Single-fiber opptak er en effektiv elektrofysiologisk teknikk som gjelder for den sentrale og perifere nervesystemet. Sammen med utarbeidelse av intakt DRG med vedlagte ischias nerven, er mekanismen for Lednings svikt undersøkt. Begge protokollene forbedre forståelsen av perifere nervesystemet forhold til smerte.
Single-fiber innspillingen har vært en klassisk og effektiv elektrofysiologisk teknikk de siste ti årene på grunn av sin spesifikke anvendelse for nervefibre i den sentrale og perifere nervesystemet. Denne metoden er spesielt anvendelig på rygg rot ganglia (DRG), som er primære sensoriske neurons som viser en pseudo-Unipolare struktur av nervøse prosesser. Mønstrene og funksjonene i handlingen potensialer gått langs axons er skrivbar i disse neurons. Den nåværende studien bruker in vivo single-fiber innspillinger for å observere Lednings svikt av ischias nerver i fullstendig Freund ‘ s adjuvant (CFA)-behandlet rotter. Som den underliggende mekanismen ikke kan bli studert ved hjelp av in vivo single-fiber innspillinger, patch-Clamp-innspillinger av DRG neurons utføres på preparater av intakt DRG med vedlagte ischias nerven. Disse opptakene avslører en positiv korrelasjon mellom Lednings svikt og den stigende skråningen av hyperpolarization potensialet (AHP) av DRG neurons i CFA-behandlede dyr. Protokollen for in vivo single fiber-innspillinger gjør at klassifisering av nervefibre via måling av Lednings hastighet og overvåking av unormale forhold i nervefibre i visse sykdommer. Intakt DRG med vedlagt perifer nerve tillater observasjon av aktiviteten til DRG neurons i de fleste fysiologiske forhold. Endelig, Single-fiber opptak kombinert med elektrofysiologisk innspilling av intakt DRGs er en effektiv metode for å undersøke rollen til Lednings svikt under smertestillende prosess.
Den normale overføring av informasjon langs nervefibre garanterer normal funksjon av nervesystemet. Unormal funksjon av nervesystemet er også reflektert i det elektriske signalet overføring av nervefibre. For eksempel kan graden av demyelinisering i sentrale demyelinisering lesjoner klassifiseres via sammenligning av endringer i nerve Lednings hastighet før og etter intervensjon søknad1. Det er vanskelig å intracellulært posten nervefibre, bortsett fra i spesielle forberedelser som blekksprut gigantiske axon2. Derfor er elektrofysiologisk aktivitet bare skrivbar via ekstracellulære innspilling av enkelt fibre. Som en av de klassiske elektrofysiologisk metoder, Single-fiber innspillingen har en lengre historie enn andre teknikker. Men færre electrophysiologists fatte denne metoden til tross for sin omfattende anvendelse. Derfor en detaljert innføring av standardprotokollen for single-fiber opptak er nødvendig for det aktuelle programmet.
Selv om ulike patch-Clamp teknikker har dominert moderne elektrofysiologisk studie, Single-fiber innspillingen fortsatt spiller en uerstattelig rolle i innspillingen av aktiviteter av nervefibre, spesielt fibre overfører perifere sensasjon med sine Sensorisk celle kroppen ligger i rygg rot Ganglion (DRG). Fordelen med å bruke single-fiber innspillingen her er at in vivo fiber innspillingen gir en lang observasjon tid med kapasitet til å registrere svar på naturlige stimuli i prekliniske modeller uten forstyrrelse av intracellulære miljø3 , firetil.
Et økende antall studier de siste to ti årene har undersøkt komplekse funksjoner langs nervefibre5, og Lednings svikt, som er definert som en tilstand av mislykket nerve impuls overføring langs axon, var til stede i mange forskjellige perifere nerver6,7. Tilstedeværelsen av Lednings svikt i etterforskningen vår tjente som en iboende selv hemmende mekanisme for modulering av vedvarende nociceptive innspill langs C-fibre8. Denne Lednings svikt ble betydelig svekket under forholdav hyperalgesia. Derfor, rettet mot de faktorene som er involvert i Lednings svikt kan representere en ny behandling for nevropatisk smerte. For å observere Lednings svikt, skal skyte mønsteret bli registrert og analysert på grunnlag av sekvensielt utladet pigger basert på single-fiber opptak.
For å grundig forstå mekanismen for Lednings svikt, er det nødvendig å identifisere overførings egenskapene til axon, eller mer presist, membran egenskapene til DRG neurons, basert på deres pseudo-Unipolare Anatomiske egenskaper. Mange tidligere studier på dette feltet har blitt utført på dissosiert DRG neurons10,11, som kanskje ikke er gjennomførbart for etterforskningen av Lednings svikt på grunn av to hindringer. Først er ulike mekaniske og kjemiske metoder som brukes i dissosiasjon prosessen til gratis DRG neurons, som kan resultere i usunne celler eller endre fenotype/egenskapene til neurons og forvirre funnene. For det andre, de vedlagte perifere nerver er i utgangspunktet fjernet, og Lednings svikt fenomener er ikke synlig i disse forberedelsene. Derfor har en forberedelse av intakt DRG neurons med en vedlagt nerve blitt forbedret for å unngå ovennevnte hindringer.
Selv om nyere studier har oppnådd kalsium Imaging av DRG neurons in vivo16, utfører in vivo patch-Clamp opptak fra individuelle DRG nociceptors fortsatt svært utfordrende. Derfor, en in vivo single-fiber tilnærming for smerten feltet er av fortsatt betydning. Single-fiber opptak i den nåværende protokollen tillater objektiv observasjon av Lednings svikt fenomener, og kombinasjonen av denne teknikken med ex vivo forberedelse utviklet i dagens studie tillater undersøkelse av underliggende mek…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Natural Science Foundation i Kina (31671089 og 81470060) og Shaanxi provinsielle Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Instruments and software used in single fiber recording | |||
Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
experiment | |||
Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
Instruments and software used in patch clamp recording | |||
Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
Other instruments | |||
Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
Solutions/perfusion/chemicals | |||
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |