Denne protokollen beskriver trinnene for å generere et modellsystem som transkripsjon av en endogen genet av interesse kan være betinget kontrollert i levende dyr og celler ved hjelp av forbedret lac repressor og/eller tet aktivator systemer.
Her beskriver vi en protokoll for å implementere fjernkontroll systemet (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som tillater reversibel og tunable kontroll over en endogene genet av interesse i levende modell systemer. Fjernkontroll systemet benytter forbedret lac undertrykkelse og tet aktivisering systemer å oppnå ned- eller oppregulering med et mål i en enkelt biologiske system. Tett undertrykkelse kan oppnås fra repressor bindende fleksibelt ligger langt nedstrøms en transkripsjon startwebstedet begrenser transkripsjon forlengelse. Solid upregulation kan oppnås ved å styrke transkripsjon av en endogen genet av målretting tet transcriptional aktivator beslektet selskapet. Denne reversibel og tunable kontrollen kan anvendt og trukket tilbake flere ganger i organismer. Styrken og allsidighet av systemet, som demonstrert for endogene Dnmt1 her, vil tillate mer presis i vivo funksjonelle analyser ved at etterforskningen av gen funksjon på ulike uttrykk nivåer og testet Reversibilitet av en fenotypen.
Genetisk knockout eller transgene tilnærminger har vært effektivt middel for å studere gen funksjon i dyremodeller. Men uttrykket regulering av disse er dikotom (på/av), ikke-temporal, og dermed er ikke i stand til å avsløre hele funksjonelle spekteret av et gen. Betinget grobunn/LoxP teknologi har tillatt spatio-temporale inaktivering eller aktivering av gen funksjon, men deres dikotom natur fortsetter å posere begrensningene for eksempel celle dødelighet og irreversibilitet1,2 , 3. for å fylle dette tomrommet, betinget knockdown tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tet-regulert shRNA eller miRNA4. Men off-målet effekter fortsatt en bekymring for RNAi5 og har vært vanskelig for å kontrollere i vivo. Nylig har CRISPR/Cas-mediert transcriptional-kontroll teknologi innført en mer allsidig tilnærming for å oppnå både opp- og downregulation av endogene genuttrykk og demonstrerte sine verktøy6,7 . Imidlertid effektiviteten av CRISPR/Cas-mediert transcriptional kontroll er ennå uklart i vivo, og Reversibilitet KRAB-baserte undertrykkelse gjenstår for å bli sett, så sterk undertrykkelse av KRAB og dens samspill protein KAP1 har vist seg å indusere permanent genet stanse8,9.
For å håndtere disse begrensningene, har vi utviklet en roman transcriptional regulatoriske system kan betinget styre endogene byggkorn under en reversibel og tunable måte i mus med konstruert prokaryote binære transcriptional regelverk10. Prokaryote binære transcriptional regulatoriske systemer med regulatoriske ligander, som lac og tet, har aktivert slik reversibel og tunable uttrykk kontrollere11,12,13, 14. men utilstrekkelig undertrykkelse styrken av gjeldende binære systemer har hindret deres omfattende bruk for å kontrollere endogene genuttrykk i pattedyr. Vi utviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrekkelig muligheter for undertrykkelse av endogene gener og ansatt en ny strategi for målretting tet transcriptional aktivator direkte til beslektet arrangøren av en endogen genet å oppnå solid upregulation (figur 1)10. Med denne teknologien, har vi oppnådd nesten to størrelsesordener uttrykk kontroll av endogene Dnmt1 genet i en tunable induserbart og reversibel måte10. Her gir vi trinnvise instruksjoner for anvendelsen i vivo til andre gener og organismer bruker mus som modell art.
Figur 1 : Oversikt over fjernkontrollen systemet. Transkripsjon av en endogen målet genet kan reguleres utviklet lac repressor og tet aktivator systemer. Med målet genet arrangør eller intron er konstruert for å inneholde operatorer for stramt-bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angir Repron (Repinntrykk Innlpå), som inneholder 12 symmetrisk lac operatører (S) pluss en delvis kanin beta-globin intron. T angir tet operatør. Repressor og/eller aktivator/uttrykkes fra en vev-spesifikke promoter. Uttrykk for målet genet kan deretter reversibel stilles til ønsket uttrykk nivå av administrasjonen av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist av LacIGY-repressor) eller Doxycycline (Dox). Dette tallet er endret fra Lee et al.10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Før du starter denne protokollen, se tabell 1 for å identifisere de relevante trinnene for ønsket kontroll av genuttrykk. For eksempel for å ingeniør en mus som lar reversibel downregulation av “Gene X”, fullføre delene 1, 3 og 4 av de nedenfor protokollen. Tabell 1 oppsummerer også de nødvendige komponentene av fjernkontroll.
Ønsket uttrykk endring | Undertrykkelse bare | Aktivisering bare | Både undertrykkelse og aktivisering |
Relevante delene av protokollen | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Fjernkontroll sekvens trengs i målet genet | Repron (“Undertrykkelse intron”, 12 symmetrisk lac operatører pluss en delvis kanin beta-globin intron) | Tet operator(s) | Repron og Tet operator(s) |
Fjernkontroll sekvens plassering | Intron | Arrangøren | Intron & arrangøren |
Aktivator/Repressor nødvendig for ønsket kontroll | LacIGY Repressor | rtTA-M2 aktivator | LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator |
Regulatoriske ligander | IPTG | Doxycycline | IPTG og/eller Doxycycline |
Tabell 1: Oversikt over fjernkontrollen komponenter.
En kritisk trinn og potensielle ANSVARSBEGRENSNING fjernkontroll systemet er utfordringen forbundet med innsetting av repressor eller aktivator bindende områder uten å påvirke mål genuttrykk. Vår opprinnelige undertrykkelse tilnærming, involvert som brukes til Dnmt1 genet, innsetting av lac repressor bindende områder innen transcriptionally kritiske områder av en promoter. For å redusere risikoen for påvirker promoter funksjon og dermed å forbedre den generelle anvendelighet av fjernkontroll systemet, vi utviklet intron-baserte undertrykkelse tilnærming. Styrken på forbedret lac systemet tillot oss å undertrykke tett transkripsjon av alle de sterke arrangørene vi testet mot ligger hundrevis til flere kilobases nedstrøms av transkripsjon starte områder (Figur 3-Vekselstrøm) 10. viktigst, nivåer av undertrykkelse er uavhengige av transcriptional styrkene til arrangører (Figur 3-Vekselstrøm)10. Dette tyder på at undertrykkelse kapasitet intron-baserte undertrykkelse systemet overskrider transcriptional styrke de testede arrangørene. I denne intron tilnærming er det sannsynlig at undertrykkelse er formidlet gjennom fysisk interferens mellom to komponenter, transkripsjon forlengelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelsen mekanisme og vist robust metoden intron-baserte kan gjøre denne generelt gjelder for ulike gener, vev og organismer.
Oppregulering av fjernkontroll systemet krever transactivator binding sekvenser i nærhet til målet genet selskapet, som innebærer en risiko for påvirker promoter funksjon. Vi fant imidlertid at plasseringen av bindende sekvenser kan være utenfor regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α arrangører var robust upregulated fra tet operatører ligger et par hundre baser oppstrøms av transkripsjon start nettsteder10. Denne avslappende betingelsen reduserer sjansen for påvirker promoter funksjon med et mål i fravær av transactivator. Øke antall bindende sekvenser og/eller bruk av sterkere transactivators kunne hjelpe ytterligere redusere risikoen ved å aktivere oppregulering fra områder lenger bort fra startwebstedet transkripsjon.
Fjernkontroll systemet gir elegante kontroll av nivå, timing og plasseringen av endogene genuttrykk, slik at Reversibilitet av en fenotypen og konsekvensene av ulike uttrykk nivåer, som ikke er lett oppnåelig ved gjeldende i vivo gene expression-kontroll teknologi. Det er viktig å merke seg at i de fleste gene expression analyser, inkludert vår, uttrykk verdiene representerer gjennomsnittet for en populasjon av celler som store variasjoner kan bli funnet. Denne heterogene kan påvirke mobilnettet beslutningsprosesser, som differensiering eller apoptose58. Men presisjonen for gene expression kontroll kan trolig ytterligere forbedret av flere genetiske krets engineering59, kan observerte styrken på vårt nåværende system nyttig undersøkelse av gen funksjon i mange biologiske sammenhenger. I tillegg forventes en høy grad av målet spesifisitet fordi operatøren sekvensene samt stor evolusjonære avstanden mellom pattedyr og opprinnelige arter i de regulatoriske komponenter60. Videre kan transgene musen linjer med repressors og aktivator utvikles og ansatt for noen endogene genet. For eksempel kan eksisterende tet transactivator musen modeller tilpasses for å oppnå oppregulering med et mål i ønsket musen vev. Vi har nylig utviklet en transgene linje som kan kjøre robuste vev-spesifikke uttrykk for vår forbedrede lac repressor i flere vev typer kombinert med eksisterende grobunn linjer ved å innføre lacIGY genet til Hipp11 locus48 under kontroll av et Lox-stopp-Lox element (upublisert). Denne linjen vil vesentlig lette vev-spesifikke anvendelsen av fjernkontrollen systemet.
Gene oppregulering av fjernkontroll systemet gir flere fordeler i forhold til gjeldende induserbart transgene tilnærminger. Det krever ikke generasjon av flere transgene linjer til å teste posisjon virkningene av innsetting, som det utnytter endogene locus. I tillegg denne tilnærmingen er velegnet for oppregulering av gener med sterk planlagte uttrykket fordi det forbedrer uttrykk fra en allerede robust promoter, mens konvensjonelle transgene modeller stole på minimal viral arrangører. Til slutt, vevet spesifisitet, celle-syklus kontroll og skjøting varianter med et mål kan beholdes på oppregulering av vår tilnærming, som det bevarer elementer av naturlige forskrift som medfødt cis-regulatoriske elementer. Bruk av CRISPR/Cas-mediert genet målretting teknologi vil forenkle anvendelse av denne teknologien i ulike modellsystemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker den avdøde Dr Heidi Scrable for hennes sjenerøse gaven av pattedyr lacI gene Konstruer (Mayo Clinic, Rochester, MN) Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) for å gi Villin selskapet og Dr. Laurie Jackson-Grusby (barnesykehus, Boston, MA) for hennes bidrag til de tidlige stadiene av denne teknologiutvikling. Vi er takknemlige for Dr. Nancy Wu og Dr Robert Maxson for deres hjelp i å generere transgene og knockout musene. Vi takker medlemmene av Laird laboratorium for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 å N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |