action sur oscilloscope et utilisez une carte A/D d'ordinateur avec un taux d'échantillonnage de signal de 20 kHz pour amplifier et enregistrer les pointes.
- Recueillir des données à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données (Tableau des matériaux). Enregistrer des données sur un ordinateur et analyser plus tard avec un logiciel professionnel (Tableau des matériaux).
3. Mesure de l'échec de conduction
- Fournir les stimuli électriques répétitifs (durée de 0,8 ms, intensité seuil de 1,5x) dans différentes fréquences (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) à une fibre C pour 60 s4,8,9. Prévoyez un intervalle de 10 min pour que les fibres se détendent entre les stimuli. Calculez le rapport entre le nombre de défaillances et le nombre d'impulsions de stimulation répétitives livrées et multipliez par 100 % pour obtenir le degré de défaillance conduction.
4. Préparation de DRG Iintact attaché avec le nerf sciatique
- Préparer les outils chirurgicaux et la solution extracellulaire de Ringer tel que décrit à l'étape 2.1.
- Séparer le DRG avec le nerf sciatique attaché.
- Anesthésiez les rats tels que décrits à l'étape 2.2 (les jours 3 à 7 après l'injection de CFA). Couper les cheveux sur le dos et la jambe avec des ciseaux de cisaillement, et stériliser la peau avec une teinture d'iode.
- Pour l'exposition DRG, coupez d'abord la peau de la ligne médiane du dos au niveau du segment L4 à L5. Enlever les muscles, le processus de la colonne vertébrale, le tableau des vertèbres, et le processus transversal à l'aide d'un rongeur d'os pour exposer la moelle épinière et le corps DRG. Couvrez la moelle épinière exposée et le DRG avec des cotons infiltrés par la solution extracellulaire normale de Ringer pour maintenir l'activité neuronale. Arrêtez le saignement et effacez le sang à temps.
- Exposer le nerf sciatique de deux directions: enlever la structure osseuse L4 à S1 au-dessus du foramen vertébral à l'aide de ciseaux ophtalmiques pour exposer le nerf spinal connecté à DRG qui est à l'extrémité proximale du nerf sciatique. Coupez la peau pour exposer le nerf sciatique à la cuisse centrale. Séparez et déconnectez le nerf sciatique de l'extrémité distale du nerf où il va à l'intérieur du muscle, et ligate le tronc de nerf avec la ligne chirurgicale à l'extrémité du nerf avant la coupe.
- Séparez le nerf sciatique du tissu conjonctif sous-jacent à l'aide de ciseaux ophtalmiques par le levage du point de ligature nerveuse. Retirez la dura de la moelle épinière et séparez le DRG du tissu conjonctif sous-jacent en soulevant la racine dorsale jusqu'à ce qu'elle atteigne la partie adjacente du nerf sciatique. Ainsi, isoler toute la préparation de DRG avec un nerf sciatique attaché.
- Dégagez la surface du DRG.
- Retirez soigneusement la dura spinale sur les surfaces de L4-L6 DRG à l'aide d'une pince à épiler sous un stéréoscope au grossissement 4x.
- Placer le DRG avec le nerf sciatique attaché dans un tube de verre contenant 1 ml d'enzymes mélangées (0,2% de protéase et 0,32% de collagène) et digérer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min (souffler légèrement avec un goutte-à-goutte en plastique à un intervalle de 5 min).
- Soulevez l'extrémité de la ligne de ligature et déplacez la préparation vers un plat rempli de la solution extracellulaire d'une ringer normale pour laver l'enzyme. Ensuite, transférez le DRG digéré dans un récipient (Figure 1A) rempli de solution extracellulaire oxygénée de Ringer pour l'enregistrement.
- séance
- Préparer une solution intracellulaire (en mM : gluconate de potassium 120, KCl 18, MgCl2 2, éthylène glycol-bis(ether aminoéthyle)-N,N',N',N',N'-tetraacetic acid [EGTA] 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 et 300 mOsm). Conserver à 0 oC jusqu'à utilisation.
- Stabiliser les ganglions à l'aide d'une ancre de tranche et connecter l'extrémité nerveuse à une électrode stimulant l'aspiration (Figure 1A). Visualisez et sélectionnez un neurone DRG avec un objectif d'immersion dans l'eau à 40x grossissement.
- Tirez une électrode (Table of Materials) et remplissez-la d'une solution intracellulaire. Insérez l'électrode sur le support et appliquez une pression positive dans la pipette avec une résistance finale de 4-7 M.
- Apportez l'électrode près de la cellule et touchez-la. Donner une pression négative dans la pipette, une fois que le joint de G est atteint, définir le potentiel de membrane à environ -60 mV et ensuite établir le mode d'enregistrement à cellule entière.
- Fournir des stimuli répétitifs de 5-50 Hz au nerf sciatique à travers l'électrode d'aspiration à l'écran pour l'échec de conduction. Mesurer l'amplitude du potentiel d'après-hyperpolarisation (AHP) de la ligne de base au pic, et la durée de 80 % du PPH.
REMARQUE: L'analyse à sens unique de la variance (ANOVA; pour plus de deux groupes) ou du test t de l'étudiant (pour seulement deux groupes) a été utilisée pour analyser les données. Les données sont présentées comme des moyens et une erreur standard de la moyenne (SEM). Le niveau statistique significatif a été fixé à p 'lt; 0,05.
- Mettre fin à l'expérience
- Lorsque la tâche expérimentale est terminée alors que les rats sont encore en situation anesthésique, les rats sont euthanasiés sans humains avec une injection intracardiaque de surdosage pentobarbital sodium.
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Representative Results
Le résultat du protocole d'enregistrement à fibre unique dépend de la qualité de la dissection de fibre. L'animal pour les expériences in vivo doit être dans une bonne situation pour garder le tronc nerveux en bonne santé pour une dissection facile (voir les conseils dans la section de discussion). Un bain d'application de drogue est nécessaire dans beaucoup de cas pour la livraison de drogue sur des fibres. La figure 1 illustre comment l'enregistrement in vivo à fibre unique a été exploité (Figure 1A) et présente un enregistrement classique du nerf sciatique des animaux traités par CFA (Figure 1B).
Les expériences suivantes ont étudié l'existence d'une défaillance conduction chez les animaux traités par LAFC. Cette enquête était basée sur l'hypothèse que l'échec de conduction le long des Fibres C nociceptiveétait était un phénomène commun, et le degré de défaillance de conduction a été sensiblement atténué dans des conditions d'hyperalgésie, qui sont soutenues par notre notre études précédentes4,8,9,12. Figure 2A montre que l'échec de conduction de C-fibre a été observé chez les animaux normaux. Cependant, le degré d'échec de conduction a été réduit de manière significative après l'établissement de l'hyperalgésie a-t-elle provoqué par CFA après injection de CFA dans le pied comparé au contrôle (figure 2B). Ces données démontrent que l'échec de conduction des C-fibres nociceptives polymodal pain-pertinentes est atténuée dans le modèle de CFA de la douleur inflammatoire.
Pour examiner le mécanisme intracellulaire pendant l'échec de conduction, la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché a été employée (figure 3A,B). Figure 3C montre que dans la série de stimulus, les pics en réponse aux stimuli répétitifs empilés sur le potentiel précédent après l'hyperpolarisation (AHP) et ont entraîné une diminution de la pente ascendante de l'AHP suivant (Figure 3C,D ). La présence d'AHP dans les petits neurones DRG active potentiellement les canaux de nucléotide cyclique(HCN) activés par hyperpolarisation 13,14,15. L'effet cumulatif de l'AHP joue un rôle dans l'apparition d'une défaillance conduction. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que le blocage des canaux HCN augmenterait considérablement l'effet de défaillance de conduction. L'expérience suivante a utilisé un bloqueur de canaux HCN, ZD7288. Les enregistrements continus ont indiqué une augmentation de l'échec de conduction en présence de ZD7288 d'une manière concentration-dépendante. Les insets montrent des traces étendues pour les intervalles spécifiés. Une corrélation positive entre l'échec de conduction et la pente ascendante de l'AHP chez les petits neurones DRG des animaux traités par CFA a été observée (Figure 3E).
Figure 1 : Enregistrements in vivo à fibre unique des nerfs sciatiques de rat. (A) Diagramme schématique de l'enregistrement à fibre unique indiquant les régions pour l'enregistrement (R) (avant de diviser un filament pour l'enregistrement, la pia mater spinalis et dura mater ont été enlevés ici), l'application de drogue (D), la stimulation (S), et le site de CFA injection. (B) Enregistrement représentatif d'une fibre unique sciatique présentant un modèle de cuisson tonique. Ce chiffre a été modifié à partir de Wang et al.9 Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L'échec de conduction chez les rats traités par CFA a été atténué par rapport aux rats témoins. (A) Enregistrements originaux consécutifs de tirs de fibres C simples de rats témoins en réponse à la stimulation électrique de 10-Hz. Chaque balayage 20e est montré (balayages consécutifs ont été à 2-s intervalles) et affiché de haut en bas. L'enjeu montre un potentiel d'action représentatif. (B) Enregistrements de fibres C simples provenant de rats à injection de FCA en réponse à la même stimulation que dans le panneau A. Ce chiffre a été modifié à partir de Wang et coll.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mesure de l'échec de conduction de C-fibre utilisant des préparations de DRG intact avec le nerf sciatique attaché. (A) Diagramme schématique illustrant la configuration et le placement des préparations DRG. SE: électrode de stimulation; SN: nerf sciatique; FM : microscope à fluorescence; RE: électrode d'enregistrement. (B) Spécimen entier de DRG observé sous une vue 40x, un microélectrode (ombre droite) a été employé pour patcher un petit neurone de DRG. (C) Enregistrements continus des réponses de tir en série à la stimulation de 5-Hz dans des conditions de contrôle ou l'administration de différentes concentrations de ZD7288 dans un neurone DRG de petit diamètre de rats traités par CFA. Les insets montrent des traces élargies pour les périodes d'enregistrement spécifiées. Les taches sombres représentent des défaillances de pointe. (D) Traces représentatives utilisées pour mesurer la pente ascendante de l'AHP. La pente ascendante était égale à la différence d'amplitude entre les tensions maximales et minimales d'AHP (mV) divisées par durée (intervalle de stimuli, en secondes). Le panneau de gauche illustre une plus grande pente ascendante (à partir de la première trace dans le panneau C marqué de « ô »), et le panneau droit montre une plus petite pente montante (de la quatrième trace dans le panneau C marqué avec « ô ») après l'application ZD7288 (125 M). (E) Relation entre le degré d'échec de conduction et la pente ascendante de l'AHP en réponse aux différentes concentrations de ZD7288. et P 'lt; 0.05 vs. Ce chiffre a été modifié à partir de Wang et coll.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien que des études récentes aient atteint l'imagerie calcique des neurones de DRG in vivo16,l'exécution in vivo de l'enregistrement de patch-clamp des nocicepteurs individuels de DRG demeure extrêmement provocante. Par conséquent, une approche in vivo à fibre unique pour le champ de la douleur est d'une importance continue. L'enregistrement à fibre unique dans le protocole actuel permet l'observation objective des phénomènes d'échec de conduction, et la combinaison de cette technique avec la préparation ex vivo développée dans l'étude actuelle permet l'examen des mécanismes sous-jacents dans changements d'excitabilité de nociceptor dans les modèles précliniques. Trois étapes du protocole d'enregistrement à fibre unique sont essentielles pour le succès des enregistrements. Tout d'abord, il est essentiel de prêter attention à l'anesthésie de l'animal. Dans des expériences d'enregistrement in vivo élaborées, la longueur de la fibre mince qui est enroulée autour de l'électrode de platine de 29 m n'est que de 2-3 mm, ce qui est facilement interféré pendant le processus d'enregistrement. Si l'état anesthésique n'est pas particulièrement stable, de minuscules mouvements des animaux peuvent entraîner des défaillances d'apprentissage des activités électrophysiologiques. Deuxièmement, la préparation doit être continuellement recouverte de paraffine. Le but de cette manipulation est de maintenir l'activité des fibres. Une fente d'enregistrement appropriée a été généralement construite en utilisant la peau des animaux. Pour éviter les fuites d'huile de paraffine, la paroi de la fente peut être renforcée à l'aide de super colle, et l'huile de paraffine doit être ajoutée chaque fois que nécessaire. La fibre ne peut pas sécher pendant tout l'essai. Enfin, l'environnement autour du tronc nerveux doit être maintenu sainement. Il y a toujours un peu de liquide d'effusion présent autour de la zone d'enregistrement, et cette effusion est un obstacle pour des enregistrements de bonne qualité. L'amplitude de l'activité de fibre continuera à diminuer et finalement devenir indiscernable du bruit extrême de ligne de base, qui cause une panne d'enregistrement. Un tube de seringue maison est nécessaire pour atteindre profondément dans le fond de la fente pour aspirer le liquide d'épanchement. Parfois, une boule de coton semi-sec imbibée de salin est également utile.
Dans la présente étude, le modèle de CFA a été appliqué qui produit l'inflammation de pied et l'hyperalgésie suivant l'injection de CFA. Afin d'étudier les propriétés de la décharge afferenne périphérique ainsi que les mécanismes sous-jacents, aucun analgésique n'a été utilisé dans l'expérience, qui est une pratique courante dans la recherche sur la douleur et est approuvé par l'IACUC / Comité d'éthique. La présente étude introduit une technique d'enregistrement in vivo à fibre unique pour observer les altérations du processus de transmission qui se produisent dans les fibres C nociceptives fournies avec des stimuli électriques répétitifs. Il a été démontré que le degré de défaillance de conduction était significativement atténué dans des conditions hyperalgesic, mais nous ne pouvions pas étudier le mécanisme sous-jacent utilisant l'enregistrement de mono-fibre en raison des difficultés techniques dans le patch-clamping Fibres C. Par conséquent, l'étude de la relation entre l'échec de conduction et les changements dans le potentiel de membrane des neurones de DRG de petit diamètre ont été détectées utilisant la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché. Au lieu de l'enregistrement à fibre unique, patch-clamp utilisant de telles préparations explore les mécanismes AHP-dépendants pour la production de l'échec de conduction. Utilisant ce protocole, bien que seulement quelques neurones de surface aient pu être choisis, le degré d'échec de conduction au niveau des neurones de DRG était toujours capable d'être enregistré, même avec l'administration de drogue.
DRG ont deux membranes externes : la pia mater spinalis et la dura mater. Le dura mater doit être enlevé à l'aide de pinces à épiler, et le pia mater spinalis doit être digéré (digestion modérée, pas aussi série comme utilisé dans l'isolement des cellules DRG unique) pour s'assurer que les électrodes patch-clamp peut atteindre la surface des cellules DRG pour former un sceau; autrement, il est impossible d'obtenir des enregistrements de patch-clamp. L'approche actuelle préserve plus complètement l'entrée nerveuse périphérique par rapport aux tranches de DRG plus le nerf et garantit que l'enregistrement patch-clamp des neurones DRG est facilement atteint. Ce protocole a de larges perspectives d'application pour améliorer la compréhension du système nerveux périphérique se rapportant à la douleur, telle que l'étude des changements électrophysiologiques dans différents neurones de DRG dans différents modèles de douleur chronique17 ,18 et mécanismes moléculaires sous-jacents à une activité spontanée anormale chez DRG avec des axones myélinisés ou non myélinisés19,20.
La préparation de DRG intact avec le nerf sciatique attaché présenté ici a beaucoup d'avantages comparés à la méthode dissociée traditionnelle de ganglion, parce que la structure du DRG reste fondamentalement ininterrompue dans cette préparation. Par conséquent, il simule des conditions réelles in vivo et fournit un microenvironnement préférable pour l'activité physiologique. La préparation de DRG intact avec le nerf sciatique attaché produit moins de dommages neuronaux que la préparation dissociée de DRG parce que ce dernier processus emploie plus d'enzymes digestives et des actions physiques externes (par exemple, tonte et soufflage des cellules), qui cause plus de dommages aux cellules. La plupart des études électrophysiologiques sont encore effectuées sur les neurones DRG dissociés21,22, et le processus de dissociation lui-même endommage les cellules, ce qui entraîne des hyperexcitations anormales des neurones23. Un autre avantage de ce protocole est que les activités électrophysiologiques extracellulaires afférentes sont également obtenues parce que les projections nerveuses restent, ce qui permet des investigations des interactions entre les pointes afférentes et somatiques DRG spontanée Rejets. Enfin, cette préparation préserve les neurones DRG et les cellules gliales satellites, et seuls les neurones DRG restent dans des protocoles de dissociation. Les cellules gliales satellites, qui sont essentielles pour maintenir le microenvironnement du DRG, sont une barrière qui protègent les neurones DRG individuels24, et ces cellules justifient une étude plus approfondie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par le financement de la National Natural Science Foundation of China (31671089 et 81470060) et du Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
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