Summary
Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.
Abstract
Genbeheersing van neuronale cytoarchitectuur is momenteel het onderwerp van intensief onderzoek. Hier beschreven is een eenvoudige methode ontwikkeld om in vivo gencontrole van neocorticale projectie neuron morfologie te bestuderen. Deze methode is gebaseerd op (1) in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren als "test" en "Control" cellen, (2) hun co-transplantatie in wild-type hersenen, en (3) gepaarde morphometrische evaluatie van hun neuronale derivaten. Specifiek, E 12.5 palliale precursoren van panneuronale, genetisch gelabelde donoren, worden gebruikt voor dit doel. Ze zijn ontworpen om te profiteren van geselecteerde promotors en tetON/OFF-technologie, en ze zijn vrije hand getransplanteerd in neonatale laterale ventrikels. Later, na immunofluorescentie profilering van ontvangende hersenen, silhouetten van getransplanteerde neuronen worden gevoed in NeurphologyJ open source software, hun morphometrische parameters worden geëxtraheerd, en de gemiddelde lengte en vertakkings index worden berekend. In vergelijking met andere methoden, deze biedt drie belangrijke voordelen: het maakt het bereiken van de fijne controle van transgen expressie tegen betaalbare kosten, het vereist alleen elementaire chirurgische vaardigheden, en het biedt statistisch betrouwbare resultaten bij analyse van een beperkte aantal dieren. Vanwege het ontwerp is het echter niet voldoende om niet-cel-autonome controle van neuro architectuur aan te pakken. Bovendien, het moet bij voorkeur worden gebruikt om te onderzoeken neuriet morfologie controle na voltooiing van neuronale migratie. In zijn huidige formulering is deze methode prachtig afgestemd op het onderzoeken van gencontrole van glutamaterge neocorticale neuron architectuur. Gebruik te maken van transgene lijnen uitdrukken EGFP in andere specifieke neurale celtypen, het kan worden hergebruikt voor het aanpakken van gencontrole van hun architectuur.
Introduction
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die we hebben ontwikkeld om in vivo gencontrole van neuronale cytoarchitectuur te ontleden. Op basis van in vitro engineering van neuronale precursoren, hun transplantatie in neonatale hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" cellen, maakt het mogelijk om functionele implicaties van test genen te onthullen in de fijne beheersing van neuronale morfologie in een snelle en betaalbare manier. Om in vivo gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, moeten drie belangrijke technische kwesties worden aangepakt: (1) het bereiken van een adequaat gedessineerde gen-of-Interest (GOI) expressie en een nauwkeurige kwantitatieve controle ervan; (2) het verkrijgen van een correct gesegmenteerde visualisatie van verschillende neuronale silhouetten; (3) het opwekken van statistische significantie van de resultaten terwijl een beperkt aantal dieren wordt tewerkstelt.
Indien beschikbaar, muis Mutant lijnen cellen tetracycline (tet)-gecontroleerde transgenes mogelijk de beste tool om het eerste nummer1aan te pakken. Als alternatief kan somatische Transgenese worden gebruikt. In dergelijke gevallen wordt het transgen geleverd via electroporatie2 of virale transductie3. Vervolgens wordt het bewaard als een episome (bijv. bij standaard elektroporation4), of het is geïntegreerd in het genoom (willekeurig, via retrovirale integrase5; of op een gedefinieerde locatie, via crispr-gepromoveerde homologe RECOMBINATIE (slendr)6 ).
Tweede, neuronale silhouet visualisatie kan worden bereikt via (a) sparse uniforme labeling of (b) dichte differentiële labeling. Wat betreft sparse labeling, geavanceerde Golgi-achtige methodologieën kunnen worden gebruikt7, geselecteerde neuronale minisets kunnen worden gevuld door biocytine8, en zout-en-peper labeling kan worden verkregen dankzij een dun uitgedrukt transgene. Een dergelijk transgen kan bonte transcriptie (Thy-EGFP)9 vertonen of kan worden geactiveerd door stochastische recombinatie (Morf)10. Als voor (b), State of Art strategieën omvatten CRE-gemedieerde stochastische recombinatie binnen een multi-floxed fluoroprotein transgen array (brainbow)11, evenals piggybac-transposase-driven genomische integratie van fluoroprotein genen, eerder geleverd via somatische Transgenese (kloon)12.
Wat betreft het derde probleem, wordt de morometrische uitkomst vaak beïnvloed door een grote willekeurige variabiliteit, afkomstig van verschillen tussen dieren en contingenties van de celinjectie. Hierdoor wordt een groot aantal dieren gewoonlijk gebruikt om het statistische vermogen te bereiken dat nodig is om de werking van de GOI-Morfometrische activiteit te beoordelen.
De eerder beschreven benaderingen zijn vaak gebaseerd op geavanceerde technische vaardigheden en vereisen opvallende financiële middelen, die hun verspreiding binnen de wetenschappelijke gemeenschap kunnen beperken. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een eenvoudige en ongecompliceerde pijpleiding bedacht om op een snelle en betaalbare manier de genbeheersing van neuro architectuur in vivo te ontleden. Dit is geïnspireerd door een soortgelijk co-transplantatie ontwerp dat eerder is ontwikkeld voor een snelle in vivo evaluatie van antiblastische transgen activiteit13.
Specifiek, er wordt gedacht dat de co-transplantatie van in vitro engineered "groene" neurale precursoren ("test" en "controle" cellen) in een "zwarte" ontvangende neonatale hersenen kunnen tegelijkertijd de drie belangrijkste problemen die hierboven vermeld. In vitro lentivirale engineering van precursoren, in goed gecontroleerde omstandigheden, maakt het mogelijk om de variabiliteit van neuronale transgenexpressie minimaal te onderhouden, ver onder die meestal geassocieerd met somatische manipulaties (eerder uitgevoerd 14 , 15 en in onze niet-gepubliceerde resultaten). De resulterende nauwkeurige controle van genexpressie is vergelijkbaar met die bereikt door Tet-gecontroleerde transgene modellen. De kosten van deze procedure liggen echter ver onder die van het onderhoud van een transgene muis lijn. Volgende, vrije-hand celinjectie is eenvoudig en vereist minimale training. Bovendien kan de hoeveelheid gelabelde precursoren die in elke hersenen worden geïnjecteerd, gemakkelijk worden afgestemd om een voldoende Cumulatief aantal dunbevolkte precursoren te bereiken, terwijl ook het totale aantal getransplanteerde dieren minimaal blijft. Niet in de laatste plaats, co-injectie van verschillend fluoro-gelabeld, "test"-en "controle"-precursoren en daaropvolgende Pairwise statistische analyse van de resultaten neutraliseren de effecten van de experimentele variabiliteit van de Inter-Animal, waardoor het bereiken van statistische significantie van de resultaten, zelfs bij de analyse van een beperkt aantal personen13.
Benadrukt moet worden dat deze methode, zij het snel en voordelig, twee belangrijke beperkingen heeft. Ten eerste is het ontworpen om de celautonome gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, en het is niet gepast om de milieucontrole aan te pakken. Ten tweede, aangezien getransplanteerde neuronale precursoren hun uiteindelijke locatie bereiken met een heterochronisch schema, verdient deze methode de voorkeur om neuroarchitectonische controle te modelleren die plaatsvindt na voltooiing van de migratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden en procedures zijn goedgekeurd door de SISSA organismo preposto al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generatie van engineered "Green" voorlopercellen Pools
- Voorbereiding van het "groene" zwembad
- Mate een wild-type CD1 vrouwtje met een MtaptEGFP/+ oprichter16. Euthanaseren de zwangere Dam door cervicale dislocatie op 12,5 dagen na-coitum (dag 0 wordt bepaald door vaginale plug inspectie) en oogst de embryonale dag 12,5 (E 12.5) embryo's. Zet ze in afzonderlijke putjes van een 24-multi well-plaat in een koude PBS-oplossing.
- Genotype de embryo's snel door visuele inspectie onder een blauw licht lampje, waarbij wordt gecontroleerd op groene fluorescentie emissie in de hersenen.
- Plaats de "groene" embryo's in een Petri schaaltje van 10 cm diameter, gevuld met koud 1x PBS met 0,6% glucose en breng het over naar onder een stereomicroscoop.
- Snijd de embryo hoofden met behulp van een standaard schaar en extract de telencephalon van hen door middel van #3 en #5 Tang.
- Scheid de twee telencephalische blaasjes en ontleden de neocortices met behulp van een tang; Zorg ervoor dat u de hippocampus en de basale ganglia17te verwijderen.
- Verzamel neocortices door ze over te brengen met een P1000-pipet in een buis van 1,5 mL die op ijs wordt gehouden.
- Laat de ontleed neocortices zich tot de bodem van de buis schikken.
- Het supernatant zoveel mogelijk aspireren.
- Respendeer de neocortices in 400 μL van vers proliferatief medium [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL boviene serumalbumine (BSA), 0,6% glucose, 2 μg/mL heparine, 20 ng/mL basis fibroblast-groeifactor (bFGF), 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 1X pen-STREP, en 10 PG/mL amfotericine B].
- Pipetteer de neocortices voorzichtig omhoog en omlaag, opeenvolgend met P1000, P200 en P20-tips, 4x per tip, om een bewolkte celsuspensie te verkrijgen.
Opmerking: E 12.5 neocorticale weefsel is zeer zacht; door aan enkele cellen vereist geen enzymatische vertering; herhaalde pipetteren is voldoende. - Laat de hersenvliezen en de residuele neocorticale klonten 2 minuten neerstrijken.
- Breng 150 μL over van de bovenkant van de celsuspensie (voornamelijk met enkelvoudige cellen) in een nieuwe steriele buis van 1,5 mL.
- Voeg 150 μL vers proliferatief medium toe en herhaal stappen 1.1.10-1.1.12 totdat er geen weefsel klonters zichtbaar zijn. Terwijl u dit doet, laat u de P1000 Pipetteer Step (in stap 1.1.10) weg.
Opmerking: drie iteraties van stappen 1.1.10-1.1.12 zijn meestal voldoende om volledige weefsel dissociatie te bereiken. - Tel cellen ("groene" pool) met de trypaanse blauwe uitsluitings methode in een Bürker-kamer17 en voeg vers proliferatief medium toe om de concentratie aan te passen tot 103 cellen/μL.
Opmerking: stappen 1.1.7-1.1.14 moeten worden uitgevoerd onder een steriele laminaire stroom afzuigkap, gedesinfecteerd met 70% ethanol en gedurende ten minste 20 minuten geventileerd.
- Engineering van de "groene" sub-Pools
- Onderverdeel de "groene" pool in twee sub-Pools in twee afzonderlijke 1,5 mL buizen voor linvirale infectie.
- Infecteren de sub-Pools onafhankelijk met de twee toegewijde linvirale mixen. Elke mix bevat "Red label" virus (Pgk1_mCherry) of "Black" virus (pCAG_lacZ) als een controle, evenals virussen voor tetoff gedreven transgen (Pgk1p_tTA en TRE_transgene) of Control (Pgk1p_tTA en TRE_PLAP) expressie.
VOORZICHTIG: manipuleer linvirussen in een BLS-2 omgeving met alle beschermende metingen voorgeschreven door toepasselijke regels en wetten.
Opmerking: elk linvirus moet worden toegediend met een veelheid aan infecties (MOI) van 8, die (zoals eerder aangegeven14) voldoende is om de overgrote meerderheid van de neurale cellen in dergelijke experimentele omstandigheden te kunnen doorgaan (Figuur 1). De lentivirus cellen Tet trans Activators kunnen worden gebouwd door het gebruik van verschillende neuronale promoters rijden tTA/rtta expressie (bijv., ptα1, psyn, pcamkii, pGAD1, enz.) (Figuur 2). De MOI is de verhouding van (a) het aantal infectieuze virale deeltjes dat wordt afgeleverd bij (b) het aantal van hun doelcellen. Hier wordt de eerste (a) berekend volgens de conventionele procedure beschreven elders14, wordt de laatste (b) eenvoudig geëvalueerd met behulp van een bürker-kamer. - Plaat 600.000 cellen van elke geïnfecteerde sub-pool per put van een 12 multi well plaat, in 600 μL proliferatief medium met 2 μg/mL doxycycline.
Opmerking: hier, putten zijn niet voorbehandeld met poly-lysine, die voorkomt dat neurale cel gehechtheid aan hun bodems. - Breng cellen over naar de incubator in 5% CO2 bij 37 °c.
- Na 2 dagen, om de efficiëntie van de infectie en de differentiële markering van de engineered Pools te beoordelen, Inspecteer de cellen onder een conventionele fluorescerende Microscoop. De twee sub-Pools moeten worden weergegeven als suspensies van kleine neuro sferen, waarbij het rode fluorescerende eiwit ("controle"-monster) of niet ("test"-monster) homogeen wordt uitgesproken. Binnen deze neurosferen is het MtaptEGFP -transgen actief beperkt tot een minderheid van cellen (post-mitotische neuronen) en zwijgt in de meerderheid van hen (prolifererende precursoren) (Figuur 3).
2. opzet van de chirurgische instrumenten en het werkingsgebied
-
Bereiding van borosilicaatnaalden
- Gebruik het borosilicaatglas capillairen met een uitwendige en inwendige diameter gelijk aan 1,5 mm en 1,12 mm, respectievelijk.
- Trek het capillair met een P 1000 puller.
- Het Trek programma instellen. Typische programma parameters zijn: Heat = 614; vel = 60; tijd = 1; Druk = 600. Ze moeten worden afgesteld volgens het trekker-model en de gebruikte verwarmingsweerstand.
- Plaats het capillair in de trekker houders en draai ze aan.
- Start het programma en neem de twee getrokken micro capillairen.
- Snijd de capillaire tip met de hand, met een scalpel, onder de stereomicroscoop te verkrijgen van een tip met een uitwendige diameter van ~ 200-250 μm.
- Plaats de haarvaten op een boetseerklei (bijv. plasticine) steun in een gesloten Petri schaaltje en breng deze over naar onder de motorkap.
-
De afzuigkap instellen en de Cell Tracer-oplossing voorbereiden
- Reinig de horizontale stroomkap voorzichtig en desinfecteer deze met 70% ethanol.
- Desinfecteer optische vezels met 70% ethanol en plaats ze onder de motorkap.
- Meng 10 μL van 125 mM EGTA-oplossing en 10 μL snel groen om de "Cell Tracer-oplossing" voor te bereiden en onder de motorkap te plaatsen.
- Snijd kleine stukjes (4 cm x 2 cm van grootte) van laboratorium afdichtings folie voor het spotten van celophanging.
- Bereid een oplossing van 1 mg/ml steriele doxycycline en aspiraat het in een spuit van 0,3 ml.
- Schakel de afzuigkap in en houd de laminaire stroming 20 minuten voor de operatie aan.
-
Montage van de injectie buis
- Neem een hard-plastic mondstuk, twee latex tubes (elk ongeveer 30 cm lang) en een capillaire houder uit een aspirator-buis montagekit voor gekalibreerde microcapillaire pipetten.
- Bevestig het hard-plastic mondstuk aan één uiteinde van een latex buis.
- Bevestig de capillaire houder aan één uiteinde van een andere latex buis.
- Sluit de vrije uiteinden van de twee latex buizen met een 0,45 μm steriele filter, als een barrière tegen de Germs van de operator.
- Plaats de resulterende aspirator-buis op een boetseerklei houder om onder de motorkap te worden gehouden.
3. Cell mix en intraveneuze triculaire transplantatie
- Mengen van "test" en "Control" groene cel sub-Pools
- Verzamel "test" en "Control" Neuro sferen (zie stap 1.2.5) in afzonderlijke 1,5 mL buizen.
- Centrifugeer neurobolletjes suspensie bij 200 g gedurende 5 min.
- Verzamel en gooi het supernatant weg, Vermijd verstoring van de celpellet.
- Breng de neuro sferen zachtjes in 500 μL 1x PBS.
- Centrifugeer ze gedurende 1 minuut op 200 g.
- Verwijder het supernatant.
- Herhaal stappen 3.1.4-3.1.6 nog twee keer.
- Breng de bollen voorzichtig in 200 μL van 2x trypsine-oplossing (2x trypsine, 1x PBS) en pipet-celpellet op en neer 4x-5x.
Opmerking: Let erop dat u geen luchtbellen maakt. - Laat de cellen in de incubator gedurende 5 minuten bij 37 °C staan om een eencellige suspensie te bereiken.
- Blokkeer trypsine met 200 μL trypsine remmer-oplossing (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0,28 mg/mL trypsine inhibitor) door Pipetteer op en neer 4x-5x.
- Centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 5 min en respendeer ze in 1 ml vers proliferatief medium (DMEM-F12, 1x glutamax, 1x N2, 1 mg/ml BSA, 0,6% glucose, 2 μg/ml heparine, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF, 1x pen-STREP, 10 PG/ml amfotericine B).
- Tel cellen van de twee zwembaden met trypan blauwe uitsluitings methode in een Bürker-kamer.
- Stel hun concentratie in op 100.000 cellen/μL in proliferatief medium.
- Meng 1:1 "test" cellen met "Control".
- Controleer de resulterende mix onder een fluorescentiemicroscoop (objectief vergroting: 10x) om ervoor te zorgen dat de mix een eencellige suspensie van de twee zwembaden is (figuur 3c).
- Plaats de mix op ijs onder de motorkap.
- Intraveneuze triculaire transplantatie
- Bereid de kooi met de moeder en de P0 pups op een tafel ver weg van de chirurgische opererende gebied.
- Plaats een herstel kooi op een kar dicht bij de motorkap.
- Zet een mengsel van zaagsel uit de kooi van de moeder op de bodem van de bergings kooi en plaats het onder een lamp.
- Opzij, zet een ijsbak bedekt met een aluminiumfolie voor de anesthesie van P0 pups.
- Net voorafgaand aan de transplantatie, voeg 1/10 volume van de cel Tracer oplossing (van stap 2.2.3) aan 1 volume van celsuspensie (uit stap 3.1.16) en spot 3 μL van de resulterende "injectie mix" op een stukje laboratorium afdichtings folie.
- Plaats de pup gedurende 1 minuut op de koele aluminiumfolie en controleer of deze volledig verdouseerd is.
Opmerking: om anesthesie te bevestigen, Knijp zachtjes een poot en monitor de pup voor gebrek aan bewegingen, terwijl nog steeds ademen. - Aspiraat ondertussen de 3 μL injectiemix (van stap 3.2.5) in het Glazen capillair.
- Veeg voorzichtig het hoofd van het verdoofd pup met 70% ethanol.
- Plaats de kin van de pup op de punt van de optische vezel om de corticale hemisferen duidelijk te identificeren.
Let op: bij P0-P1 is de hoofdhuid erg dun, waardoor een eenvoudige visuele identificatie van de hemisferen net boven de oogbollen en achter de olfactorische bollen mogelijk is. - Houd het capillair (geladen zoals beschreven in stap 3.2.7) in een van de twee mid-parasagittale vlakken (links of rechts), boven de olfactorische bol, en prik de voorhoofd huid op het snijpunt met het frontale vlak dat de oogbollen centra bevat. Let op dat u de bloedvaten niet beschadigt. Voer het capillair in de frontale cortex en toegang tot de ventrikel Holte (figuur 4a).
- Om accidentele beschadiging van de ganglionische eminentie te voorkomen, draait u de naald lateraal met 30 graden, wijzend op de punt caudal-mediale-Ward (figuur 4b).
- Injecteer de cellen voorzichtig in de ventriculaire Holte en bewaak hun diffusie door middel van Fast Green (figuur 4c).
- Wacht 5-10 s.
- Verwijder de glas naald en zorg dat de celsuspensie niet wordt aangeblazen en gooi deze weg in een geschikte afvalbak.
- Voordat pup herstel van anesthesie Injecteer 150 μL doxycycline oplossing intraperitoneaal om de transgenexpressie nog steeds af te houden na de transplantatie.
- Na de injectie, plaats de pup onmiddellijk onder de lamp voor herstel.
- Laat de pups onder de lamp voor 5-10 min en, eenmaal volledig wakker, plaats ze in de kooi met de moeder.
- Observeer de bediende pups voor 2-3 h, om ervoor te zorgen dat de moeder hen aanvaardt.
- De kooi voorzien van drinkwater met 0,5 mg/ml doxycycline en 50 g/L sucrose om de transgen expressie af te houden.
- Vervang het doxycycline-bevattende water 4 dagen na de transplantatie door doxy-vrij water, waardoor het transgen in post-mitotische neuronen wordt geactiveerd. Houd muizen gedurende 6 dagen in een doxy-vrij regime en euthaniteer ze op P10 door koolstofdioxide inademing gevolgd door onthoofding.
4. analyse van getransplanteerde hersenen
-
Histologie en immunofluorescentie
- Euthanferen de getransplanteerde pups 10 dagen na transplantatie van de cel door koolstofdioxide inademing gevolgd door onthoofding. Repareer de hersenen van inslapen pups in 4% Paraformaldehyde (PFA) bij 4 °c 's nachts.
Let op: PFA is zeer giftig; Behandel het met zorg, strikt voldoen aan de voorschriften van de fabrikant, onder een chemische rook afzuigkap; Gooi de rest van de PFA-oplossing weg in een gelabelde afvalbak. - Verwijder de PFA-oplossing en vervang deze door 30% sucrose-oplossing.
- Laat de hersenen op 4 °C staan of tot ze naar de bodem van de injectieflacon zinken.
- Breng de hersenen over in een wegwerp-insluitings mal die ongeveer half gevuld is met Cryo-inclusie medium.
- Vries de meegeleverde hersenen bij-80 °C.
- Snijd 60 μm dikke coronale secties met een cryostat.
Opmerking: Vermijd het gebruik van dunnere secties, omdat dit kan resulteren in onaanvaardbaar verlies van informatie over de hele architectuur van enkelvoudige neuronen. - Proces secties voor immunofluorescentie18,19, met behulp van anti-GFP [1:400] en anti-RFP (mcherry) [1:500] antilichamen. Kernen met contra vlekken met 1 mg/ml DAPI-oplossing [1:200].
- Euthanferen de getransplanteerde pups 10 dagen na transplantatie van de cel door koolstofdioxide inademing gevolgd door onthoofding. Repareer de hersenen van inslapen pups in 4% Paraformaldehyde (PFA) bij 4 °c 's nachts.
-
Morfometrie
- Stel de werkparameters van de confocale Microscoop als volgt in: z-stack hoogte = 40 μm; stap = 2 μm.
- Verzamel foto's van immunoassayed segmenten selecteren GFP positieve neuron-rijke fotografische velden, blind van de RFP signaal verdeling.
- Exporteer de afbeeldingen als. ND2-bestanden.
- Genereer maximale Z-projecties van hen als. TIFF-bestanden (afbeelding 5a).
- Om subsequentiële neuronale skeletonisatie blind te maken voor cellen genotype, verbergt u het rode signaal. Hiertoe opent u elk. TIFF-bestand met een geschikte software en voegt u een aanpassingslaag toe. Selecteer "levels", "Red" en stel "output" in op nul. Sla het bestand op als zodanig.
Opmerking: Skeletonisatie wordt vervolgens uitgevoerd door een nieuwe operator die geen eerdere toegang had tot originele Plain Red-bestanden. - Voeg voor elk verborgen rood bestand een tekenlaag toe aan de primaire afbeelding en selecteer de tool potlood (witte kleur). Traceer het SOMA op basis van het GFP-signaal en traceer vervolgens de neurites.
Opmerking: de tool potlood kan worden ingesteld op 40 pixels voor het SOMA en op drie pixels voor neurites. - Sla het bestand met meerdere lagen op, inclusief neuronale silhouetten (Figuur 5b).
Opmerking: daaropvolgende analyse van neuronale skelet kan worden uitgevoerd door een van beide operators. - Maak een nieuw 1024 x 1024 16-bits grijswaarden bestand met een zwarte achtergrond, één per neuron.
- Kopieer en plak enkele neuronale silhouetten van de primaire afbeelding naar het nieuwe bestand met grijswaarden. Ga terug naar het bestand met meerdere lagen en schakel de aanpassingslaag uit om neuronale genotypes te onthullen. Sla het 16-bits grijswaarden bestand op dat het bijbehorende neuronale genotype annoeert.
- Importeer grijswaardenafbeeldingen in ImageJ één voor één en analyseer skeletten door NeurphologyJ plugin van ImageJ software20 (figuur 5c).
- Kopieer NeurphologyJ primaire gegevens (neurite_length, attachment_points en eindpunten; voor elk, nemen "totale oppervlakte" waarden), plak ze in een spreadsheet en gebruik ze om secundaire morphometrische parameters te berekenen ( gemiddelde neuriet lengte, vertakkings index) (figuur 5d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn vijf primaire gegevenssets met nuttige informatie over belangrijke aspecten van de procedure, de eerste is (1) efficiëntie van neurale precursoren transductie en co-transductie door lentivirale vectoren. (2) een voorbeeld van de belangrijkste kenmerken van de organisatoren die werkzaam zijn om het "test gen" te stimuleren. (3) een voorbeeld van ontwikkelde cellen die klaar zijn voor transplantatie. (4) een cartoon met belangrijke procedurele details van celmicroinjection in het neonatale brein. (5) een samenvatting van de gehele Morfometrische pijpleiding.
Wat betreft (1) werd het vermogen van de prototypische linvirale vectoren die op verschillende MOIs (2, 4, 8) werden afgeleverd om de neocorticale precursoren effectief te bezorgd geëvalueerd. In de eerste test werden neurale precursoren afkomstig van vroege wild-type neocortices geïnfecteerd door een lentivirale Reporter, waarbij de mCherry Codeer volgorde (CDS) onder controle van de neuronogene-Lineage-specifieke pTα1-promotor, bij MOI = 2, 4, 8 en vervolgens toegestaan om te differentiëren. Co-immunoprofiling van hun nakomelingen voor mCherry en de panneuronale marker Tubb3 toonde aan dat neuronen effectief werden getransduceerde bij frequenties van 64%, 69%, en 78%, respectievelijk (Figuur 1a). In een tweede test werden neocorticale precursoren acuut met elkaar geïnfecteerd door twee lentivirale reporters, waarin EGFP en mCherry werden uitgesproken, onder de controle van de constitutieve pPgk1 promotor, bij MOIs = (2, 2), (4, 4), en (8, 8). Een paar dagen later toonde co-immunoprofiling van hun derivaten aan dat de verhouding tussen EGFP+mcherry+ en EGFP+mcherry± cellen respectievelijk 80%, 88% en 93% bedroeg (Figuur 1b). Deze gegevens suggereren dat, bij de levering van het Engineering protocol voor de huidige studie, (a) de overgrote meerderheid van neuronen zijn getransduceerde, en (b) bijna alle getransduceerde neuronen ontvangen de volledige linviral set die nodig is voor hun karakterisering.
Figuur 1 : Efficiëntie van neurale precursor cellen transductie door lentivirale vectoren. Panels rapporteren een evaluatie van de efficiëntie waarmee e 12.5 neocorticale voorlopercellen zijn getransduceerde (of co-getransduceerde) bij aflevering van toegewijde lentivirale verslaggevers in verschillende multiplicities van infectie (MOIs). In het eerste geval (a) werden cellen acuut geïnfecteerd met het LENTIVIRUS (LV) pTα1-mcherry bij Moi = 2, 4, 8, gekweekt in proliferatief medium voor 2 dagen, overgebracht naar differentiatief medium, en toegestaan om te differentiëren voor 1 week. Na fixatie op dag in vitro (DIV) 9, waren culturen co-immunoprofiled voor mCherry en de panneuronale marker Tubb3. mCherry en EGFP signalen werden gedetecteerd door anti-RFP en anti-EGFP primaire antilichamen en onthuld door Alexa-594-en Alexa-488-geconjugeerde secundaire antilichamen, respectievelijk. Ten slotte werden de verhoudingen mCherry+Tubb3+/mCherryTubb3+ berekend, gemiddeld en uitgezet tegen de corresponderende MOIs. In het laatste geval (B) werden cellen acuut geïnfecteerd met een 1:1 mix van twee linvirussen, de codering voor de constitutief actieve Ppgk-mcherry en PPGK-EGFP transgenes, op verschillende MOIs (2, 4, 8 voor elk virus). Cellen werden gekweekt in proliferatief medium voor 4 dagen, trypsinized en, na fixatie, geprofileerd voor mCherry en EGFP immunofluorescentie zoals hierboven. Ten slotte werden mCherry+EGFP+/mcherryegfp+ verhoudingen berekend, gemiddeld en uitgezet tegen de corresponderende MOIs. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Als voor (2), pTα1 en pSyn activiteit patronen kunnen worden afgeleid op basis van expressie profielen van fluoroprotein genen onder hun controle. In dit voorbeeld is een dergelijke controle rechtstreeks in het geval van mCherry (Figuur 2a), en indirect [d.w.z. gemedieerd door een interface van de tweede generatie van de TetON (figuur 2e)], in het geval van EGFP (Figuur 2b, C, D). Beide promotors zijn specifiek actief binnenTubb3 + postmitotische neuronen (Figuur 2b, C, D), maar ptα1 vuurt ook in een subset van Ki67+ met tussenpozen (Neuronogenic) precursoren (Figuur 2a). Hier, om een idee te geven van een beperkte variabiliteit van de organisator activiteit wanneer cellen worden ontworpen volgens deze standaardomstandigheden (figuur 2e), werden Ptα1-en psyn-driven EGFP expressieniveaus binnen Tubb3+ neuronen gekwantificeerd door Photoshop CS6 histogram plugin. Vervolgens werden onbewerkte gegevens genormaliseerd tegen medianen en uitgezet tegen promotors (figuur 2F). Opvallend waren de fluorescentie spiegels van één cel dicht bij de medianen: eerste en derde kwartiel geëvenaard 0,86 en 1,16, evenals 0,89 en 1,12 in gevallen van pTα1 en pSyn, respectievelijk.
Figuur 2 : Profilering van neurale precursor type-specifieke promotors geschikt om Goi overexpressie te stimuleren. Panelen verwijzen naar de karakterisatie van tubuline alpha 1 (pTα1) en Synapsin (pSyn) promotors, specifiek actief binnen de hele neuronale afstamming en postmitotische neuronen, respectievelijk. Test werden uitgevoerd in neocorticale precursoren geoogst bij verschillende embryonale (En) leeftijden, acuut geïnfecteerd met speciale linvirale mengsels [Ptα1-mcherry in (A); Ptα1-rtta, TRET-EGFP in (B); Psyn-RTTA, tret-EGFP in (C, D); 2μg /ml doxy ab initio], en gekweekt in proliferatief medium (A), proliferatief (2 dagen), gevolgd door differentiatief medium (B, C) of Differentiatief (D) medium. Na fixatie op dag in vitro (DIV) nwerden postmitotische neuronen geïdentificeerd door αTubb3 en met tussenpozen van αKi67 immunofluorescentie; mCherry en EGFP werden gedetecteerd zoals weergegeven in Figuur 1. Signalen werden onthuld zoals weergegeven in Figuur 1. Schaal staven: 100 μm in (A, B) en 50 μm in (C, D). Getoonde zijn (E) toegewijde linvirale mengsels die in deze studie worden gebruikt met verwijzingen naar de deel panelen. Weergegeven is a (F) een spreidings plot van het pTα1-en psyn-driven EGFP-signaal in respectievelijk Tubb3+ cellen als bedoeld onderB) enD). Boxed zijn cellen die vallen tussen 25th en 75e percentielen; snorharen verwijzen naar 10th en 90e percentielen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Zoals voor (3), 3 dagen na linvirale transductie, MtaptEGFP/+ "groene" neurosferen uitdrukken de door de promotor gedreven, mcherry rode fluorescerende proteïne ("Control" bollen) of niet ("test" bollen) (Figuur 3a, B). Alle bollen zijn losgemaakt van losse cellen, zodat er geen klonters zijn, en de bijbehorende suspensies worden gemengd 1:1. Het resulterende mengsel (figuur 3c) wordt op ijs geplaatst en binnen 20 minuten gebruikt voor transplantatie.
Figuur 3 : Voorbeeld van de test ("alleen groen") en controle ("groen-rood") DIV2 neuro sferen en celsuspensie klaar voor transplantatie. (a, B) Deze bollen werden verkregen uit mtaptEGFP/+E 12,5 neocorticale precursoren, acuut geïnfecteerd door linvirale mengsels "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (a) en "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), respectievelijk, elke LV bij Moi = 8, en bewaard in proliferatief medium. C) celsuspensie werd verkregen door "test"-en "controle"-Neuro sferen (A, B) te ontkoppelen van enkelvoudige cellen en deze te mengen 1:1. Schaal staven: 200 μm in (A, B) en 100 μm in (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Wat betreft (4), de procedure voor celinjectie in de neonatale hersenen omvat drie belangrijke stappen. De capillaire, geplaatst op het mid-parasagittale vlak, wordt ingevoerd in de laterale ventriculaire holte via de frontale corticale wand (figuur 4a). Vervolgens wordt het capillair, om beschadiging van de ganglionische eminentie te voorkomen, 30 ° gedraaid binnen het horizontale vlak, zodat de punt op mediaal/caudally wijst (figuur 4b). Tot slot wordt de celsuspensie subtiel uitgeworpen in de laterale ventriculaire Holte, waar het een gemakkelijk te onderscheiden, licht blauwe "wolk" (figuur 4c) vormt.
Figuur 4 : Schema's van de drie stappen procedure gebruikt voor celinjectie in de neonatale hersenen. A) het capillair wordt via de frontale neocorticale wand in de laterale ventrikel ingevoerd. Vervolgens, (B) het wordt geroteerd medialward, om schade van ganglionaire Eminence te voorkomen. Tot slot (C)wordt de celsuspensie zachtjes geïnjecteerd in de laterale ventrikel, waar het een licht blauwe wolk vormt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Wat betreft (5), de analytische procedure omvat vier hoofdstappen. Eerste, optische confocale secties van getransplanteerde neuron-rijke velden worden afgevlakt, volgens MAX Z-projectie modaliteit dus het genereren van RGB. TIFF-bestanden. Hier, als voorbeeld, kunnen alleen "groene test" neuronen en "gele controle" neuronen, afkomstig van getransplanteerde precursoren, gemakkelijk worden onderscheiden (opgemerkt moet worden dat mCherry alternatief kan worden gebruikt om "test" neuronen te labelen) (figuur 5a). Vervolgens wordt een geïdealiseerde, geskeletteerde Camera lucida -versie van de foto gegenereerd door een geschikte grafische software (zie stap 4.2.6) (Figuur 5b) door een operator die blind is voor het rode kanaal. Blindheid van het rode kanaal is van het allergrootste belang om onbedoelde bias in de data-evaluatie te voorkomen. Volgende, single-neuronale silhouetten worden gevoed in NeurphologyJ software als zwart-wit Foto's en waarden van de drie primaire parameters "totale aantal exitpoints" (attachment_points), "totale aantal eindpunten" (eindpunten) en "totaal neuriet lengte "(neurite_length) worden verzameld (figuur 5c). Ten slotte worden secundaire parameters van elk neuron berekend, gemiddeld en statistisch geëvalueerd door Excel-software (figuur 5d).
Figuur 5 : Representatieve stroomdiagram van de Morfometrische analyse van getransplanteerde hersenen. Bovenste rij panelen tonen: (a) een Max z-projectie. TIFF afbeelding van mediale neocortex, vastgesteld 10 dagen na een gemanipuleerde celtransplantatie (groen = mtapt-gedreven, NEURON-beperkte EGFP; rood = mcherry, constitutief labelen "Control" cellen; blauw = DAPI), het groene kanaal signaal en (B) de geskeletteerde e-camera Lucida rendering. Schaal stangen: 50 μm. De onderste rij bevat: (C) primaire morphometrische parameters geëxtraheerd uit neuronale skeletten door neurphologyj software analyse (neurite_length as Σli, attachment_points als NExit en eindpunten als NEnd) en (D) secundaire parameters die op basis daarvan worden berekend. Dit cijfer is gewijzigd van Chiola et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Specifieke aspecten/stappen van deze procedure zijn van cruciaal belang en vereisen speciale aandacht. Ten eerste moeten (a) exploitanten adequaat zijn vooropgeleid om lentivirussen veilig te manipuleren in een BSL-2-conforme labomgeving. Ten tweede, (b) voorafgaand aan het mengen van "test" en "controle" neurale preparaten, is het verplicht om de twee overeenkomstige neurosphere suspensies zorgvuldig te wassen zoals beschreven, om een vertraagde kruisbesmetting van de twee preparaten te voorkomen als gevolg van ongewenste linvirale Carry over. Ten derde, (c) bij het verplanten van cellen moet de zorg worden gelegd terwijl de ventriculaire holte wordt getarget; in dit opzicht is de snelle groene Tracer die in de celsuspensie is opgenomen, van substantiële hulp. Bovendien, (d) om kannibalisme te voorkomen, moeten getransplanteerde pups opnieuw worden overgebracht naar de moeder na hun volledige herstel van de anesthesie (meestal is 10 min voldoende). e) Cryo-snijden van het getransplanteerde weefsel moet worden uitgevoerd bij 60 μm; in feite maakt deze dikte tegelijkertijd een gemakkelijke penetratie van antilichamen in het weefsel mogelijk en beperkt het verlies van informatie afkomstig van artifeitelijke neuron fragmentatie. Ten slotte, (f) om onbedoelde bias in gegevensevaluatie te voorkomen, benadrukken we dat neuron skeletonisatie moet worden uitgevoerd door een operator blind van het rode kanaal.
Het hier beschreven protocol verwijst naar GOF Gene manipulaties. Alternatief, "test" neuronen kunnen worden ontworpen om te downreguleren GOI functie door middel van lentivirussen codering voor RNAi Effectors. Vervolgens gebruiken we meestal mCherry om "Control" neurale cellen te labelen; echter, de mCherry/"Control" en LacZ/"test" schema kan natuurlijk worden omgekeerd. Tot slot verwijst het hier beschreven protocol naar intraveneuze triculaire celinjecties; "test" en "Control" neuronen kunnen ook worden geïnjecteerd in de neurale parenchima21.
Ondanks de voordelen heeft deze methode twee hoofd limieten. Hoewel het mogelijk is om cel-autonome gencontrole van neuro architectuur te onderzoeken, is het niet van toepassing op de milieu beheersing ervan. Bovendien, als getransplanteerde neuronale precursoren migreren van het ventriculaire aspect van de corticale wand naar hun uiteindelijke laminaire locatie na de geboorte (d.w.z. binnen een niet-fysiologische tijdschema), moet deze methode bij voorkeur worden gebruikt voor het model Neuro architectonische controle na voltooiing van de migratie.
Ten slotte moet er bijzondere aandacht worden besteed aan de kritische interpretatie van de resultaten. In het bijzonder, als het X-gen onderwerp van onderzoek de morfologische complexiteit van "test" neuronen vermindert, kan dit niet specifiek de werkelijke impact op de neuron architectuur weerspiegelen. In plaats daarvan zou een dergelijk fenomeen een niet-specifieke index van neuronale schade kunnen zijn die wordt opgewekt door X-overexpressie. Om dit probleem op te lossen, kan het nuttig zijn om lokale dichtheden van getransplanteerde, "test" en "Control" neuronen te vergelijken, dan te zoeken naar mogelijke numerieke krimp van de "test" populatie, als een index van neuronale lijden geïnduceerd door X [deze krimp moet nog meer uitgesproken na een verdere vertraagde analyse van getransplanteerde hersenen]. In dergelijke gevallen kan het probleem worden opgelost door het overepressieniveau van het X-gen te verlagen of naar een verlies-van-functie ontwerp te gaan.
Onze methode draagt bij aan een breed scala aan technologieën die worden gebruikt voor het onderzoeken van genbeheersing van neuronale morfologie in vivo1,2,3,4,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. zoals in de inleiding in herinnering is gebracht, zijn deze technologieën gebaseerd op een verscheidenheid aan ad hoc genetische manipulaties die gericht zijn op perturb-uitdrukkings niveaus en de extractie van morfologische informatie uit de biologische monsters vergemakkelijken. Deze technologieën maken meestal een nauwkeurige sectie van dit besturingselement mogelijk; ze vereisen echter geen waardevolle experimentele vaardigheden en financiële middelen. In dit opzicht biedt de methode drie belangrijke voordelen. Het biedt een nauwkeurige controle van de expressieniveaus van GOI die vergelijkbaar zijn met die welke kenmerkend zijn voor transgene modellen; echter, bij afwezigheid van mutanten kolonie onderhoudskosten. Het vereist geen geavanceerde experimentele (chirurgische) vaardigheden. Het realiseert vaak statistische significantie van resultaten bij analyse van een relatief beperkt aantal dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Mihn Duc do voor zijn bijdrage aan de vroegtijdige instelling van deze procedure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
