Summary
הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.
Abstract
הקלטה חד-סיבי הייתה טכניקת אלקטרופיזיולוגיה קלאסית ואפקטיבית בעשורים האחרונים בגלל היישום הספציפי שלה לסיבי עצב במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. שיטה זו ישימה במיוחד על השורש הבסיסי (DRG), אשר הם נוירונים החושי העיקריים המוצגים מבנה מדומה חד קוטבי של תהליכים העצבים. הדפוסים והתכונות של הפוטנציאל הפעולה המועברים לאורך אקסונים לצריבה אלה נוירונים. המחקר הנוכחי משתמש הקלטות vivo סיב יחיד כדי לבחון את כישלון ההולכה של עצבי מסיבי בתוך השלם של פרוינד מטופלים (פרנק) התייחסו חולדות. כמו המנגנון הבסיסי לא ניתן לחקור באמצעות vivo יחיד סיבים הקלטות, תיקון-קלאמפ-הקלטות של הנוירונים DRG מבוצעים על ההכנות של DRG שלם עם העצב האחורי המצורפת. הקלטות אלה מגלות קורלציה חיובית בין כישלון ההולכה לבין השיפוע העולה של הפוטנציאל לאחר היפרפולריזציה (AHP) של הנוירונים בעלי חיים מטופלים. הפרוטוקול עבור vivo הקלטות סיבים יחיד מאפשר סיווג של סיבי עצב באמצעות מדידת מהירות ההולכה וניטור של מצבים חריגים סיבי העצב במחלות מסוימות. DRG שלמים עם העצב ההיקפי המצורפת מאפשר התבוננות של הפעילות של הנוירונים בסוכרת DRG ברוב התנאים הפיזיולוגיים. באופן סופי, הקלטה של סיב יחיד בשילוב עם הקלטה אלקטרולוגית של DRGs שלמים היא שיטה יעילה לבחון את התפקיד של כשל הולכה במהלך תהליך ההרגעה.
Introduction
התמסורת הנורמלית של המידע לאורך סיבי העצב מבטיחה את התפקוד התקין של מערכת העצבים. תפקוד לא תקין של מערכת העצבים משתקף גם בשידור האות החשמלי של סיבי עצב. לדוגמה, מידת הדמימידינציה בנגעים המיאלואידית המרכזית יכולה להיות מסווגת באמצעות השוואה בין שינויים במהירות הולכה עצבית לפני ואחרי יישום התערבות1. קשה לintracellularly להקליט סיבי עצב, למעט בהכנות מיוחדות כגון אקב הענק הדיונון2. לכן, פעילות אלקטרופיזיולוגית ניתנת להקלטה רק באמצעות הקלטה של סיבים בודדים. בתור אחת השיטות האלקטפיזיולוגיות הקלאסיות, הקלטה של סיבים בודדים יש היסטוריה ארוכה יותר מאשר טכניקות אחרות. עם זאת, פחות פיזיקולוגים האוחזים בשיטה זו למרות היישום הנרחב שלה. לפיכך, נדרשת הקדמה מפורטת של הפרוטוקול הסטנדרטי עבור הקלטה של סיבים בודדים עבור היישום המתאים לו.
למרות טכניקות שונות מלחציים טלאי שלטו מחקר אלקטרולוגי מודרני, הקלטה בודדת סיבים עדיין משחק תפקיד חסר תחליף בהקלטת הפעילויות של סיבי עצב, בעיקר סיבים המשדר תחושה היקפית עם תא חושי הגוף ממוקם גנגליון שורש השורש (DRG). היתרון של שימוש בהקלטה סיב יחיד כאן הוא כי בהקלטה vivo סיבים מספק זמן התבוננות ארוכה עם היכולת להקליט תגובות גירויים טבעיים במודלים פרה-קליניים ללא הפרעה של הסביבה תאיים3 , ד.
מספר גדל והולך של מחקרים בשני העשורים האחרונים בדק פונקציות מורכבות לאורך סיבי עצב5, וכישלון הולכה, אשר מוגדר כמצב של שידור הדחף עצבים שנכשלו לאורך האקסון, היה קיים ברבים שונים עצבי היקפי6,7. הנוכחות של כישלון ההולכה בחקירה שלנו שימש מנגנון מעכבות עצמי מהותי עבור אפנון של קלט nociceptive מתמשך לאורך C-סיבים8. כישלון ההולכה הזה נחלש באופן משמעותי בתנאים של היפראלגברית4,9. לכן, מיקוד הגורמים המעורבים בכישלון ההולכה עשוי לייצג טיפול חדש כאבים נוירופתיים. כדי להתבונן בכישלון ההולכה, דפוס הירי צריך להיות מוקלט ומנותח על בסיס קוצים משוחררים רציפים המבוססים על הקלטה של סיבים בודדים.
כדי להבין ביסודיות את המנגנון של כשל הולכה, יש צורך לזהות את מאפייני השידור של axon, או יותר בדיוק, את תכונות הממברנה של הנוירונים מבוססי DRG, מבוסס על מאפיינים אנטומיים מדומים שלהם-קוטבי. מחקרים קודמים רבים בתחום זה בוצעו על מכשול הנוירונים10,11, אשר עשוי לא להיות ריאלי לחקירת כשל הולכה בשל שני מכשולים. ראשית, שיטות מכני וכימי שונים משמשים בתהליך הדיסוציאציה כדי לשחרר נוירונים DRG, אשר עשוי לגרום לתאים בריאים או לשנות את פנוטיפ/תכונות של הנוירונים ולבלבל את הממצאים. שנית, העצבים ההיקפיים המצורפים יוסרו בעיקרון, ותופעות כישלון ההולכה אינן מסוימות בהכנות אלה. לכן, הכנת נוירונים DRG שלמים עם עצב מוצמד שופרה כדי למנוע את המכשולים הנ ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי עקב אחר המדריך למדיניות הבריאות הציבורית של ארצות הברית בנוגע לטיפול הומאני ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, והוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הצבאית הרביעית אישרה את הפרוטוקול.
1. בעלי חיים
- חלק 24 חולדות ספראג-דאולי (4-8 שבועות) לשתי קבוצות. לייצר את המודל המלא של פרוינד (מודל) על ידי הזרקת הזרקה של 100 μL של פרנק בקבוצה אחת של 14 חולדות וקבוצה אחרת של 10 חולדות על ידי טיפול עם תמיסת מלח.
הערה: כל בעלי החיים נרכשו ממרכז בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הצבאית הרביעית. מבוגרים גברים ועכברים ספראג-דאולי (150-200 g) שימשו עבור כל ההליכים, וחולדות הוקצו באופן אקראי לכלובים. שני חולדות היו שוכנו לכלוב תחת 12/12-שעה מחזור אור/כהה בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° c) עם גישה חופשית למזון ולמים.
2. In Vivo הקלטה בודדת סיבים
- להכין ולחטא את כל כלי הניתוח (אזמל, פינצטה, מספריים אופטלמולוגי, הטיית מספריים, זכוכית הפרדת מחט, תפר המחט, עצם rongeur) לפני הניתוח. להכין 1 L או 2 L של הפתרון הרגיל של המצלצל הצלצול (mM: היום 124, KCl 3, MgSO4 1.3, cacl2 2,נחקו 3 26, נה2פו4 1.25, גלוקוז 15; pH 7.4 ו-305 mosm). החנות ב-4 ° צ' עד השימוש.
- . עכברים מורדם בימים 3 עד 7 לאחר ההזרקה, השתמש בהזרקה בתוך הצפק של פתרון מעורב (1% כלורראלז ו -17% אורטאן, 5 מ ל/ק"ג משקל גוף) כדי לשמור על בעלי החיים במצב אסתטי יציב במהלך הניסוי. החלת הזרקה משלימה של הרדמה, במידת הצורך, לאחר בדיקת אישונים ותגובה לגירוי בכאב. ניטור ושמירה על טמפרטורת גוף ליד 37 ° c.
-
חשיפת גזע העצב הגיד להקלטה
- לחתוך לפתוח את העור ואת השריר על החלק הרך של הירך. לבצע ניתוח קהה לאורך שרירי הירך. לבודד בזהירות את העורק העצבי הגיד באמצעות מספריים אופטלמולוגי ומחט הפרדת זכוכית. שמור על הרקמה רטובה. בעזרת התמיסה של רינגר
- לתקן את החיה על חישוק מתכת תוצרת בית (3 ס מ אורך, 2 מ"מ חישוק מתכת רחב עם חוט ברזל 1 מ"מ בקוטר) באמצעות תפירה את העור לתוך החריץ סביבו. משוך את העור מעט כדי ליצור אמבט נוזלי.
- לחשוף 1 ס מ של גזע העצב הגיד בצד האבובית. מניחים פלטפורמה חום קטן תחת המטען העצבי כדי לשפר את הניגודיות ולהתבונן בעורק העצבי העדין בבירור. חום פרפין נוזלי באמבט מים 37 ° c ושחרר אותו על החלק העליון של הגזע העצבי כדי למנוע ייבוש של המשטח של סיבים. הסירו את הספיליס מאטר ודורא מסביב לעצב הירך.
-
הקלטת מושב
- בחר פילמנט פלטינה (בקוטר 29 יקרומטר) כאלקטרודות ההקלטה. התחמם על היציקה קלה יותר, וצור וו קטן בסופו של דבר. הצמד את האלקטרודה למיקרומניפולציה כדי להעביר את האלקטרודה כנדרש.
- באמבטיה, מניחים אלקטרודה התייחסות ברקמה תת עורית סמוכה. פצל את שדרתי השדרה ואת הפיה. הפרד את העצב החצוף לתוך סיב אחד (15-20 יקרומטר בקוטר) במאגר ההקלטות. לאחר מכן, להרים fascicle קנס של אקסון ולהשעות את הקצה הטוב ביותר של האקסון על הוו של אלקטרודה ההקלטה תחת סטריאוסקופ ב 25x ההגדלה.
הערה: החוטים הניתנים לגזור נוטים להיות עבים יותר ודורשים הפרדה נוספת עד שיחידה אחת עשויה להיות מוקלטת. - לזהות את השדה הפתוח של אחד nociceptive C-סיבים באמצעות גירוי מכני (פון פריי שערות) וגירוי תרמי (כדור כותנה קטן עם 50-55 ° c מים). בקצרה, אם הירי של סיבי עצב להגיב גירוי מכני ומים חמים, אז לשקול את זה כמו nociceptive C-סיבים מכאניים4. בשלב הבא, הכנס שני אלקטרודות גירוי המחט (2 מ"מ מרווח) לתוך העור של השדה המזוהה להעברת גירויים חשמליים.
- הצגת צורת גל של פוטנציאל פעולה באמצעות האולוסקופ ולהעסיק מחשב A/D לוח עם קצב דגימה של 20 kHz כדי להגביר ולהקליט את קוצים.
- איסוף נתונים באמצעות תוכנת רכישת נתונים (טבלת חומרים). שמור נתונים במחשב ונתח מאוחר יותר עם תוכנות מקצועיות (טבלת חומרים).
3. מדידת כשל הולכה
- להעביר את הגירויים החשמליים החוזרים (0.8 ms משך, 1.5 x עוצמת הסף) בתדרים שונים (2 hz, 5 הרץ, 10 hz) כדי C-סיבים עבור 60 s4,8,9. אפשר מרווח של 10 דקות עבור סיבים להירגע בין גירויים. חשב את היחס בין מספר הכשלים למספר הפולסים החוזרים של הגירוי החוזר והכפל ב-100% כדי לקבל את מידת כשל ההולכה.
4. הכנת DRG ללא שינוי מחוברת לעצב הגיד
- הכינו כלים כירורגיים ופתרון מסחטות של הצלצול כמתואר בשלב 2.1.
- הפרד את ה-DRG עם. העצב הנוסף המחובר
- הללו את העכברושים כמתואר בשלב 2.2 (בימים 3 עד 7 לאחר הזרקת הפרנק). חותכים את השיער האחורי והרגל עם מספריים הטיית, ומעקר את העור בתמיסת יוד.
- לחשיפה DRG, לחתוך הראשון לפתוח את העור מהקו האמצע של הגב ברמת L4 to L5 מקטע. להסיר את השרירים, את התהליך של עמוד השדרה, מועצת החוליה, ותהליך רוחבי באמצעות rongeur עצם לחשוף את חוט השדרה ואת הגוף DRG. כסו את חוט השדרה החשוף ו-DRG עם כפות שחדרו לפתרון החילוץ הרגיל של מתחזה לשמירה על פעילות עצבית. עצור את הדימום. ונקה את הדם בזמן
- לחשוף את העצב המגיד משני כיוונים: להסיר את L4 כדי מבנה העצם S1 מעל החוליה השדרה באמצעות מספריים אופטלמולוגי כדי לחשוף את העצב השדרה מחובר DRG אשר נמצא בקצה הגבוה ביותר של עצב. לחתוך את העור כדי לחשוף את העצב הגיד בירך האמצעית. להפריד ולנתק את העצב הקווי מן הקצה המרוחק של העצב שבו הוא הולך בתוך השריר, ולשים את גזע העצב עם קו כירורגי בסוף העצב לפני חיתוך.
- הפרידו את העצב האחורי מרקמת החיבור הבסיסית באמצעות מספריים אופטלמולוגי באמצעות הרמת השימוש בנקודה העצבית. הסר את הדורה מחוט השדרה והפרד את ה-DRG מרקמת החיבור הבסיסית באמצעות הרמת השורש האחורי עד שהוא מגיע לחלק הסמוך של העצב. כך, לבודד את כל ההכנה של DRG עם עצב מוצמד.
- לנקות את פני השטח של DRG.
- הסר בזהירות את שדור השדרה על המשטחים של L4-L6 DRG באמצעות מלקחיים תחת סטריאוסקופ בהגדלה 4x.
- מניחים את DRG עם עצב מוצמד בצינור זכוכית המכיל 1 מ ל של אנזימים מעורבים (0.2% פרוטטינוז ו 0.32% הקולגן) ו לעכל ב 37 באמבט מים ° c עבור 15 דקות (לנשוף מעט עם טפטפת פלסטיק במרווח של 5 דקות).
- הרם את הקצה של קו הקשר והעבר את ההכנה למנה המלאה בתמיסת מסחטות רגילה של המצלצל כדי לשטוף את האנזים. ואז להעביר את DRG מתעכל כדי מיכל (איור 1א) מלא של הצלצול של המצלצל חמצון הפתרון להקלטה.
- הקלטת מושב
- להכין פתרון תאיים (ב mM: אשלגן אדל 120, kcl 18, mgcl2 2, אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-n, n, n '-חומצה טטראצטט [egta] 5, hepes 10, Na2-ATP 5, Na-gtp 0.4, cacl2 1; pH 7.2 ו 300 mosm). שמור על 0 ° צ' עד לשימוש.
- ייצוב גרעינים באמצעות עוגן פרוסה ולחבר את סוף העצב לאלקטרודה ממריצה יניקה (איור 1א). המחש ובחר תא עצב DRG עם מטרה טבילה מים בהגדלה 40x.
- משוך אלקטרודה (הטבלה של חומרים) ולמלא אותו עם פתרון תאיים. הוסף אלקטרודה על המחזיק ולהחיל לחץ חיובי בפיפטה עם עמידות הסופי של 4-7 MΩ.
- הביאי את האלקטרודה קרוב לתא ותגעי בו. תן לחץ שלילי על הפיפטה, לאחר GΩ גושפנקה הגיע, להגדיר את הפוטנציאל הממברנה ב-60 mV ולאחר מכן להקים מצב הקלטה של כל תא.
- לספק גירויים חוזרים של 5-50 הרץ לעצב הגיד דרך אלקטרודות היניקה למסך עבור כשל הולכה. למדוד את משרעת של פוטנציאל היפרפולריזציה (AHP) מ בסיס לשיא, ואת 80% AHP המשך.
הערה: ניתוח בכיוון אחד של סטיה (ANOVA; עבור יותר משתי קבוצות) או מבחן t של סטודנט (עבור שתי קבוצות בלבד) שימש לניתוח הנתונים. נתונים מוצגים כאמצעים ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM). רמת החשיבות הסטטיסטית הוגדרה ב-p < 0.05.
- סיום הניסוי
- כאשר המשימה הניסיונית היא סיימה בזמן החולדות עדיין תחת מצב הרדמה, חולדות הם מורדמים באמצעות הזרקות תאיים של מנת יתר פנטוברביטל נתרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאת פרוטוקול ההקלטה של סיבים בודדים תלויה באיכות של ניתוח הסיבים. החיה עבור ניסויים vivo חייב להיות במצב טוב כדי לשמור על גזע העצב בריא לניתוח קל (ראה עצה בסעיף הדיון). במקרים רבים יש צורך באמבטיית תרופות לאספקת סמים על סיבים. איור 1 ממחיש כיצד vivo ההקלטה בודדת סיבים הופעל (איור 1a) ומציג הקלטה קלאסית אחת מן העצב המסיבי של בעלי חיים שטופלו (איור 1a).
הניסויים הבאים חקרו את קיומו של כשל הולכה בבעלי חיים שטופלו בידי המטופל. החקירה הזאת התבססה על ההנחה שכישלון ההולכה לאורך הסיבים העצמיים הינם תופעה נפוצה, ומידת כישלון ההולכה הייתה מופרית באופן משמעותי בתנאים של היפראלגברית, הנתמכים על ידי לימודים קודמים4,8,9,12. איור 2A מראה כי כישלון ההולכה C-סיבים נצפתה בבעלי חיים נורמליים. עם זאת, מידת כישלון ההולכה הופחת באופן משמעותי לאחר הקמת היפראלגברית המושרה בעקבות הזרקה לתוך כף הרגל בהשוואה לשליטה (איור 2B). נתונים אלה מדגימים כי כישלון ההולכה של הכאב הרלבנטי nociceptive C-סיבים מחליש במודל של כאבים דלקתיים.
כדי לבחון את המנגנון התאיים במהלך כישלון ההולכה, הכנת DRG שלמים עם עצב מוצמד שימש (איור 3A,B). איור 3C מראה כי בתוך הסדרה גירוי, קוצים בתגובה גירויים חוזרים נערמו על הפוטנציאל הקודם אחרי-hyperpolarization (ahp) והביא ירידה במדרון העולה של ahp הבאה (איור 3c,D ). הנוכחות של ahp בנוירונים drg קטן עשוי להפעיל hyperpolarization מופעל, מחזורי נוקלאוטיד-מודנן (מימן) ערוצים13,14,15. ההשפעה המצטברת של AHP ממלאת תפקיד בהתרחשות כשל ההולכה. לכן, אנו שיערו כי חסימת ערוצי מימן משפר באופן משמעותי את אפקט כשל ההולכה. הניסוי הבא השתמש בחוסם הZD7288. הקלטות רציפות חשפו גידול בכישלון ההולכה בנוכחות ZD7288 בצורה תלוית ריכוז. מערכות insets מציגות עקבות מורחבים עבור המרווחים שצוינו. קורלציה חיובית בין כישלון ההולכה לבין השיפוע העולה של AHP בנוירונים DRG קטנים של בעלי חיים שטופלו התייחסו (איור 3E).
איור 1: בהקלטות Vivo בודדות של עצבי עכברים. (א) תרשים סכמטי של הקלטה של סיב יחיד המציין את האזורים להקלטה (R) (לפני פיצול של חוט להקלטה, מאטר הספיליס ו דורא מאטר הוסרו כאן), יישום תרופות (D), גירוי (ים), והאתר של פרנק זרקת. (ב) הקלטה ייצוגית של סיב יחיד מסיבי המייצג תבנית ירי טוניק. דמות זו שונתה מ-וואנג ואח '9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כישלון ההולכה בחולדות שטופלו החליש בהשוואה חולדות שליטה. (א) הקלטות עוקבות מקוריות של מכשירי סי-סיב בודדים מחולדות שליטה בתגובה לגירוי חשמלי של 10 הרץ. כל מטאטא 20 מוצג (מטאטא רצופים היו במרווחים של 2-s) ומוצגים מלמעלה למטה. ההזחה מציגה פוטנציאל של פעולה ייצוגית. (ב) הקלטות של בודד C-סיבים מן החולדות המוזרקים בתגובה לגירוי זהה כמו בלוח A. דמות זו שונתה מ-וואנג et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידת כישלון ההולכה הסיבי באמצעות ההכנות של DRG שלמים עם עצב מוצמד. (א) תרשים סכמטי הממחישות את הכיוונון והמיקום של ההכנות drg. SE: אלקטרודה גירוי; SN: עצב שבטית; FM: מיקרוסקופ פלואורסצנטית; RE: הקלטת אלקטרודה. (ב) כל מדגם drg שנצפו תחת השקפה של 40 x, מיקרואלקטרודה (צל ימני) שימש לתיקון תא העצב הקטן drg. (ג) הקלטות רציפות של התגובות ירי סדרה על גירוי 5-Hz תחת תנאי שליטה או ניהול של ריכוזים שונים של ZD7288 בתוך תא העצב drg בקוטר קטן מחולדות שטופלו. האינטסטים מציגים עקבות מורחבים עבור תקופות ההקלטה שצוינו. כתמים אפלים מייצגים כישלונות של ספייק. (ד) עקבות נציגים המשמשים למדידת השיפוע העולה של ה-ahp. השיפוע העולה היה שווה להפרש בין משרעת המתח המרבי והמינימלי (mV) המחולק לפי משך הזמן (מרווח של גירויים, בשניות). הפאנל השמאלי ממחיש את השיפוע עולה יותר (מהמעקב הראשון בלוח C מסומן עם "*"), והלוח הימני מראה מדרון עולה קטן יותר (מן הסימן הרביעי בלוח C מסומן עם "") לאחר ZD7288 יישום (125 μM). (ה) קשר בין מידת כשלון ההולכה לבין השיפוע העולה של ה-AHP בתגובה לריכוזים שונים של ZD7288. * ו P < 0.05 לעומת שליטה. דמות זו שונתה מ-וואנג et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות המחקרים האחרונים השיגו סידן הדמיה של הנוירונים DRG ב vivo16, ביצוע vivo patch-קלאמפ הקלטה מ-drg בודדים הקלטת נשאר מאתגרת מאוד. לכן, גישה vivo סיב יחיד לשדה הכאב היא בעלת חשיבות מתמשכת. הקלטה של סיבים בודדים בפרוטוקול הנוכחי מאפשרת התבוננות אובייקטיבית של תופעת כישלון ההולכה, ואת השילוב של טכניקה זו עם ההכנה vivo ex שפותחה במחקר הנוכחי מאפשר בחינת המנגנונים הבסיסיים ב קולטן אזעקה מרגש שינויים במודלים פרה-קליניים. שלושה צעדים של פרוטוקול ההקלטה של סיבים בודדים הם קריטיים להקלטות מוצלחות. ראשית, חשוב לשים לב להרדמה של בעל החיים. ב מורכבים vivo הקלטה ניסויים, אורך של סיבים דקים כי הוא עטוף סביב האלקטרודה 29 יקרומטר פלטינה היא רק 2-3 mm, אשר התערב בקלות במהלך תהליך ההקלטה. אם מצב ההרדמה אינו יציב במיוחד, תנועות זעירות של בעלי החיים עלול להוביל הקלטה כשלים של פעילות אלקטרולוגית. שנית, ההכנה חייבת להיות מכוסה ללא הרף עם פרפין. מטרת מניפולציה זו היא לשמור על פעילות הסיבים. חריץ הקלטה מתאים נבנה בדרך כלל באמצעות עור של בעלי חיים. כדי למנוע דליפת שמן פרפין, הקיר של החריץ עשוי להיות מחוזק באמצעות דבק סופר, ו שמן פרפין יש להוסיף מתי שצריך. הסיבים לא יכולים להתייבש. במהלך המבחן כולו לבסוף, הסביבה מסביב לארגז העצבים חייבת להישמר באופן בטוח. יש תמיד כמה נוזל היתוך הנוכחי סביב אזור ההקלטה, והוא מהווה מכשול עבור הקלטות באיכות טובה. משרעת הפעילות הסיבים תמשיך לרדת ובסופו של דבר להיות זהה מרעש בסיס קיצוני, הגורם לכשל הקלטה. שפופרת מזרק תוצרת בית נדרש כדי להגיע עמוק לתוך החלק התחתון של החריץ כדי לשאוב את הנוזל האפיתוך. לפעמים, כדור כותנה חצי יבש ספוגה תמיסת מלח הוא גם מועיל.
במחקר הנוכחי, המודל הוחל המייצר דלקת ברגל והיתר בעקבות הזרקת הנורה. על מנת לחקור את המאפיינים של פריקה היקפית היקפי, כמו גם את המנגנונים הבסיסיים, לא שימשו משככי כאבים בניסוי, שהוא מנהג שגרתי במחקר כאב והוא מאושר על ידי ועדת IACUC/אתיקה. המחקר הנוכחי מציג בטכניקת vivo יחיד סיבים הקלטה להתבונן שינויים בתהליך השידור המתרחשות nociceptive C-סיבים המסופקים עם גירויים חשמליים חוזרים. הוכח, כי מידת כישלון ההולכה הופמכת באופן משמעותי בתנאים היקלשיים, אך לא יכולנו לחקור את המנגנון הבסיסי באמצעות הקלטה של סיבים בודדים בגלל קשיים טכניים בתיקון . סיבי-סי לכן, החקירה של היחסים בין כישלון ההולכה ושינויים בפוטנציאל הממברנה של הנוירונים בקוטר קטן של DRG התגלו באמצעות הכנת DRG שלם עם העצב מוצמד. במקום הקלטה של סיבים בודדים, מלחציים לתיקון באמצעות ההכנות הללו בוחנת מנגנונים התלויים AHP לייצור כשל ההולכה. באמצעות פרוטוקול זה, למרות רק כמה נוירונים פני השטח ניתן לבחור, מידת כישלון ההולכה ברמה של הנוירונים DRG עדיין היה מסוגל להיות מוקלט, אפילו עם מינהל התרופות.
DRG יש שתי הקרומים החיצוניים: מאטר ספיליס ו דורא מאטר. מאטר דורא יש להסיר באמצעות מלקחיים שיער, ואת הספיליס מאטר חייב להיות מתעכל (עיכול מתון, לא כמו סדרה בשימוש בבידוד של תאים DRG יחיד) כדי להבטיח את התיקון-מלחציים-אלקטרודות יכול להגיע אל פני השטח של התאים DRG לטופס חותם; אחרת, אי אפשר להשיג הקלטות קלאמפ. הגישה הנוכחית משמרת לחלוטין את קלט העצב ההיקפי בהשוואה לפרוסות של DRG פלוס העצב ומבטיח כי טלאי-קלאמפ הקלטה של הנוירונים DRG בקלות מושגת. פרוטוקול זה יש הסיכויים יישום נרחב כדי לשפר את ההבנה של מערכת העצבים ההיקפית בנוגע לכאב, כגון החקירה של שינויים אלקטרולוגיים בנוירונים שונים DRG במודלים כרוניים שונים17 ,18 ומנגנונים מולקולריים בבסיס פעילות ספונטנית חריגה ב drg עם אקסונים מיאלואידית או בלתי מיאלואידית19,20.
ההכנה של DRG שלם עם עצב מצורף מוצג כאן יש יתרונות רבים לעומת שיטת גנגליון המסורתית המונתק, כי המבנה של DRG נשאר בעצם נשבר בהכנה זו. לכן, הוא מדמה תנאים אמיתיים ב-vivo ומספק מיקרוסביבה מועדפת לפעילות פיזיולוגית. הכנת מערכת DRG שלמה עם עצב מצורף מייצרת פחות נזק עצבי מאשר הכנה DRG הנתק כי התהליך האחרון משתמש אנזימי העיכול יותר ופעולות פיזיות חיצוניות (g., הטיית ופיצוץ של התאים), אשר גורם לנזק נוסף לתאים. רוב המחקרים אלקטרופיסיולוגיים עדיין מבוצעים על הגוף הנוירונים בתאי הזרע21,22, ואת תהליך הדיסוציאציה עצמו פוגע בתאים, אשר תוצאות היפרמפרוציות נורמלי של נוירונים23. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי לחילוץ פעילויות אלקטרופיסיולוגיים מושגת גם מתקבלים בגלל התחזיות העצבים להישאר, אשר מאפשר חקירות של אינטראקציות בין קוצים הסופראנט ו DRG הסומטיים ספונטנית פרשות. לבסוף, הכנה זו משמרת drg נוירונים ותאי הלווין גליה, ורק הנוירונים drg להישאר פרוטוקולי הדיסוציאציה. לווין תאים גליאל, אשר חיוניים לשמירה על מיקרואקולוגיה של DRG, הם מחסום המגן על נוירונים בודדים DRG24, ותאים אלה צו לימוד נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מימון של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671089 ו 81470060) ו מחוזי שאאנקסי לפיתוח חברתי מדעי וטכנולוגיה פרויקט מחקר (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
