Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

इस प्रोटोकॉल में एक मॉडल प्रणाली है जिसमें ब्याज की एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन जीवित जानवरों या कोशिकाओं में बढ़ाया लाख दमनकारी और/या tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग कर सशर्त नियंत्रित किया जा सकता है उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा ।

Abstract

यहां हम दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (रीversible एमanipulation ओएफ टीरैंसक्रिप्शन ईndogenous loci पर), जो एक के प्रतिवर्ती और स्वरित्र अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अनुमति देता है रहने वाले मॉडल सिस्टम में ब्याज की अंतर्जात जीन । रिमोट कंट्रोल सिस्टम एक एकल जैविक प्रणाली के भीतर एक लक्ष्य जीन के नीचे-या upregulation प्राप्त करने के लिए बढ़ाया लाख दमन और टीईटी सक्रियण प्रणाली को रोजगार । तंग दमन दबानेवाला बंधन साइटों flexibly से दूर अनुप्रवाह एक ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने के लिए प्रतिलेखन बढ़ाव के द्वारा साइट के डाउनस्ट्रीम स्थित से प्राप्त किया जा सकता है । मजबूत यूपरेग्लेशन को एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन को बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो कि संजात प्रवर्तक को टीईटी परिसंक्रियक उत्प्रेरक को लक्षित करता है । इस प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति नियंत्रण को लागू किया जा सकता है और जीवों में बार वापस ले लिया । शक्ति और प्रणाली के बहुमुखी प्रतिभा, के रूप में अंतर्जात Dnmt1 यहां के लिए प्रदर्शन किया, और विभिंन अभिव्यक्ति के स्तर पर जीन समारोह की जांच को सक्षम करने से vivo कार्यात्मक विश्लेषण में और अधिक सटीक अनुमति देगा एक की प्रतिवर्त्यता परीक्षण द्वारा Phenotype.

Introduction

जेनेटिक नॉकआउट या ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण प्रभावी तरीके से पशु मॉडलों में जीन समारोह का अध्ययन किया गया है । तथापि, इन दृष्टिकोणों द्वारा अभिव्यक्ति विनियम, गैर-लौकिक, और इस प्रकार एक जीन के पूर्ण कार्यात्मक स्पेक्ट्रम का खुलासा करने में सक्षम नहीं है । सशर्त Cre/LOxp प्रौद्योगिकियों spatio-लौकिक inactivation या जीन समारोह के सक्रियण की अनुमति दी है, लेकिन उनकी द्विभाजी प्रकृति के लिए सीमाओं की तरह जारी है, सेल lethality और अपरिवर्तिता1,2 , 3. इस शूंय को भरने के लिए, सशर्त पछाड़ना दृष्टिकोण tetका उपयोग कर विकसित किया गया है-विनियमित shrna या mirna4। हालांकि, बंद लक्ष्य प्रभाव RNAi5 के लिए एक चिंता का विषय बने रहते हैं और vivo में नियंत्रण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. हाल ही में, crispr/Cas-mediated transcriptional-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों दोनों को प्राप्त करने और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के downregulation के लिए एक अधिक बहुमुखी दृष्टिकोण शुरू की है और अपनी उपयोगिताओं का प्रदर्शन किया6,7 . हालांकि, crispr/Cas-mediated transcriptional नियंत्रण की प्रभावशीलता के रूप में अभी तक vivo में अस्पष्ट है, और krab के प्रतिवर्त्यता-दमन आधारित है देखा जा करने के लिए, krab और उसके बातचीत प्रोटीन KAP1 द्वारा मजबूत दमन के रूप में प्रेरित दिखाया गया है स्थायी जीन साइलेंसिंग८,९.

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम एक उपंयास transcriptional नियामक प्रणाली विकसित किया है सशर्त नियंत्रित करने में सक्षम अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति एक प्रतिवर्ती और स्वरित्र तरीके में चूहों में इंजीनियर प्रोकार्योटिक द्विआधारी transअपंग का उपयोग नियामक प्रणालियां10. प्रोक्योटिक द्विआधारी विनियामकीय नियामक प्रणाली, जैसे कि एलएसी और टीईटी, ने ऐसी प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति को सक्षम किया है नियंत्रण11,12,13, 14. तथापि, वर्तमान द्विआधारी प्रणालियों के अपर्याप्त दमन शक्ति स्तनधारियों में अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए अपने व्यापक अपनाने बाधित है । हम एक बढ़ाया लाख दमन प्रणाली अंतर्जात जीन के दमन के लिए पर्याप्त रूप से शक्तिशाली विकसित की है और एक अंतर्जात जीन के सजात प्रमोटर को प्राप्त करने के लिए tet transcriptional activators सीधे लक्ष्यीकरण की एक उपंयास रणनीति कार्यरत दमदार यूपरेग्लेशन (चित्रा 1)10. इस तकनीक के साथ, हम लगभग दो आदेश प्राप्त की है परिमाण अभिव्यक्ति नियंत्रण अंतर्जात Dnmt1 जीन के एक tunable में, inducible, और प्रतिवर्ती तरीके से10। यहाँ हम एक मॉडल प्रजाति के रूप में चूहों का उपयोग अन्य जीन और जीवों के लिए vivo आवेदन में इसके लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करते हैं.

Figure 1
चित्रा 1 : दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम का ओवरव्यू । अंतर्जात लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को इंजीनियर लाख रप्रेसर और tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग करके विनियमित किया जा सकता है । लक्ष्य जीन प्रमोटर या intron तंग बाध्यकारी LacIGY दमित और/या आरटीटीए M2 उत्प्रेरक के लिए ऑपरेटरों को नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर है । R इंगित करता है Repron (प्रतिनिधिression intrपर), जिसमें 12 सममित lac ऑपरेटर्स (S) प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-ग्लोबिन intron शामिल हैं । T tet ऑपरेटर इंगित करता है । प्रतिकारक और/या उत्प्रेरक एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है । लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति तो reversibly IPTG के प्रशासन द्वारा वांछित अभिव्यक्ति स्तर को देखते किया जा सकता है (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY दबानेवाला का एक विरोधी) या Doxycycline (Dox) । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटोकॉल को प्रारंभ करने से पहले, जीन व्यंजक के वांछित नियंत्रण के लिए प्रासंगिक चरणों की पहचान करने के लिए तालिका 1 की समीक्षा करें. उदाहरण के लिए, एक माउस इंजीनियर है कि "जीन एक्स" के प्रतिवर्ती downregulation सक्षम बनाता है, पूरा अनुभाग 1, 3, और नीचे प्रोटोकॉल के 4 । तालिका 1 दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम के आवश्यक घटकों को भी सारांशित करती है ।

वांछित अभिव्यक्ति परिवर्तन दमन ही केवल सक्रियण दमन और सक्रियण दोनों
प्रोटोकॉल के प्रासंगिक अनुभागों 1, 3-4 2-4 1-4
लक्ष्य जीन में रिमोट कंट्रोल अनुक्रम की जरूरत Repron ("दमन intron"; 12 सममित लाख ऑपरेटरों प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-globin intron) Tet ऑपरेटर (s) Repron और Tet ऑपरेटर (s)
रिमोट कंट्रोल अनुक्रम स्थान Intron प्रमोटर इंट्रॉन & प्रवर्तक
वांछित नियंत्रण के लिए आवश्यक उत्प्रेरक/ LacIGY रप्रेसर rtTA-M2 उत्प्रेरक LacIGY रप्रेसर और rtTA-M2 उत्प्रेरक
रेग्युलेटरी लिगंड्स आईपीटीजी Doxycycline IPTG और/Doxycycline

तालिका 1: दूरस्थ नियंत्रण घटकों का ओवरव्यू ।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय और वैन Andel अनुसंधान संस्थान के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में आयोजित किया गया स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से15।

1. रिमोट कंट्रोल द्वारा दमन के लिए ब्याज के जीन को संशोधित

  1. नीचे दिए गए दिशानिर्देशों का उपयोग करते हुए, Repron अनुक्रम के संमिलन के लिए ब्याज के जीन के 5 ' अंत की ओर एक transtionally अयुक्त intron कीपहचान करें ("प्रतिप र्शन intron"; 12 सममित लाख ऑपरेटरों से अधिक एक आंशिक खरगोश बीटा-ग्लोबिन इनट्रॉन) । हित के जीन के लिए वैकल्पिक प्रमोटरों के बारे में पता है, और प्रतिलिपि (ओं) के अनुसार एक intron का चयन (एक intron सभी टेप या एक वांछित प्रतिलिपि करने के लिए एक विशिष्ट द्वारा साझा किया गया अर्थात्) नियंत्रित करने के लिए ।
    नोट: एक intron के बिना जीन के लिए या 3 ' अंत की ओर लोगों के साथ, प्रमोटर में Repron अनुक्रम डालें (एक विस्तृत प्रक्रिया के लिए ली, एट अल.10 देखें).
    1. हित के जीन के लिए जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें ।
      1. ucsc जीनोम ब्राउज़र16,17के लिए नेविगेट करें, और माउस जीनोम के नवीनतम ड्राफ्ट का चयन (माउस GRCm38/mm10 प्रकाशन के समय), जो वर्तमान में जीनोम टैब के अंतर्गत है ।
      2. जीन के लिए टेप देखने के लिए खोज बार में ब्याज के जीन का नाम या प्रतीक दर्ज करें । जाएंक्लिक करें ।
      3. ब्याज के जीन के लिए वांछित ट्रांसक्रिप्ट वैरिएंट का चयन करें ।
      4. जीन ब्याज के ट्रांसक्रिप्ट संस्करण के बगल में प्रतीक पर क्लिक करें (पहले से चयनित प्रतिलिपि का प्रतीक एक अंधेरे बॉक्स में होगा) ।
      5. अनुक्रम और उपकरण और डेटाबेस बैनर के लिए लिंक के तहत, जीनोमिक अनुक्रम लिंक पर क्लिक करें ।
      6. अनुक्रम पुनर्प्राप्ति क्षेत्र विकल्पके लिए, केवल exons का चयन (5 ' UTR, सीडी, और 3 ' utr), Introns, और डिफ़ॉल्ट एक जीन प्रति fasta रिकॉर्ड. अनुक्रम स्वरूपण विकल्पोंके लिए, ऊपरी मामले में exons का चयन करें, कम मामले में बाकी सब और मुखौटा एन को दोहराता है (दोहराव दृश्यों को छुपाने के लिए) । तब सबमिटकरेंक्लिक करें ।
      7. इस अनुक्रम को सहेजें, ऊपरी-और लोअरकेस स्वरूपण को किसी दस्तावेज़ या प्रोग्राम में रक्षित करें जिसे एनोटेटेड किया जा सकता है ।
    2. CpG द्वीपों, जो जीन नियामक समारोह के साथ क्षेत्रों का संकेत हो सकता है की रुकावट से बचें ।
      नोट: हालांकि एक 5 ' intron repron अनुक्रम के संमिलन के लिए बेहतर है, पहले intron ऐसे cpg द्वीप (इस चरण में जांच) या बढ़ाने तत्वों (कदम 1.1.4 में जांच), जो repron के लिए बचा जा रहे है के रूप में transcriptional नियामक तत्वों को शामिल कर सकते है सम्मिलन.
      1. UCSC जीनोम ब्राउज़र की अभिव्यक्ति और नियमन बैनर के तहत, cpg आइलैंड्स ट्रैक के लिए दिखाएँ का चयन करें, और ताज़ाकरेंक्लिक करे ।
      2. 5 ' introns पर Zooming, प्रत्येक CpG द्वीप पर क्लिक करें (प्रकाशन के समय में हरे रंग में दिखाया गया है अगर वर्तमान), और इस सुविधा के लिए देखें डीएनएचुनें ।
      3. N के लिए मुखौटा दोहराताका चयन करने के बाद, cpg द्वीप अनुक्रम प्राप्त करने के लिए डीएनए प्राप्त करेंका चयन करें ।
      4. मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों ओवरले, और इन intronic क्षेत्रों के रूप में एनोटेट संभव जीन विनियामक कार्यों के कारण से बचने के लिए ।
    3. गैर कोडिंग RNAs की रुकावट से बचें, मामले में वे एक नियामक समारोह है ।
      1. यूएससी जीनोम ब्राउज़र के जीन और जीन भविष्यवाणियों के बैनर के तहत, जेनकोड (Ensembl) ट्रैक के लिए दिखाएँ का चयन करें, और ताज़ाकरेंक्लिक करे ।
      2. 5 ' introns पर Zooming, प्रत्येक गैर पर क्लिक करें-RNA कोडिंग (प्रकाशन के समय में हरे रंग में दिखाया अगर वर्तमान), और अपने गुणसूत्र निर्देशांक पर क्लिक करके प्रत्येक के लिए डीएनए अनुक्रम प्राप्त करते हैं ।
      3. दृश्य ड्रॉपडाउन मेनू में, DNAका चयन करें, और N पर मास्क दोहराताहै उसके बाद डीएनए प्राप्तकरेंक्लिक करें ।
      4. मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों ओवरले, और इन intronic क्षेत्रों के रूप में एनोटेट संभव जीन विनियामक कार्यों के कारण से बचने के लिए ।
    4. ऐसे H3K4me1, H3K27ac, और dnase मैं अतिसंवेदनशीलता18,19,20,21, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ctcf बाध्यकारी के रूप में ब्याज के ऊतक (ओं) में बढ़ाने के हस्ताक्षर के साथ intronic क्षेत्रों से बचें साइटें, जो बढ़ाने पाशन22,23को विनियमित ।
      1. एन्कोड डेटाबेस24,25करने के लिए नेविगेट करें, और प्रयोगों के लिए चिह्न का चयन करें ।
      2. परख प्रकार के लिए, चुनें चिप seq या dnase seq, और अंय श्रेणियों (जीव, biosample प्रकार, आदि) कोशिकाओं को इंजीनियर होने के अनुसार आबाद ।
      3. सुविधा का चयन करने के बाद, नीले रंग में च पर होवर करें, और एक का चयन करें जिसके लिए दृश्य परिणाम के रूप में सूची प्रकट होता है (बाएं-सबसे च प्रकाशन के समय) ।
      4. H3K4me1, H3K27ac, DNase I, और CTCF के लक्ष्यों के लिए डेटासेट का चयन करें जो सबसे निकटता से इंजीनियर बनने वाले कक्षों से मेल खाता है.
      5. प्रत्येक संबंधित डेटासेट में, फ़ाइलों के अनुभाग तक स्क्रॉल करें, जांचें कि mm10 (या नवीनतम जीनोम संस्करण) और ucsc चयनित हैं, और विज़ुअलाइज़ बटन पर क्लिक करें.
      6. अब ucsc जीनोम ब्राउज़र में और ब्याज के जीन के लिए 5 ' introns पर zooming में, प्रत्येक H3K4me1, H3K27ac, dnase मैं, और उनके संबंधित एनोटेट चोटी पटरियों में ctcf चोटी पर क्लिक करें ।
      7. अपने गुणसूत्र निर्देशांक पर क्लिक करके प्रत्येक चोटी क्षेत्र के लिए डीएनए अनुक्रम प्राप्त करें ।
      8. दृश्य ड्रॉपडाउन मेनू में, DNAका चयन करें, और N पर मास्क दोहराताहै उसके बाद डीएनए प्राप्तकरेंक्लिक करें ।
      9. मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों ओवरले, और इन intronic क्षेत्रों के रूप में एनोटेट संभव जीन विनियामक कार्यों के कारण से बचने के लिए ।
    5. सहमति splicing दृश्यों के विघटन से बचें, ताकि exons के उपयुक्त splicing के साथ हस्तक्षेप नहीं है ।
      नोट: हालांकि splicing के लिए आवश्यक दृश्यों मोटे तौर पर एक intron26 और के बारे में ६० कुर्सियां के 5 ' अंत में छह ठिकानों के बारे में सीमित है 3 ' अंत में27, यह एक बड़े intron का चयन करने के लिए उचित है, इन से काफी व्यापक मार्जिन के लिए अनुमति splicing प्रभावित करने की संभावना को कम करने के लिए सहमति क्षेत्रों । intron विश्लेषण उपकरण, जैसे SVM-BPfinder28, का उपयोग संभावित ब्याह दृश्यों का एक और अधिक गहन विश्लेषण के लिए सिफारिश की है ।
  2. एक intronic क्षेत्र है कि उपरोक्त मानदंडों को पूरा करता है की पहचान करने के बाद (के रूप में पूरक डेटा में Dnmt1 के लिए उदाहरण), स्क्रीन अनुक्रम एक ऑनलाइन sgrna डिजाइन उपकरण का उपयोग करने के लिए उच्च विशिष्टता के साथ क्षेत्र में एक sgrna की पहचान और भविष्यवाणी दक्षता स्कोर ।
    1. ऐसे CRISPOR29के रूप में पसंद के एक ऑनलाइन sgRNA डिजाइन उपकरण के लिए नेविगेट करें ।
    2. ब्याज के intronic क्षेत्र के अनुक्रम दर्ज करें, प्रासंगिक संदर्भ जीनोम निर्दिष्ट करें, और वांछित Protospacer आसंन आकृति (पाम) का चयन. सबमिटकरेंक्लिक करें ।
    3. विशिष्टता स्कोर द्वारा भविष्यवाणी sgRNAs क्रमबद्ध करें, और एक या अधिक sgRNAs है कि यह भी एक उच्च अनुमानित दक्षता स्कोर29का चयन करें ।
      1. वैकल्पिक: एक प्रभावी sgRNA का उपयोग करने की संभावना को अधिकतम करने के लिए, पहले कई शीर्ष के क्लीवेज दक्षता परीक्षण में एक विट्रो परख30में Sgrna स्कोरिंग, और vivo में सबसे कुशल sgrna के साथ आगे बढ़ना ।
  3. डिजाइन एक डीएनए एक पिट (उच्चारण इंजेक्शन आधारित लक्षित transgenesis) लैंडिंग पैड अनुक्रम, के रूप में पूरक चित्रा 1aमें उदाहरण के रूप में, बी, ६० द्वारा दोनों पक्षों पर flanked-आधार समजातता शस्त्र है कि sgrna कट साइट के अनुरूप31 .
    नोट: लैंडिंग पैड दो विषमप्ररूपी Loxp साइटों (JT15 और Lox2272) शामिल है और एक दो कदम दृष्टिकोण के माध्यम से बड़े दृश्यों का लक्षित प्रविष्टि को सक्षम बनाता है; सुनिश्चित करें कि इस संमिलन के जंक्शनों गुप्त ब्याह साइटों नहीं बनाते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक भ्रूण स्टेम सेल (ESC) आधारित दस्तक रणनीति Repron अनुक्रम सीधे डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. स्थापित प्रोटोकॉल३२,३३के अनुसार sgrna, Cas9 प्रोटीन, और एकल असहाय डीएनए (ssdna) टेंपलेट लैंडिंग पैड के लिए तैयार है, और निषेचित अंडे में microinject (B6C3F1/जे चूहों या अंय वांछित तनाव से) ।
  5. लैंडिंग पैड दस्तक के साथ चूहों के लिए स्क्रीन ।
    1. डिजाइन पीसीआर जीनोमिक के लिए पूरक प्राइमरों लेकिन समजातता हथियार द्वारा लक्षित क्षेत्रों के बाहर, के रूप में पूरक चित्रा 1 सीमें Dnmt1 के लिए प्रदर्शन किया । दोहराव जीनोमिक दृश्यों से बचें जब primers डिजाइनिंग ।
    2. स्थापित प्रोटोकॉल३४के अनुसार चूहों की पूंछ क्लिप से डीएनए निकालें ।
    3. एक लैंडिंग पैड प्रविष्टि के साथ चूहों की पहचान करने के लिए पीसीआर और जेल ट्रो का प्रयोग करें ।
    4. पुष्टि करें कि नॉक-इन पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण द्वारा सफल रहा था ।
      नोट: अवांछित बड़े हटाए गए और rearrangements crispr/Cas9३५द्वारा प्रस्तुत किया जा सकता है, इसलिए बंद लक्ष्य संपादन के लिए सावधान स्क्रीनिंग३५,३६,३७आगे बढ़ने से पहले सलाह दी जाती है ।
  6. लैंडिंग पैड चूहों से निषेचित अंडे का उपयोग करना, microinjection icre एमआरएनए३८ और एक ट्रांसजेनिक प्लाज्मा repron अनुक्रम युक्त JTZ17 और Lox2272 पुनर्संयोजन साइटों द्वारा flanked31,३९,४०, ४१ स्थापित विधियों के अनुसार३८,४२,४३.
  7. Repron प्रविष्टि के साथ चूहों के लिए स्क्रीन ।
    1. डिजाइन पीसीआर के जीनोमिक के लिए पूरक प्राइमरों, repron डालने के बाहर locus । दोहराव जीनोमिक दृश्यों से बचें जब primers डिजाइनिंग ।
    2. स्थापित प्रोटोकॉल३४के अनुसार चूहों की पूंछ क्लिप से डीएनए निकालें ।
    3. एक Repron प्रविष्टि के साथ चूहों की पहचान करने के लिए पीसीआर और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का प्रयोग करें ।
    4. पुष्टि करें कि नॉक-इन पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण करके सफल रहा ।

2. रिमोट-कंट्रोल द्वारा यूप्रेगुलेशन के लिए ब्याज के जीन को संशोधित करें

  1. नीचे दिए गए दिशानिर्देशों का उपयोग करना, ब्याज के जीन के प्रमोटर में एक क्षेत्र की पहचान करना जो tet ऑपरेटर दृश्यों के संमिलन पर प्रोत्साहक कार्य करने की संभावना नहीं है । हित के जीन के लिए वैकल्पिक प्रमोटरों के बारे में पता हो, और प्रतिलिपि (ओं) के अनुसार एक प्रमोटर का चयन (एक प्रमोटर सभी टेप या एक वांछित प्रतिलिपि के लिए विशिष्ट द्वारा साझा) नियंत्रित किया जाना है ।
    1. हित के प्रवर्तक के लिए जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें ।
      1. ucsc जीनोम ब्राउज़र16,17के लिए नेविगेट करें, और माउस जीनोम के नवीनतम ड्राफ्ट का चयन (माउस GRCm38/mm10 प्रकाशन के समय), जो वर्तमान में जीनोम टैब के अंतर्गत है ।
      2. जीन के लिए टेप देखने के लिए खोज बार में ब्याज के जीन का नाम या प्रतीक दर्ज करें । जाएंक्लिक करें ।
      3. ब्याज के जीन के लिए वांछित ट्रांसक्रिप्ट वैरिएंट का चयन करें ।
      4. जीन ब्याज के ट्रांसक्रिप्ट संस्करण के बगल में प्रतीक पर क्लिक करें (पहले से चयनित प्रतिलिपि के जीन प्रतीक एक अंधेरे बॉक्स में होगा) ।
      5. अनुक्रम और उपकरण और डेटाबेस बैनर के लिए लिंक के तहत, जीनोमिक अनुक्रम लिंक पर क्लिक करें ।
      6. अनुक्रम रिट्रीवल क्षेत्र विकल्पोंके लिए, १००० आधारों तक केवल प्रवर्तक/अपस्ट्रीमका चयन करें । अनुक्रम स्वरूपण विकल्पोंके लिए, का चयन करें मास्क दोहराता N करने के लिए (दोहराए जाने वाले दृश्यों को छुपाने के लिए) । तब सबमिटकरेंक्लिक करें ।
      7. इस प्रमोटर अनुक्रम को किसी दस्तावेज़ या प्रोग्राम में सहेजें जिसे एनोटेटेड किया जा सकता है ।
    2. उन क्षेत्रों का चयन करें जो ख्यात ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग साइट्स से मुक्त हैं, इन दृश्यों को बाधित करने से अंतर्जात जीन व्यंजक में परिवर्तन हो सकता है ।
      1. UCSC जीनोम ब्राउज़र पर नेविगेट करें, और माउस जीनोम का नवीनतम संस्करण खोलें ।
      2. मैपिंग और अनुक्रमण बैनर के ऊपर, ट्रैक हबका चयन करें ।
      3. जसपर २०१८ TFBS (या नवीनतम जसपर संस्करण) के हब नाम के आगे mm10 क्लिक करें ।
      4. जीन के लिए टेप देखने के लिए खोज बार में ब्याज के जीन का नाम या प्रतीक दर्ज करें । जाएंक्लिक करें ।
      5. ब्याज के जीन के लिए वांछित ट्रांसक्रिप्ट वैरिएंट का चयन करें ।
      6. जासपर २०१८ TFBS बैनर के नीचे स्क्रॉल करें, और ट्रैक के लिए वांछित देखने के विकल्प का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन तीर पर क्लिक करे, जैसे कि squish. ताज़ाकरेंक्लिक करें ।
      7. ब्याज के जीन के प्रवर्तक क्षेत्र में ज़ूम करें, और जसपर ट्रैक के अनुसार प्रतिलेखन फैक्टर बाइंडिंग साइटों के स्वतंत्र (या अपेक्षाकृत मुक्त) क्षेत्रों की पहचान । इन क्षेत्रों के गुणसूत्र निर्देशांक रिकॉर्ड ।
      8. इन गुणसूत्र निर्देशांक के जीनोमिक अनुक्रम उन्हें खोज पट्टी में टाइप करके और जाओपर क्लिक करके प्राप्त करें । दृश्य ड्रॉपडाउन मेनू में, DNAका चयन करें, और N पर मास्क दोहराताहै उसके बाद डीएनए प्राप्तकरेंक्लिक करें ।
      9. मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों उपरिशाई, और इन आदर्श प्रवर्तक क्षेत्रों के रूप में एनोटेट प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी की कमी के कारण लक्ष्य के लिए ।
    3. इन दृश्यों के भीतर, एक परेशान प्रवर्तक क्षेत्र है कि ऊपर है, लेकिन ब्याज के जीन के प्रतिलेखन शुरू साइट के पास का चयन करें ।
      नोट: प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के लिए बहुत बंद है एक संमिलन प्रमोटर गतिविधि को बिगड़ने का मौका बढ़ सकता है, लेकिन बहुत दूर है एक प्रविष्टि upregulation का स्तर कम हो सकता है । tet ऑपरेटर अनुक्रम डालने के बारे में २०० basepairs प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के ऊपर दो प्रमोटरों के मजबूत upregulation में हुई है परीक्षण (देखें चर्चा)10।
  2. एक ऑनलाइन sgRNA डिजाइन उपकरण का उपयोग कर चयनित प्रवर्तक क्षेत्र स्क्रीन उच्च विशिष्टता और भविष्यवाणी की दक्षता स्कोर के साथ क्षेत्र में एक sgRNA की पहचान करने के लिए ।
    1. ऐसे CRISPOR29के रूप में पसंद के एक ऑनलाइन sgRNA डिजाइन उपकरण के लिए नेविगेट करें ।
    2. ब्याज के क्षेत्र के अनुक्रम दर्ज करें, प्रासंगिक संदर्भ जीनोम निर्दिष्ट करें, और वांछित Protospacer आसंन आकृति (पाम) का चयन । सबमिटकरेंक्लिक करें ।
    3. विशिष्टता स्कोर द्वारा भविष्यवाणी sgRNAs क्रमबद्ध करें, और एक या अधिक sgRNAs है कि यह भी एक उच्च अनुमानित दक्षता स्कोर29का चयन करें ।
      1. वैकल्पिक: एक प्रभावी sgRNA का उपयोग करने की संभावना को अधिकतम करने के लिए, पहले एक विट्रो परख30में कई Sgrna के क्लीवेज दक्षता परीक्षण, और vivo में सबसे कुशल sgrna के साथ आगे बढ़ना ।
  3. डिजाइन एक डीएनए टेंपलेट युक्त tet ऑपरेटरों ६० द्वारा दोनों पक्षों पर flanked-आधार समजातता हथियार है कि sgrna कट साइट31,३३के अनुरूप ।
    नोट: tet ऑपरेटर्स की संख्या अनुकूलन योग्य है; दो से चार tet ऑपरेटर दृश्यों का प्रवेशन अग्रानुक्रम में पहले से प्रभावी होना दिखाया गया है, लेकिन सिद्धांत रूप में अधिक ऑपरेटरों उच्च अभिव्यक्ति ड्राइविंग के लिए वांछनीय हैं । वैकल्पिक रूप से, एक ESC-आधारित नॉक-इन कार्यनीति का उपयोग tet ऑपरेटर्स को सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है.
    1. वैकल्पिक: के लिए प्रयोगात्मक सबूत है कि प्रस्तावित संशोधनों की संभावना ब्याज के जीन के अंतर्जात अनुवांशिक गतिविधि बाधित नहीं होगा, एक जुगनू luciferase वेक्टर में इंजीनियर प्रमोटर अनुक्रम क्लोन (जैसे pGL3-Basic), और इसकी प्रभावोत्पादकता की तुलना मूल प्रवर्तक से करें ।
  4. स्थापित प्रोटोकॉल३२,३३के अनुसार sgrna, Cas9 प्रोटीन, और ssdna टेम्पलेट युक्त tet ऑपरेटर दृश्यों, और निषेचित अंडे (B6C3F1/जे चूहों या अन्य वांछित तनाव से) में microinject तैयार.
    नोट: एक दोहराव अनुक्रम synthesizing की जटिलता के कारण, एक विट्रो transcription/रिवर्स transcription आधारित दृष्टिकोण एक डबल-फंसे डीएनए (dsDNA) प्लाज्मिड४४से एक ssdna टेम्पलेट synthesizing करने के लिए सिफारिश की है । वैकल्पिक रूप से, एक dsDNA टेंपलेट microinjection के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन दस्तक में दक्षता४५कम किया जा सकता है ।
  5. tet ऑपरेटरों की दस्तक के साथ चूहों के लिए स्क्रीन ।
    1. डिजाइन पीसीआर जीनोमिक के लिए पूरक प्राइमरों, समजातता हथियार द्वारा लक्षित क्षेत्रों के बाहर । दोहराव जीनोमिक दृश्यों से बचें जब primers डिजाइनिंग ।
    2. स्थापित प्रोटोकॉल३४के अनुसार चूहों की पूंछ क्लिप से डीएनए निकालें ।
    3. टीईटी संचालकों के सम्मिलन के साथ चूहों की पहचान के लिए पीसीआर और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का इस्तेमाल करें ।
    4. पुष्टि करें कि नॉक-इन पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण द्वारा सफल रहा था ।
      नोट: अवांछित बड़े हटाए गए और rearrangements crispr/Cas9३५द्वारा प्रस्तुत किया जा सकता है, इसलिए बंद लक्ष्य संपादन के लिए सावधान स्क्रीनिंग३५,३६,३७आगे बढ़ने से पहले सलाह दी जाती है ।

3. विकसित उत्प्रेरक-और/या repressor-चूहों व्यक्त

  1. ऊतक (ओं) या कोशिका प्रकार (ओं) के हित के लिए एक रोही व्यक्त करने वाले प्रमोटर को पहचानें ।
    नोट: एक साहित्य खोज और ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर डाटाबेस४६ इस तरह के एक प्रमोटर की पहचान के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  2. एक ट्रांसजेनिक निर्माण उत्पन्न करने के लिए वांछित प्रमोटर के प्रदान की गई बढ़ी हुई लाख रप्रेसर या tet उत्प्रेरक अनुक्रम अनुप्रवाह प्लेस ।
  3. ट्रांसजेनिक माउस लाइन (एस) का उत्पादन मानक ट्रांसजेनिक प्रक्रियाओं४२,४३,४७का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, एक साइट विशिष्ट transgenesis दृष्टिकोण स्थिति प्रभाव से बचने के लिए और एकल प्रतिलिपि transgenesis प्रविष्टि31,४८की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. संस्थापकों का प्रचार करें, और प्रत्येक संस्थापक की संतानों में अभिव्यक्ति पैटर्न और transgene के स्तर का निर्धारण । आगे प्रजनन के लिए इरादा ऊतक प्रकार (ओं) में मजबूत अभिव्यक्ति के साथ लाइनों का चयन करें ।
    1. संस्थापकों को वाइल्डटाइप चूहों में नस्ल ।
    2. डिजाइन पीसीआर प्राइमरों कि उत्प्रेरक की प्रविष्टि का पता लगाने जाएगा और/
    3. स्थापित प्रोटोकॉल३४के अनुसार वंश की पूंछ क्लिप से डीएनए निकालें ।
    4. प्रविष्टि के साथ चूहों की पहचान करने के लिए पीसीआर और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें ।
    5. पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण द्वारा transgene प्रविष्टि की पुष्टि करें ।
    6. ट्रांसजेनिक लाइनों को प्रोपोगेट करना ।
    7. प्रत्येक पंक्ति से कुछ पिल्ले बलिदान, और qrt-पीसीआर, immunohistochemistry के लिए ब्याज के ऊतकों को इकट्ठा, और/या पश्चिमी सोख्ता को लक्ष्य ऊतक प्रकार (ओं) में ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण ।
    8. अनुभाग 4 में उपयोग के लिए ब्याज के ऊतकों में सबसे मजबूत अभिव्यक्ति के साथ लाइनों का चयन करें ।

4. विवो में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर

  1. की स्थापना की प्रजनन प्रथाओं४९के अनुसार धारा 3 से ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ब्याज के संशोधित जीन के साथ चूहों नस्ल (खंड 1 और/या 2) । अधिकतम अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए, चूहों संशोधित एलील के लिए समयुग्मज करने के लिए नस्ल ।
  2. लक्ष्य जीन के दमन के पुनर्संस्करण या समायोजन के लिए, पीने के पानी में IPTG प्रशासन ।
    1. प्रयोगात्मक iptg की खुराक का उपयोग करने के लिए निर्धारित करने के लिए, खुराक की एक सीमा में से एक के साथ उपयुक्त जीनोटाइप और नियंत्रण के चूहों का इलाज (शुरू करने की सिफारिश की रेंज: 0 – ४०० मिमी iptg) से कम एक सप्ताह के लिए५०,५१. उपचार समूह के अनुसार कम से कम तीन चूहों को शामिल करें, और आयु और चूहों कि सबसे नियोजित भविष्य के प्रयोगों के लिए प्रासंगिक है की सेक्स का चयन. नोट: चूहों के प्रजनन जोड़ों IPTG पानी के साथ इलाज किया जा सकता है वंश को IPTG के विकास के जोखिम प्रदान अगर वांछित13, या चूहों के इलाज के जंम के बाद किसी भी समय शुरू कर सकते हैं ।
      1. प्रशासन के दिन बाँझ आसुत पानी में IPTG के वांछित जन भंग, और 5 मिनट के लिए एक हलचल पट्टी के साथ हलचल या जब तक पूरी तरह से भंग ।
      2. पंनी के साथ बोतल लपेटें, और एक प्रकाश की रक्षा की बोतल में IPTG पानी प्रशासन । सप्ताह में दो बार बदलें । 0 मिमी IPTG प्राप्त चूहों को पानी का एक ही स्रोत प्रदान करते हैं ।
      3. एक सप्ताह के बाद, चूहों बलिदान, और लक्ष्य ऊतक (ओं) qRT-पीसीआर, immunohistochemistry का उपयोग करने में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, और/
      4. खुराक है कि वाइल्डटाइप नियंत्रण के लिए ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पुनर्स्थापित करता है, और भविष्य के प्रयोगों में जीन की सामांय अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए इस खुराक का उपयोग की पहचान ।
  3. जीन यूपरेगुलेशन को शामिल करने के लिए आहार में दोक्शयस्यकलीन (Dox) का प्रबंध करें ।
    1. प्रायोगिक रूप से करने के लिए प्रशासन की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, उचित जीनोटाइप के चूहों का इलाज और डॉक्स सांद्रता की एक सीमा के साथ नियंत्रण (शुरू करने की सिफारिश की रेंज: 0-५००० मिलीग्राम/केजी Doxycycline Hyclate) कम एक सप्ताह के लिए५२ ,५३, उपचार समूह के अनुसार कम तीन चूहों सहित । एक वाणिज्यिक विक्रेता से डॉक्स युक्त माउस खाना खरीद ।
      नोट: चूहों के प्रजनन जोड़ों के लिए डॉक्स भोजन के साथ इलाज किया जा सकता है अगर वांछित५४,५५, या चूहों जंम के बाद किसी भी समय उपचार शुरू कर सकते है वंश के लिए dox के विकास के जोखिम प्रदान करने के लिए ।
    2. प्रति सप्ताह एक बार आहार बदलें । डॉक्स मुक्त भोजन प्राप्त चूहों को एक ही आधार आहार प्रदान करें ।
    3. एक सप्ताह के बाद, चूहों बलिदान, और लक्ष्य ऊतक (ओं) qRT-पीसीआर, immunohistochemistry का उपयोग करने में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, और/
    4. खुराक है कि वांछित स्तर तक ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति उठ, और इस खुराक का उपयोग करने के लिए भविष्य के प्रयोगों में जीन की overexpression प्राप्त पहचानें ।

Representative Results

रिमोट कंट्रोल सिस्टम की दमन क्षमता दो अलग दृष्टिकोण में इस प्रकार दूर प्रदर्शन किया गया है । पहले दृष्टिकोण में, lac दबानेवाला बंधन साइटों Dnmt1 जीन के अंतर्जात प्रमोटर में डाला गया । दूसरे दृष्टिकोण में, जो इस प्रोटोकॉल द्वारा सिफारिश की है, दबानेवाला बंधन साइटों को एक डाउनस्ट्रीम intron में सम्मिलित किया गया था और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल के आवेदन को सरल बनाने के लिए प्रविष्टि द्वारा प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के संभावित जोखिम से बचने के लिए प्रणाली. दोनों दृष्टिकोण सफल दमन में हुई (चित्रा 2ए, बी और चित्रा 3a-C)10। Dnmt1 अभिव्यक्ति प्रमोटर आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर अनियमित स्तरों के 15% के लिए दमन किया गया था (चित्रा 2ए) । इस तंग दमन IPTG (चित्रा 2ए) के अलग मात्रा के साथ चूहों के इलाज के द्वारा एक खुराक पर निर्भर तरीके से उलट गया था । मनाया Dnmt1 दमन immunostaining द्वारा प्रोटीन स्तर पर मान्य किया गया था (चित्रा 2बी). हम Dnmt1के बीच Dnmt1 अभिव्यक्ति में कोई उल्लेखनीय अंतर का पालन नहीं किया+/+ और Dnmt1lo/लो चूहों, पुष्टि कि हमारे lac ऑपरेटर प्रविष्टि सामांय प्रमोटर बाधित नहीं था समारोह10. intron आधारित दृष्टिकोण कम प्रतिलेखन बढ़ाव (चित्रा 3ए, बी)10द्वारा प्रतिलेखन शुरू साइट के कई किलोबेसेस डाउनस्ट्रीम स्थित ऑपरेटरों से अधिक से अधिक ९०% दमन हासिल किया । इस इनट्रॉन आधारित एप्रोच को सात अतिरिक्त दमदार प्रमोटरों (चित्रा 3सी) पर आगे मान्य किया गया । परीक्षण किए गए सभी प्रवर्तकों से निरपवाद रूप से कडी दमन किया गया । अवशिष्ट अभिव्यक्ति के स्तर और प्रवर्तकों की ताकत के बीच कोई संबंध नहीं देखा गया था, सुझाव है कि हमारे intron के दमन की क्षमता आधारित दमन प्रणाली मजबूत प्रमोटरों हम परीक्षण के सभी के transcriptional शक्ति से अधिक है ( चित्रा 3 ग) ।

रिमोट कंट्रोल सिस्टम की वीवो यूपरेग्लेशन कैपेबिलिटी में Dnmt1 जीन पर भी प्रदर्शन किया गया । हम Dnmt1 प्रमोटर में tet ऑपरेटर की दो प्रतियां शुरू की, एक साथ लाख ऑपरेटर दृश्यों के साथ, या तो upregulation या downregulation के आधार पर जो effector प्रोटीन मौजूद है के लिए अनुमति देते हैं । Dnmt1 व्यंजक का दमदार अपरेग्लेशन और डाउनरेगुलेशन, परिमाण के दो आदेशों (10% से ६५०%) के करीब, ईएससीएस में प्राप्त किए गए थे जिसमें संशोधित अंतर्जात Dnmt1 एलील (Dnmt1LGT) (चित्र 4ए)10 . दोनों नियमों को पूरी तरह से पलटवाँ और IPTG और डॉक्स उपचार, क्रमशः (चित्रा 4ए) द्वारा inducible थे । हम अगले माउस जर्मलाइन में Dnmt1LGT संशोधन शुरू की दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo upregulation क्षमता में परीक्षण । यकृत, प्लीहा, और गुर्दे से Dnmt1 का प्रबल अपगुलेशन देखा गया, जबकि हृदय में कोई detectable अपरूग्लेशन नहीं पाया गया (चित्र 4ख)7. Dnmt1 के सेल चक्र पर निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न और दिल में प्रफलन कोशिकाओं की कमी इस प्रेक्षण10,५६आबाद हो सकता है । यह देखना है कि क्या इस सीमा उत्प्रेरक या उसके बाध्यकारी साइटों की संख्या की अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि से दूर किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2 : Vivo में LacIGY दबानेवाला द्वारा Dnmt1 का दमन । (क) Dnmt1 प्रमोटर में सम्मिलित की गई एलएसी प्रचालक (एलओ) के साथ चूहों को, जिसमें अथवा बिना किसी LACIGYकी अभिव्यक्ति के, आईपीटीजी की विभिन्न खुराकों के साथ उपचार किया गया था । qRT- Dnmt1 अभिव्यक्ति का पीसीआर विश्लेषण IPTG उपचार द्वारा Vivo में Dnmt1 दमन की खुराक पर निर्भर उलटा पता चलता है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । (ख) चूहों के कोलोनिक भभक में Dnmt1 प्रोटीन की प्रतिरक्षा के लिए 3 सप्ताहों के लिए १६० मिमी आईपीटीजी के साथ या बिना पीने के पानी उपलब्ध कराया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : Vivo में और रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा विभिन्न प्रमोटरों के विट्रो दमन में । (ं) एक विलिण-mKate2 ट्रांसजेनिक माउस (VilmKate2) में विलिं प्रमोटर के इनट्रॉन अनुप्रवाह में रेपरोन अनुक्रम (आर *) का प्रारंभिक संस्करण डाला गया था । qRT-पीसीआर के साथ या बिना Lacigy दमित चूहों की छोटी आंत में mKate2 अभिव्यक्ति का विश्लेषण दिखाया गया है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) छोटी आंत के साथ और बिना lacigy अभिव्यक्ति के confocal mKate2 छवियां । (ग) विभिन्न प्रमोटरों और एक ल्यूसीफ्रास रिपोर्टर के बीच छह सममित लाख प्रचालक सम्मिलित किए गए थे । रिपोर्टर्स (५० एनजी/well में ९६-well थाली) और दबानेवाला plasmids एक 1:1 दाढ़ अनुपात में nih/3t3 कोशिकाओं में transiently शुरू किए गए थे । ल्यूसिफेर्स वैल्यू ट्रांसफेक्शन के बाद 24 एच का आकलन किया गया । इन विट्रो डेटा में luciferase अभिव्यक्ति का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व lacigyमें गैर कार्यात्मक laci (nflaci) व्यक्त उन लोगों के सापेक्ष कोशिकाओं को व्यक्त । टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१. यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : नीचे और/या Dnmt1 अभिव्यक्ति में विट्रो और vivo में upregulation । (क) पूरा रिमोट कंट्रोल सिस्टम जीन लक्ष्यीकरण और इलैक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोणों द्वारा सुसंस्कृत ईसीएस में तैयार किया गया था । Dnmt1 अभिव्यक्ति का अधिकतम दमन कोई इलाज के साथ प्राप्त किया गया था, जबकि अधिकतम सक्रियण दोनों IPTG और डॉक्स उपचार द्वारा प्राप्त किया गया था । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१ (वेल्च टी-टेस्ट) । (ख) विवो में दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा Dnmt1 के सक्रियकरण में, जैसा कि रिमोट कंट्रोल चूहों से विभिन्न ऊतकों में Dnmt1 प्रोटीन का प्रतिरोदन करके दर्शाया गया है । एलजीटी एले में lac ऑपरेटर और tet उत्प्रेरक बाइंडिंग साइटों को शामिल करने के लिए Dnmt1 के प्रमोटर संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है । चूहों को एक महीने के लिए सामान्य या डोक्स युक्त आहार (५००० मिलीग्राम/किग्रा Doxycycline Hyclate) के साथ उपचार किया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1 : मुरीन Dnmt1 intron 1 में लैंडिंग पैड प्रविष्टि का उदाहरण । (क) क्वाड्रास एट अल (२०१५)31से रूपांतरित अवतरण पैड प्रविष्टि के लिए डीएनए टेम्पलेट की योजनाबद्ध । विषमप्ररूपी Loxp साइटों, JT15 और Lox2272, एक छोटी स्पेसर अनुक्रम (सपा) से अलग कर रहे है और ६०-डीएनए के बीपी द्वारा हर तरफ flanked कि लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र के लिए समजातीय है । (ख) निम्नलिखित sgRNA का उपयोग Dnmt1 intron में लैंडिंग पैड प्रविष्टि के लिए नमूना डीएनए टेम्पलेट: CTAGTACCACTCCTGTACCG (जो रिवर्स किनारा लक्ष्य) । चयनित intronic क्षेत्र bioinformatically १.१ कदम से सूचित किया गया था, और sgRNA CRISPOR29का उपयोग कर की पहचान की गई थी । (ग) लैंडिंग पैड के संमिलन का आकलन करने के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन का उदाहरण । पीसीआर प्राइमरों को अंतर्जात Dnmt1में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए टेम्पलेट के समजातता बाहों के बाहर डिजाइन किए गए थे । वाइल्डटाइप PCR amplicon है २१३ bp; लन होने पर यह २९१ बीपी हो जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक महत्वपूर्ण कदम और दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली की संभावित सीमा लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना दमनकारी और/या उत्प्रेरक बाध्यकारी साइटों की प्रविष्टि के साथ जुड़े चुनौती है । हमारे मूल दमन दृष्टिकोण, के रूप में Dnmt1 जीन के लिए लागू है, एक प्रमोटर के transcritical tionally महत्वपूर्ण क्षेत्रों के भीतर lac दबानेवाला बंधन साइटों की प्रविष्टि शामिल है । आदेश में प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के जोखिम को कम करने के लिए और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल सिस्टम के सामांय प्रयोज्यता में सुधार करने के लिए, हम एक intron आधारित दमन दृष्टिकोण विकसित की है । हमारे बढ़ाया lac प्रणाली की शक्ति हमें कसकर सभी मजबूत प्रमोटरों हम प्रतिलेखन शुरू साइटों की कई किलोबाइट डाउनस्ट्रीम करने के लिए सैकड़ों स्थित ऑपरेटरों पर परीक्षण के प्रतिलेखन दबाने के लिए अनुमति दी (चित्रा 3A-C) 10. महत्वपूर्ण बात, दमन के स्तर प्रवर्तकों की संक्रमणकारी ताकत से स्वतंत्र थे (चित्रा 3A-C)10. यह पता चलता है कि हमारे intron के दमन क्षमता आधारित दमन प्रणाली परीक्षण किया प्रमोटरों की अधिक से अधिक है । इस intron-आधारित दृष्टिकोण में, यह संभावना है कि दमन दो घटकों के बीच शारीरिक हस्तक्षेप के माध्यम से मध्यस्थता है, प्रतिलेखन बढ़ाव मशीनरी और लाख repressors५७. यह सरल दमन तंत्र और intron के प्रदर्शन मजबूती आधारित विधि यह दृष्टिकोण आम तौर पर विभिंन जीन, ऊतकों, और जीवों के लिए लागू कर सकते हैं ।

रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा upregulation के लिए transactivator बाध्यकारी अनुक्रम लक्ष्य जीन प्रमोटर, जो प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने का खतरा जरूरत पर जोर देता है निकटता में होने की आवश्यकता है । हालांकि, हमने पाया है कि बाध्यकारी दृश्यों की स्थिति के बाहर हो सकता है transcriptionally महत्वपूर्ण क्षेत्र । Dnmt1 और EF1α दोनों प्रमोटरों को ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट् स10के अपस्ट्रीम सौ ठिकानों के एक जोड़े में स्थित tet ऑपरेटरों से अलग किया गया था । यह आराम की बाधा बहुत transactivator के अभाव में एक लक्ष्य जीन के प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने की संभावना को कम कर देता है । बाइंडिंग दृश्यों और/या मजबूत transactivators के उपयोग की संख्या में वृद्धि आगे transactivators शुरू साइट से दूर साइटों से upregulation को सक्षम करने से जोखिम को कम करने में मदद कर सकता है ।

हमारे रिमोट कंट्रोल सिस्टम के स्तर के सुरुचिपूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है, समय, और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के स्थान, एक phenotype की प्रतिवर्त्यता परीक्षण के लिए अनुमति देता है और विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के परिणाम, जो आसानी से प्राप्त नहीं कर रहे हैं vivo जीन अभिव्यक्ति में वर्तमान-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों । यह ध्यान दें कि सबसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में हमारे सहित महत्वपूर्ण है, अभिव्यक्ति मूल्यों कोशिकाओं के बीच जो काफी भिंनता पाया जा सकता है की एक जनसंख्या के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस विषमजनन सेलुलर निर्णय प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इस तरह के भेदभाव या apoptosis५८के रूप में । हालांकि जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की शुद्धता की संभावना आगे अतिरिक्त आनुवंशिक सर्किट इंजीनियरिंग५९द्वारा सुधार किया जा सकता है, हमारे वर्तमान प्रणाली के मनाया शक्ति कई जैविक संदर्भों में जीन समारोह की उपयोगी जांच की अनुमति होगी । इसके अलावा, लक्ष्य विशिष्टता का एक उच्च डिग्री क्योंकि ऑपरेटर दृश्यों की जटिलता के साथ ही स्तनधारियों और नियामक घटकों६०के उद्भव प्रजातियों के बीच बड़े विकासवादी दूरी की उंमीद है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक repressors और activators के माउस लाइनों और विकसित किया जा सकता है किसी भी अंतर्जात जीन के लिए कार्यरत हैं । उदाहरण के लिए, मौजूदा tet ट्रांसक्रिकेटर माउस मॉडल वांछित माउस ऊतकों में एक लक्ष्य जीन की upregulation को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम हाल ही में एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि मजबूत ऊतक ड्राइव कर सकते है कई ऊतक प्रकार में हमारे बढ़ाया लाख दमन के विशिष्ट अभिव्यक्ति जब मौजूदा cre लाइनों के साथ Hipp11 लोकस ४८ में lacigy जीन शुरू करने के साथ संयुक्त विकसित एक lox-स्टॉप-lox तत्व (अप्रकाशित) के नियंत्रण के अंतर्गत । यह लाइन काफी हद तक रिमोट कंट्रोल सिस्टम के टिशू-विशिष्ट एप्लीकेशन को सुगम बनाएगी ।

दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा जीन उपरेगुलेशन वर्तमान inducible ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है । यह कई ट्रांसजेनिक लाइनों के उत्पादन के लिए प्रविष्टि की स्थिति प्रभाव के लिए परीक्षण की आवश्यकता नहीं है, के रूप में यह अंतर्जात लोकस का इस्तेमाल करता है । इसके अतिरिक्त, यह दृष्टिकोण मजबूत आधारभूत अभिव्यक्ति के साथ जीन के upregulation के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह एक पहले से ही मजबूत प्रमोटर से अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जबकि पारंपरिक ट्रांसजेनिक मॉडल ंयूनतम वायरल प्रमोटरों पर भरोसा करते हैं । अंत में, ऊतक विशिष्टता, कोशिका चक्र नियंत्रण, और एक लक्ष्य जीन के splicing वेरिएंट हमारे दृष्टिकोण से upregulation पर बरकरार रखा जा सकता है, के रूप में यह प्राकृतिक विनियमन के तत्वों जैसे जंमजात सीआईएस-विनियामक तत्वों को बरकरार रखता है । CRISPR/Cas-mediated जीन-लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी के आगमन से विविध मॉडल प्रणालियों में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग को काफी सुविधा मिलेगी ।

Disclosures

PWL AnchorDx और संतान, Inc के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्डों पर कार्य करता है

Acknowledgments

हम स्वर्गीय डॉ Heidi के स्तनधारी lacI जीन का निर्माण (मेयो क्लिनिक, रोचेस्टर, एमएन), डॉ डैनियल Louvard (Institut क्यूरी, पेरिस, फ्रांस) के विलिण प्रमोटर प्रदान करने के लिए उसे उदार उपहार के लिए धंयवाद Scrable, और Dr लॉरी जैक्सन-Grusby (बच्चों के अस्पताल, बोस्टन, एमए) इस प्रौद्योगिकी के विकास के प्रारंभिक दौर में उसके योगदान के लिए । हम डॉ नैंसी वू और डॉ रॉबर्ट Maxson के लिए आभारी है ट्रांसजेनिक और पीटकर चूहों पैदा करने में उनकी सहायता के लिए । हम उपयोगी विचार विमर्श और समर्थन के लिए Laird प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, और R01 CA212374 p.w.l. और 1F31CA213897-01A1 के लिए एन. ए. वी. एस] द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

आनुवंशिकी अंक १४५ प्रतिलेखन अभिव्यक्ति प्रतिवर्ती लाख repressor tet उत्प्रेरक Dnmt1 दमन जीन विनियमन inducible
अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter