Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Использование In Vivo одноволоконной записи и Intact Dorsal Root Ganglion с прикрепленным седалиальным нервом для изучения механизма отказа от проводимости

doi: 10.3791/59234 Published: August 27, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Запись с одним волокном является эффективным электрофизиологическим методом, применимым к центральной и периферической нервной системе. Наряду с подготовкой нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нерва, исследуется механизм отказа проводимости. Оба протокола улучшают понимание отношений периферической нервной системы с болью.

Abstract

Одноволоконная запись была классической и эффективной электрофизиологической техникой в течение последних нескольких десятилетий из-за его специфического применения нервных волокон в центральной и периферической нервной системе. Этот метод особенно применим к корням ганглиев (DRG), которые являются основными сенсорными нейронами, которые демонстрируют псевдо-однополярная структура нервных процессов. Шаблоны и особенности потенциалов действия, передаваемые вдоль аксонов, записываются в этих нейронах. Настоящее исследование использует in vivo одноволоконных записей для наблюдения за отказом проводимости седалищных нервов в адъювантных (CFA) в полном фрейундах. Поскольку основной механизм не может быть изучен с использованием in vivo одноволоконных записей, патч-зажим-записи нейронов DRG выполняются на препаратах нетронутыми DRG с прикрепленным седаличным нервом. Эти записи показывают положительную корреляцию между отказом проводимости и ростом склона после гиперполяризации потенциал (AHP) нейронов DRG в CFA-обработанных животных. Протокол для одноразовых волоконных записей in vivo позволяет классифицировать нервные волокна с помощью измерения скорости проводимости и мониторинга аномальных состояний в нервных волокнах при определенных заболеваниях. Intact DRG с прикрепленным периферическим нервом позволяет наблюдать за активностью нейронов DRG в большинстве физиологических условий. Окончательно, одноволоконная запись в сочетании с электрофизиологической записи нетронутых DRGs является эффективным методом для изучения роли проводки неудачи во время обезболиваного процесса.

Introduction

Нормальная передача информации по нервным волокнам гарантирует нормальную функцию нервной системы. Аномальное функционирование нервной системы также отражается в передаче электрического сигнала нервных волокон. Например, степень демиелинации при поражениях центральной демиелинации можно классифицировать путем сравненияизменений в скорости нервной проводимости до и после применения 1. Трудно внутриклеточного записи нервных волокон, за исключением специальных препаратов, таких как кальмар гигантский аксон2. Таким образом, электрофизиологическая активность записывается только через внеклеточную запись одиночных волокон. Как один из классических электрофизиологических методов, одноволоконная запись имеет более длинную историю, чем другие методы. Тем не менее, меньше электрофизиологов, хватая этот метод, несмотря на его широкое применение. Поэтому для его соответствующего применения необходимо детальное введение стандартного протокола для записи с одним волокном.

Хотя различные методы патч-зажим доминируют современные электрофизиологические исследования, одноволоконная запись по-прежнему играет незаменимую роль в записи деятельности нервных волокон, особенно волокон, передающих периферические ощущения с их сенсорное тело клетки, расположенное в терзаем корнях (DRG). Преимущество использования одноволоконной записи здесь заключается в том, что запись волокна in vivo обеспечивает длительное время наблюдения с возможностью записи реакций на естественные раздражители в доклинических моделях без нарушения внутриклеточной среды3 , 4.

Все большее число исследований за последние два десятилетия изучал сложные функции вдоль нервных волокон5, и проводящий отказ, который определяется как состояние неудачной передачи нервного импульса вдоль аксона, присутствовал во многих различных периферийные нервы6,7. Наличие сбоя проводимости в нашем исследовании служило внутреннеинтрозным самоингуляторным механизмом для модуляциистойких ноцицептивных входных вдоль C-волокон 8. Этот сбой проводимости был значительно ослаблен в условияхгипералгезии 4,9. Таким образом, ориентации факторов, участвующих в отказе проводимости может представлять собой новое лечение невропатической боли. Для наблюдения за сбоем в проводимости, схема стрельбы должна быть записана и проанализирована на основе последовательно разряженных шипов на основе одноволоконной записи.

Чтобы досконально понять механизм отказа проводимости, необходимо определить свойства передачи аксона, а точнее, мембранные свойства нейронов DRG, основанные на их псевдооднополярных анатомических свойствах. Многие предыдущие исследования в этой области были проведены на диссоциированных нейронов DRG10,11, которые не могут быть осуществимы для расследования отказа проводимости из-за двух препятствий. Во-первых, различные механические и химические методы используются в процессе диссоциации, чтобы освободить DRG нейронов, которые могут привести к нездоровым клеткам или изменить фенотип / свойства нейронов и заставить заставить себя свести на нет выводы. Во-вторых, прикрепленные периферийные нервы в основном удаляются, и явления протоиерой неудачи не прослеживаются в этих препаратах. Таким образом, подготовка нетронутых нейронов DRG с прикрепленным нервом была улучшена, чтобы избежать вышеупомянутых препятствий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Нынешний протокол был принят в соответствии с Руководством по политике Службы общественного здравоохранения Соединенных Штатов в области гуманного ухода и использования лабораторных животных, а Комитет по этике экспериментов на животных четвертого военно-медицинского университета утвердил этот протокол.

1. Звери

  1. Разделите 24 крысы Спраг-Доули (4-8 недель) на две группы. Продукция полной адъювантной модели Фрейнда (CFA) путем внутриплантарной инъекции 100 ЗЛ КФА в одной группе из 14 крыс и другой группы из 10 крыс путем лечения сольным раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были приобретены в Центре животных четвертого военно-медицинского университета. Взрослые самцы и самки крыс Спраг-Доули (150-200 г) использовались для всех процедур, а крысы случайным образом отнесались к клеткам. Две крысы были размещены на клетку в 12-/12-часовой свет/темный цикл при постоянной температуре (25 и 1 кВс) с бесплатным доступом к пище и воде.

2. В Vivo одноволоконной записи

  1. Подготовка и дезинфекция всех хирургических инструментов (скальпель, пинцет, офтальмологические ножницы, ножницы для стрижки, стеклооразделительные иглы, швовая игла, костяной ронгер) до операции. Подготовка 1 L или 2 L внеклеточного решения нормального Ringer (в ММ: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2, NaHCO3 26,2PO4 1.25, глюкоза 15; pH 7.4 и 305 mOsm). Хранить при 4 градусах по Цельсию до использования.
  2. Анестезия крыс. В дни от 3 до 7 после инъекции CFA, используйте интраперитонеальной инъекции смешанного раствора (1% хлоралоза и 17% уретана, 5 мл/кг массы тела), чтобы держать животных в стабильном эстетическом состоянии во время эксперимента. Применить дополнительную инъекцию анестезии, при необходимости, после проверки учеников и реакции на стимуляцию боли. Мониторинг и поддержание температуры тела около 37 градусов по Цельсию.
  3. Воздействие ствола седалищаели для записи
    1. Отрежьте кожу и мышцы на подошвальной части бедра. Выполните тупой вскрытие вдоль бедренных бицепсов. Тщательно изолируйте ствол седалищаемых нервов с помощью офтальмологических ножниц и стеклянной разъединительной иглы. Держите ткань влажной с помощью раствора Ringer.
    2. Закрепите животное на самодельном металлическом обруче (длиной 3 см, 2 мм в ширину металлического обруча с железным проводом диаметром 1 мм) через зашивание кожи в слот вокруг него. Потяните кожу немного вверх, чтобы установить жидкости ванны.
    3. Выставить 1 см ствола седалищачего нерва на проксимальной стороне. Поместите небольшую коричневую платформу под нервный ствол для повышения контраста и наблюдать штраф ствол нерва четко. Нагрейте жидкий парафин в водяной бане до 37 градусов по Цельсию и опустите его на верхнюю часть нервного ствола, чтобы предотвратить высыхание поверхности волокна. Удалите пиа-матер spinalis и dura mater вокруг седалищего нерва.
  4. Запись сессии
    1. Выберите платиновую нить (29 мкм в диаметре) в качестве записывающего электрода. Тепло более для облегчения литья, и создать небольшой крюк в самом конце. Прикрепите электрод к микроманипулятору для перемещения электрода по мере необходимости.
    2. В ванне поместите эталонный электрод в соседние подкожные ткани. Разделите спинномозговую дюру и пиа-матер. Разделите седалительный нерв на одно волокно (15-20 мкм в диаметре) в пуле записи. Затем, забрать штраф fascicle аксона и приостановить проксимальный конец аксона на крючок электрода записи под стереоскоп при 25x увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только что расчлененные нити, как правило, толще и требуют дальнейшего разделения до тех пор, пока одна единица может быть записана.
    3. Определите восприимчивое поле одного носицептивного C-волокна с помощью механического стимула (волосы Von Frey) и теплового стимула (маленький ватный шарик с водой 50-55 градусов по Цельсию). Вкратце, если обжига нервного волокна реагирует на механические раздражители и горячую воду, то рассмотрите его как полимодальный ноцицептив Ный C-волокна4. Затем вставьте два электрода стимула иглы (2 мм интервал) в кожу идентифицированного поля для доставки электрических стимулов.
    4. Отобразите волновую форму потенциала действия на осциллоскопе и нанисните компьютер A/D доску с частотой отбора проб сигнала 20 кГц для усиления и записи шипов.
    5. Сбор данных с помощью программного обеспечения для сбора данных(Таблица материалов). Сохранить данные на компьютере и анализировать позже с профессиональным программным обеспечением (Таблица материалов).

3. Измерение сбоя проводимости

  1. Доставка повторяющихся электрических стимулов (0,8 мс продолжительность, 1,5x интенсивность порога) в различных частотах (2 Гц, 5 Гц, 10 Гц) на C-волокна для 60 с4,8,9. Разрешить 10-минутный интервал для волокна, чтобы расслабиться между стимулами. Рассчитайте отношение числа сбоев к числу повторяющихся импульсов стимула и умножайте на 100%, чтобы получить степень сбоя проводимости.

4. Подготовка Iintact DRG прилагается с сиатические нервы

  1. Подготовьте хирургические инструменты и внеклеточное решение Ringer, описанное в шаге 2.1.
  2. Отделить DRG с прикрепленным седаличным нервом.
    1. Анестезия крыс, как описано в шаге 2.2 (В дни от 3 до 7 после инъекции CFA). Вырежьте волосы на спине и ноге ножницами и стерилизуйте кожу настойкой йода.
    2. Для воздействия DRG сначала откройте кожу от средней линии спины на уровне l4 до l5 сегмента. Удалить мышцы, процесс позвоночника, позвонков борту, и поперечный процесс с помощью кости rongeur подвергать спинного мозга и DRG тела. Обложка подвергаются спинного мозга и DRG с хлопками проникли внеклеточного решения нормального Ringer для поддержания нервной активности. Остановите кровотечение и вовремя очистите кровь.
    3. Разоблачить седалищем нервс из двух направлений: удалить L4 к S1 костной структуры выше позвоночных foramen с помощью офтальмологических ножниц подвергать спинного нерва, подключенного к DRG, который находится на проксимальном конце седалищения нерва. Отрежьте кожу, чтобы разоблачить седалищаючий нерв в среднем бедре. Отделить и отключить седалищающее нерв от дистального конца нерва, где он идет внутри мышцы, и ligate ствола нерва с хирургической линии в конце нерва до резки.
    4. Отделите седалирический нерв от основной соединительной ткани с помощью офтальмологических ножниц через подъем точки перевязки нерва. Удалить дюру из спинного мозга и отделить DRG от основной соединительной ткани через подъем спинного корня, пока не достигнет соседней части седалищего нерва. Таким образом, изолировать весь препарат DRG с прикрепленным седаличным нервом.
  3. Очистить поверхность DRG.
    1. Тщательно удалите спинномозговую дюру на поверхностях L4-L6 DRG с помощью пинцета под стереоскопом при 4x увеличении.
    2. Поместите DRG с прикрепленным седалищным нервом в стеклянную трубку, содержащую 1 мл смешанных ферментов (0,2% протеиназа и 0,32% коллагеназа) и переварить в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут (слегка удар пластиковым капельщиком с интервалом в 5 мин).
    3. Поднимите конец линии перевязки и переместите приготовление к блюду, наполненное внеклеточным раствором обычного Ringer, чтобы вымыть фермент. Затем перенесите переваренный DRG в контейнер(Рисунок 1А),наполненный внеклеточным раствором для записи кислородом Ringer.
  4. Запись сессии
    1. Подготовка внутриклеточного раствора (в ММ: глюконат калия 120, KCl 18, MgCl2 2, этиленгликоль-бис (З-аминоэтил эфир)-N,N,N',N', N'-тетраацетической кислоты "EGTA" 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 и 300 mOs). Храните при 0 градусах по Цельсию до использования.
    2. Стабилизировать ганглии с помощью якоря ломтик и подключить нервный конец всасывающего стимулирующего электрода(рисунок 1А). Визуализируйте и выберите нейрон DRG с целью погружения воды при 40-кратном увеличении.
    3. Потяните электрод(Таблицаматериалов) и заполните его внутриклеточным раствором. Вставьте электрод на держатель и нанесите положительное давление в пипетку с окончательным сопротивлением 4-7 МЗ.
    4. Принесите электрод близко к клетке и коснитесь его. Дайте отрицательное давление в пипетке, как только уплотнение G, установите потенциал мембраны на уровне около -60 мV, а затем установите режим записи цельноклеточных элементов.
    5. Доставка повторяющихся стимулов 5-50 Гц к седалищу нерва через всасывающий электрод на экран для отказа проводки. Измерьте амплитуда потенциала послегиперполяризации (AHP) от базового к пику, и 80% продолжительности AHP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных был использован односторонний анализ дисперсии (ANOVA; для более чем двух групп) или T-тест студента (только для двух групп). Данные представлены как средства и стандартная ошибка среднего значения (SEM). Статистически значимый уровень был установлен на уровне p qlt; 0.05.
  5. Завершение эксперимента
    1. Когда экспериментальная задача закончена, в то время как крысы все еще находятся под наркозом, крысы гуманно усыпливается с внутрисердечными инъекциями передозировки пентобарбитального натрия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результат протокола записи с одним волокном зависит от качества вскрытия волокна. Для экспериментов in vivo животное должно быть в хорошей ситуации, чтобы сохранить нервный ствол здоровым для легкого вскрытия (см. совет в разделе обсуждения). Во многих случаях для доставки лекарств на волокна необходима ванна для применения препарата. Рисунок 1 иллюстрирует, как in vivo одноволоконной записи был прооперирован(Рисунок 1A) и представляет одну классическую запись из седалищаемых нервов CFA обработанных животных (Рисунок1B).

Следующие эксперименты исследовали существование сбоя проводимости у обработанных CFA животных. Это исследование было основано на предположении, что сбой проводимости вдоль носикптивных C-волокон был обычным явлением, и степень сбоя проводимости была значительно ослаблена в условиях гипералгезии, которые поддерживаются нашими предыдущиеисследования 4,8,9,12. Рисунок 2A показывает, что сбой проводимости C-волокна наблюдался у нормальных животных. Тем не менее, степень сбоя проводимости была значительно снижена после создания CFA-индуцированной гипералгезии после инъекции CFA в ногу по сравнению с контролем(рисунок 2B). Эти данные свидетельствуют о том, что проводимая недостаточность болевой полимодальной ноцицептивной К-волокна ослаблена в модели CFA воспалительных болей.

Для изучения внутриклеточного механизма во время сбоя проводимости использовался препарат нетронутой DRGс прикрепленным седалитарным нервом (рисунок3A,B). Рисунок 3C показывает, что в рамках серии стимулов, шипы в ответ на повторяющиеся стимулы свалили на предыдущий потенциал после гиперполяризации (AHP) и привело к снижению роста склона следующих AHP (Рисунок 3C,D ). Присутствие AHP в небольших нейронах DRG потенциально активирует гиперполяризацию активированных, циклических нуклеотид-модулированных (HCN) каналов13,14,15. Совокупный эффект AHP играет определенную роль в возникновении сбоя проводимости. Поэтому мы предположили, что блокировка каналов HCN значительно усилит эффект сбоя проводимости. В следующем эксперименте использовался блокировщик каналов HCN, D7288. Непрерывные записи показали увеличение сбоя проводимости в присутствии Зд7288 в концентрационно-зависимым образом. Вставки показывают расширенные следы для указанных интервалов. Наблюдалась положительная корреляция между сбоем проводимости и повышением склона AHP в небольших DRG нейронов CFA-обработанных животных(рисунок 3E).

Figure 1
Рисунок 1: В vivo одноволоконных записей крыс седалищных нервов. (A) Схемаальная диаграмма одноволоконной записи с указанием регионов для записи (R) (до разделения нити для записи, пиа матер spinalis и dura mater были удалены здесь), применение наркотиков (D), стимуляция (S), и сайт CFA Инъекций. (B) Представитель записи седалищего одного волокна, демонстрирующего тонизирующую схему стрельбы. Эта цифра была изменена из Wang et al.9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Отказ проводимой провода у обработанных CFA крыс был ослаблен по сравнению с контрольными крысами. (A) Оригинальные последовательные записи одного C-волокна стрельбы от контроля крыс в ответ на 10-Гц электрической стимуляции. Каждый 20-й развертки показаны (последовательные зачистки были на 2-s интервалы) и отображается сверху вниз. Всет показывает репрезентативный потенциал действия. (B) Записи одного C-волокна от CFA-впрыснутых крыс в ответ на ту же стимуляцию, как в панели А. Эта цифра была изменена из Wang et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Измерение сбоя проводимости C-волокна с использованием препаратов нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нервом. (A) Схема, иллюстрирующая настройку и размещение препаратов DRG. SE: стимуляционный электрод; SN: седалищенный нерв; FM: флуоресцентный микроскоп; RE: запись электрода. (B) Весь образец DRG наблюдается под 40x зрения, микроэлектрод (правая тень) был использован для исправления небольшой нейрон DRG. (C) Непрерывные записи серии стрельбы ответы на 5-Гц стимуляции в условиях контроля или администрации различных концентраций D7288 в малом диаметре DRG нейрон от CFA обработанных крыс. Вставки показывают расширенные следы для указанных периодов записи. Темные пятна представляют собой сбои шипов. (D) Представитель следы, используемые для измерения восходящего склона AHP. Восходящий склон был равен разнице амплитуд между максимальным и минимальным напряжением AHP (mV), разделенным по продолжительности (интервал стимулов, в секундах). Левая панель иллюстрирует больший восходящий наклон (от первого следа в панели C, отмеченный «Я»), а правая панель показывает меньший восходящий наклон (от четвертого следа в панели C, отмеченный «я») после приложения «D7288» (125 мкм). (E) Связь между степенью отказа проводимости и повышением склона AHP в ответ на различные концентрации Зд7288. - и Злт; 0,05 против контроля. Эта цифра была изменена из Wang et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя последние исследования достигли кальция изображения нейронов DRG in vivo16, выполняя in vivo патч-зажим записи от отдельных ноцицепторов DRG остается чрезвычайно сложной задачей. Таким образом, in vivo одноволокнистый подход для болевого поля имеет неотразимую важность. Одноволоконная запись в настоящем протоколе позволяет объективно наблюдать за явлениями срыва проводимости, а сочетание этой техники с препаратом ex vivo, разработанным в текущем исследовании, позволяет изучить основные механизмы в ноцицептивное возбудимое изменение в доклинических моделях. Три этапа протокола записи с одним волокном имеют решающее значение для успешной записи. Во-первых, очень важно обратить внимание на анестезию животного. В сложных in vivo записи экспериментов, длина тонкого волокна, которое обернуто вокруг 29 мкм платиновый электрод только 2-3 мм, который легко вмешивается в процессе записи. Если состояние анестезии не особенно стабильно, крошечные движения животных могут привести к записи сбоев электрофизиологической деятельности. Во-вторых, препарат должен постоянно покрываться парафином. Целью этой манипуляции является поддержание активности волокон. Соответствующий слот для записи, как правило, был построен с использованием кожи животных. Для предотвращения утечки парафина масла, стенка слота может быть усилена с помощью супер клея, и парафина масло должно быть добавлено, когда это необходимо. Волокно не может высохнуть в течение всего теста. Наконец, окружающая среда вокруг нервного ствола должна быть здорово поддерживаться. Существует всегда некоторые выпот жидкости настоящее время вокруг области записи, и это выпот является препятствием для хорошего качества записей. Амплитуда волоконной активности будет продолжать снижаться и в конечном итоге станет неотличимой от экстремального исходного шума, что приводит к сбою записи. Домашняя трубка шприца необходима для достижения глубоко в нижней части слота, чтобы высосать жидкость выпота. Иногда, полусухой ватный шарик, пропитанный сольным также полезно.

В настоящем исследовании была применена модель CFA, которая производит воспаление стопы и гипералгезию после инъекции CFA. Для того, чтобы исследовать свойства периферического афферентного разряда, а также основные механизмы, в эксперименте не использовались анальгетики, что является обычной практикой в исследовании боли и одобрено комитетом IACUC/Ethics. Настоящее исследование вводит in vivo одного волокна записи техники наблюдать изменения в процессе передачи, которые происходят в ноцицептивных C-волокна при условии повторяющихся электрических стимулов. Было продемонстрировано, что степень сбоя проводимости была значительно ослаблена в гипералгетических условиях, но мы не смогли исследовать основной механизм с помощью одноволоконной записи из-за технических трудностей в зажиме патча C-волокна. Поэтому при исследовании взаимосвязи между сбоем проводимости и изменениями мембранного потенциала нейронов DRG малого диаметра были обнаружены с помощью препарата нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нервом. Вместо записи с одним волокном, патч-зажим, использующий такие препараты, исследует зависимые от AHP механизмы для производства сбоя проводимости. Используя этот протокол, хотя только несколько поверхностных нейронов могут быть выбраны, степень сбоя проводимости на уровне нейронов DRG все еще была в состоянии быть записаны, даже с применением препарата.

DRG имеют две внешние мембраны: пиа-матер spinalis и dura mater. Dura mater должны быть удалены с помощью пинцета волос, и пиа-матер spinalis должны быть переварены (умеренное пищеварение, а не как серии, как используется в изоляции отдельных клеток DRG), чтобы гарантировать, что патч-зажим электродов может достичь поверхности клеток DRG в форме печать; в противном случае, невозможно получить записи патч-зажима. Текущий подход более полностью сохраняет периферийный нерв ввода по сравнению с ломтиками DRG плюс нерв и гарантирует, что патч-зажим записи нейронов DRG легко достигается. Этот протокол имеет широкие перспективы применения для улучшения понимания периферической нервной системы, относящейся к боли, такие как исследование электрофизиологических изменений в различных нейронах DRG в различных хронических моделях боли17 ,18 и молекулярных механизмов, лежащих в основе аномальной спонтанной активности в DRG с миелинированными или немиелинированными аксонами19,20.

Подготовка нетронутыми DRG с прикрепленным седаличным нервом представлены здесь имеет много преимуществ по сравнению с традиционным разъединенный метод ганглия, потому что структура DRG остается в основном непрерывной в этой подготовке. Таким образом, он имитирует реальные условия in vivo и обеспечивает предпочтительную микросреду для физиологической активности. Препарат нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нервом производит меньше нейронов, чем разрозненный препарат DRG, потому что последний процесс использует больше пищеварительных ферментов и внешних физических действий (например, стрижка и дует клетки), которые наносит больше вреда клеткам. Большинство электрофизиологических исследований по-прежнему выполняются на диссоциированных нейронов DRG21,22, и процесс диссоциации сам повреждает клетки, что приводит к аномальным гипервозбуждениям нейронов23. Еще одним преимуществом этого протокола является то, что внеклеточные афферентные электрофизиологические действия также получаются, потому что нервные проекции остаются, что позволяет исследования взаимодействий между афферентными шипами и соматическими DRG спонтанными Разрядов. Наконец, этот препарат сохраняет DRG нейронов и спутниковых глиальных клеток, и только DRG нейронов остаются в протоколах диссоциации. Спутниковые глиальные клетки, которые необходимы для поддержания микросреды DRG, являются барьером, который защищает отдельные нейроны DRG24, и эти клетки требуют дальнейшего изучения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансированием со стороны Национального фонда естественных наук Китая (31671089 и 81470060) и Шэньси провинциального проекта по исследованию науки и технологий в области социального развития (2016SF-250).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277, (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42, (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5, (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586, (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91, (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17, (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157, (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21, (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155, (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106, (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89, (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290, (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95, (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22, (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97, (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6, (1), 1-2 (2010).
Использование In Vivo одноволоконной записи и Intact Dorsal Root Ganglion с прикрепленным седалиальным нервом для изучения механизма отказа от проводимости
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).More

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter