Summary
Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.
Abstract
Il controllo genico della citoarchitettura neuronale è attualmente oggetto di indagini intensive. Descritto qui è un metodo semplice sviluppato per studiare il controllo genico in vivo della morfologia del neurone di proiezione neocorticale. Questo metodo si basa su (1) ingegneria lentivirale in vitro di precursori neuronali come cellule "test" e "controllo", (2) il loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e (3) la valutazione morfometrica associata dei loro derivati neuronali. In particolare, a questo scopo vengono utilizzati precursori palliali E12.5 provenienti da donatori panneuronali, geneticamente etichettati. Sono progettati per sfruttare i promotori selezionati e la tecnologia tetON/OFF, e vengono trapiantati a mano libera in ventricoli laterali neoalari. Successivamente, al momento della profilazione immunofluorescenza dei cervelli riceventi, le sagome dei neuroni trapiantati vengono inserite nel software open source NeurphologyJ, vengono estratti i loro parametri morfometrici e vengono calcolati i dati di lunghezza e diramazione medici. Rispetto ad altri metodi, questo offre tre vantaggi principali: permette di ottenere un controllo fine dell'espressione transgenica a costi accessibili, richiede solo competenze chirurgiche di base e fornisce risultati statisticamente affidabili dopo l'analisi di un numero di animali. A causa del suo design, tuttavia, non è sufficiente affrontare il controllo non autonomo delle cellule della neuroarchitettura. Inoltre, dovrebbe essere preferibilmente usato per studiare il controllo della morfologia neurite dopo il completamento della migrazione neuronale. Nella sua formulazione attuale, questo metodo è squisitamente sintonizzato per studiare il controllo genetico dell'architettura neocorticale glutamatergica. Approfittando delle linee transgeniche che esprimono EGFP in altri tipi specifici di cellule neurali, può essere riutilizzato per affrontare il controllo genico della loro architettura.
Introduction
Qui descriviamo un semplice metodo che abbiamo sviluppato per sezionare il controllo genico in vivo della citoarchitettura neuronale. Basato sull'ingegneria in vitro dei precursori neuronali, il loro trapianto nel cervello neonale e la valutazione morfometrica accoppiata delle cellule "test" e "controllo", permette di svelare implicazioni funzionali dei geni di prova nel controllo fine della morfologia neuronale in un modo veloce e conveniente. Per studiare il controllo genico in vivo dell'architettura neuronale, devono essere affrontate tre questioni tecniche chiave: (1) ottenere un'espressione gene of-interest (GOI) adeguatamente modellata e un controllo quantitativo accurato di essa; (2) ottenere una visualizzazione adeguatamente segmentata di sagome neuronali distinte; (3) suscitare un significato statistico dei risultati, impiegando un numero limitato di animali.
Quando disponibile, le linee mutanti di topo che ospitano transgeni controllati da tetraciclina (tet) possono essere lo strumento migliore per affrontare il primo numero1. In alternativa, può essere impiegata la transgenesi somatica. In questi casi, il transgene viene consegnato tramite elettroporazione2 o trasduzione virale3. Successivamente, viene mantenuto come esoma (ad esempio, su elettroporazione standard4), oppure è integrato nel genoma (casualmente, tramite integrasi retrovirale5; o in una posizione definita, tramite la ricombinazione omologa promossa da CRISPR (SLENDR)6 ).
In secondo luogo, la visualizzazione della silhouette neuronale può essere ottenuta tramite (a) etichettatura uniforme sparsa o (b) etichettatura differenziale densa. Per quanto riguarda l'etichettatura sparse, le metodologie avanzate simili a Golgi possono essere impiegate7, i miniset neuronali selezionati possono essere riempiti dalla biocitina8e l'etichettatura sale e pepe può essere ottenuta grazie a un transgene scarsamente espresso. Tale transgene può visualizzare la trascrizione variegata (Thy-EGFP)9 o può essere attivato da ricombinazione stocastica (MORF)10. Per quanto riguarda (b), le strategie all'avanguardia includono la ricombinazione stocastica mediata da Cre nell'ambito di un array transgene di fluoroproteina multi-floscio (Barcobalen)11, nonché l'integrazione genomica di semi-maschera-trasponesi dei geni della fluoroproteina, in precedenza tramite transgenesi somatica (CLoNE)12.
Per quanto riguarda il terzo numero, l'esito morfometrico è spesso influenzato da una grande variabilità casuale, originata da differenze tra animali e contingenze di iniezione cellulare. Per questo motivo, un gran numero di animali è di solito impiegato per ottenere il potere statistico necessario per valutare l'attività morfometrica GOI.
Gli approcci descritti in precedenza spesso si basano su competenze tecniche avanzate e richiedono risorse finanziarie cospicue, che possono limitare la loro diffusione all'interno della comunità scientifica. Per aggirare questi problemi, abbiamo concepito una pipeline semplice e diretta per sezionare il controllo genetico della neuroarchitettura in vivo in modo rapido e conveniente. Questo è ispirato da un design di co-trapianto simile precedentemente sviluppato per la valutazione veloce in vivo dell'attività transgenica antiblastica13.
In particolare, si pensa che il co-trapianto di precursori neurali "verdi" ingegnerizzati in vitro ("test" e cellule "controllo") in un cervello neoatale ricevente "nero" possa risolvere contemporaneamente le tre questioni chiave sopra elencate. Infatti, in vitro lentivirale dei precursori, in condizioni ben controllate, consente il mantenimento della variabilità dell'espressione transgenica neuronale al minimo, molto al di sotto di quella solitamente associata a manipolazioni somatiche in vivo (eseguite in precedenza 14 Del sistema , 15 e nei nostri risultati inediti). Il controllo accurato risultante dell'espressione genica è paragonabile a quello ottenuto da modelli transgenici controllati da tet. Tuttavia, i costi di questa procedura sono di gran lunga inferiori a quelli derivanti dal mantenimento di una linea murina transgenica. Successivamente, l'iniezione di celle a mano libera è facile e richiede un addestramento minimo. Inoltre, la quantità di precursori etichettati iniettati in ogni cervello può essere facilmente messa a punto per ottenere un numero cumulativo sufficiente di precursori scarsamente distribuiti, mantenendo al contempo il numero totale di animali trapiantati. Infine, ma non meno importante, la coiniezione di diversi precursori con etichettatura fluoro, "test" e "controllo" e la successiva analisi statistica a coppie dei risultati contrastano gli effetti della variabilità sperimentale interanimale, consentendo il raggiungimento di significato statistico dei risultati, anche dopo l'analisi di un numero limitato di individui13.
Va sottolineato che, anche se veloce ed economico, questo metodo ha due limitazioni principali. In primo luogo, è progettato per studiare il controllo genico autonomo delle cellule dell'architettura neuronale e non è appropriato affrontare il controllo ambientale. In secondo luogo, poiché i precursori neuronali trapiantati raggiungono la loro posizione finale da un programma eterocronico, questo metodo è preferibile al controllo neuroarchitettonico modello che si verificano oltre il completamento della migrazione.
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Protocol
Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dal SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Generazione di piscine progenitori "verdi" ingegnerizzate
- Preparazione della piscina "verde"
- Accoppiare una femmina di tipo selvaggio CD1 con un Fondatore di MtaptEGFP / s 16 . Eutanasia la diga incinta per lussazione cervicale a 12,5 giorni dopo il coitum (giorno 0 è determinato dall'ispezione vaginale della spina) e raccoglie gli embrioni della giornata embrionale 12.5 (E12.5). Impostarli in singoli pozzi di una piastra multi-well 24 in soluzione PBS fredda.
- Genota rapidamente gli embrioni mediante ispezione visiva sotto una lampada a luce blu, controllando l'emissione di fluorescenza verde nel cervello.
- Collocare gli embrioni "verdi" in un piatto Petri di 10 cm di diametro riempito con 1x PBS freddo con 0,6% di glucosio e trasferirlo sotto uno stereoscopio.
- Tagliare le teste degli embrioni utilizzando forbici standard ed estrarre il telencephalon da loro per mezzo di #3 e #5 pinze.
- Separare le due vesciche telencefali e sezionare le neocortice usando le pinze; assicurarsi di rimuovere l'ippocampo e i gangli basali17.
- Raccogliere le neocortice trasferendole con una pipetta P1000 in un tubo da 1,5 mL tenuto sul ghiaccio.
- Lasciare che le neocortici sezionate si stabilizzino sul fondo del tubo.
- Aspirare il super-attante il più possibile.
- Risospendere le neocortize in 400 -L di fresco mezzo proliferare [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL di albumina del siero bovino (BSA), 0,6% di glucosio, 2 g/mL di eparina, 20 ng/mL fattore di crescita del fibroblasto di base (bFGF), 20 ng/mL fattore di crescita epiderle (EGF), 1X g/mL di spessore-penna, e 10 pg/mL amphotericin B].
- Pipette delicatamente le neocortice su e giù, in sequenza con P1000, P200, e P20 punte, 4x per punta, per ottenere una sospensione cellulare torbida.
NOTA: Il tessuto neocorticale E12.5 è molto morbido; dissociarlo a singole cellule non richiede affatto la digestione enzimatica; pipettaggio ripetuto è sufficiente. - Lasciate che le mense e grumi neocorticali residui si stabiliscano per 2 min.
- Trasferire 150 l dalla parte superiore della sospensione cellulare (contenente principalmente singole cellule) in un nuovo tubo sterile da 1,5 ml.
- Aggiungere 150 l di fresco mezzo proliferare e ripetere i passaggi 1.1.10-1.1.12 fino a quando non sono più evidenti i grumi di tessuto. Durante questa operazione, omettere il passo di pipettaggio P1000 (nel passaggio 1.1.10).
NOTA: Tre iterazioni dei passaggi 1.1.10-1.1.12 sono in genere sufficienti per ottenere la dissociazione completa dei tessuti. - Contare le celle ("verde" piscina) con il metodo di esclusione blu trypan in una camera di B àrker17 e aggiungere nuovo mezzo proliferale per regolare la concentrazione a 103 cellule / .
NOTA: i passaggi 1.1.7-1.1.14 devono essere eseguiti sotto una cappa sterile a flusso laminare disinfettata dal 70% di etanolo e mantenuti ventilati per almeno 20 min.
- Ingegneria dei sottopool "verdi"
- Suddividere la piscina "verde" in due sotto-piscine in due distinti tubi da 1,5 mL per l'infezione lentivirale.
- Infettare le sottopool in modo indipendente con le due miscele lentivirali dedicate. Ogni mix contiene "etichetta rossa" virus (Pgk1_mCherry) o "nero" virus (pCAG_lac) come controllo, nonché virus per tetOFF guidato transgene (Pgk1p_tTA e TRE_transgene) o controllo (Pgk1p_tTA e TRE_PLAP) espressione o controllo (Pgk1p_tTA e TRE_PLAP) espressione.
LEGGI: Manipolare i lentivirus in un ambiente BLS-2 con tutte le misure protettive prescritte dalle norme e dalle leggi applicabili.
NOTA: Ogni lentivirus deve essere somministrato a una molteplicità di infezione (MOI) di 8, che (come precedentemente mostrato14) è sufficiente per trasdurre la stragrande maggioranza delle cellule neurali in tali condizioni sperimentali (Figura 1). Il lentivirus che ospita i transattivatori tet può essere costruito impiegando diversi promotori neuronali che guidano l'espressione tTA/rtTA (ad esempio, pT-1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, ecc.) (Figura 2). Il MOI è il rapporto (a) il numero di particelle virali infettive consegnate a (b) il numero delle loro cellule bersaglio. Qui, il primo (a) è calcolato secondo la procedura convenzionale descritta altrove14, la seconda (b) viene semplicemente valutata utilizzando una camera di Bérker. - Piastra 600.000 cellule di ogni sottopool infetto per pozzo di una piastra multigona 12, in 600 - L di mezzo proliferale con 2 g/mL di doxycycline.
NOTA: Qui, i pozzi non sono pretrattati con poli-lysina, che impedisce l'attaccamento delle cellule neurali ai loro fondi. - Trasferire le cellule all'incubatrice in 5% CO2 a 37 .
- Dopo 2 giorni, per valutare l'efficienza dell'infezione e la marcatura differenziale delle piscine ingegnerizzate, ispezionare le cellule al microscopio fluorescente convenzionale. Le due sottopool devono apparire come sospensioni di piccole neurosfere, esprimendo omogeneamente la proteina fluorescente rossa ("campione di controllo" ) o meno (campione di prova"). All'interno di queste neurosfere, il transgene MtaptEGFP è attivo limitato a una minoranza di cellule (neuroni post-mitotici) e silenzioso nella maggior parte di loro (precursori della proliferazione) (Figura 3).
2. Impostazione degli strumenti chirurgici e dell'area operativa
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Preparazione degli aghi borosilicati
- Utilizzare i capillari di vetro borosilicate con diametro esterno ed interno pari rispettivamente a 1,5 e 1,12 mm.
- Tirare il capillare con un tiratore P 1000.
- Impostare il programma di estrazione. I parametri tipici del programma sono: calore - 614; vel 60; all'ora n. 1; pressione di 600. Essi devono essere regolati secondo il modello di tirare e il resistore di riscaldamento impiegato.
- Posizionare il capillare nei supporti dell'emittente e stringerli.
- Avviare il programma e prendere i due microcapillari tirati.
- Tagliare a mano la punta capillare, con un bisturi, sotto lo stereoscopio per ottenere una punta con un diametro esterno di 200-250 m.
- Posizionare i capillari su un supporto di argilla da modellare (ad esempio, plastilina) in un piatto Petri chiuso e trasferirlo sotto il cofano.
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Impostazione del cofano e preparazione della soluzione di tracciamento cellulare
- Pulire con attenzione il cappuccio del flusso orizzontale e disinfettarlo utilizzando il 70% di etanolo.
- Disinfettare le fibre ottiche utilizzando il 70% di etanolo e posizionarle sotto il cofano.
- Mescolare 10 - L di 125 mM soluzione EGTA e 10 L di Fast Green per preparare la "soluzione di tracciamento cellulare" e posizionarlo sotto il cofano.
- Tagliare piccoli pezzi (4 cm x 2 cm di dimensioni) della pellicola di sigillamento di laboratorio per l'avvistamento delle sospensioni cellulari.
- Preparare una soluzione di 1 mg/mL sterile doxycycline e aspirarlo in una siringa da 0,3 ml.
- Accendere il cofano e mantenere acceso il flusso laminare per 20 min prima dell'operazione.
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Assemblaggio del tubo di iniezione
- Prendi un boccaglio in plastica dura, due tubi di lattice (ciascuno lungo circa 30 cm) e un supporto capillare da un kit di assemblaggio di tubi aspiratori per pipette microcapillari calibrate.
- Fissare il boccaglio in plastica dura ad un'estremità di un tubo di lattice.
- Fissare il supporto capillare ad un'estremità di un altro tubo di lattice.
- Collegare le estremità libere dei due tubi di lattice con un filtro sterile da 0,45 m, come barriera contro i germi dell'operatore.
- Posizionare l'assieme tubo dell'aspiratore risultante su un supporto di argilla da tenere sotto il cofano.
3. Miscela cellulare e trapianto intraventricolare
- Combinazione di sottopool di celle verdi "test" e "controllo"
- Raccogliere le neurosfere "test" e "controllo" (vedere il passaggio 1.2.5) in tubi separati da 1,5 mL.
- Centrifuga neurofere sospensione a 200 g per 5 min.
- Raccogliere e scartare il supernatante, evitando disturbi del pellet cellulare.
- Resospendi delicatamente le neurosfere in 500 -L di 1x PBS.
- Centrifugarli a 200 g per 1 min.
- Togliete il super-acletterante.
- Ripetere i passaggi 3.1.4-3.1.6 altre due volte.
- Resospendere delicatamente le sfere in 200 gradi di 2x soluzione Trypsin (2x Trypsin, 1x PBS) e pellet di cellule pipetta su e giù 4x-5x.
NOTA: Prestare attenzione a non fare bolle d'aria. - Lasciare le cellule nell'incubatrice per 5 min a 37 gradi centigradi per ottenere una sospensione a singola cella.
- Bloccare il Trypsin con 200.L di soluzione inibitore della Trypsin (DMEM-F12, 10 g/mL DNAse I, inibitore di 0,28 mg/mL Di Trypsin) con tubazione su e giù 4x-5x.
- Centrifuga a 200 x g per 5 min e risospenderle in 1 mL di nuovo mezzo proliferare (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0,6% di glucosio, 2 g/mL di eparina, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x pen-strep, 10 pg/mL amphotericin B).
- Contare le celle delle due piscine con il metodo di esclusione blu trypan in una camera di B.
- Regolare la loro concentrazione a 100.000 cellule /L nel mezzo proliferale.
- Mescolare 1:1 "test" cellule con quelli "controllo".
- Controllare il mix risultante al microscopio a fluorescenza (ingrandimento oggettivo: 10x) per assicurarsi che il mix sia una sospensione a cella singola delle due piscine (Figura 3C).
- Posizionare il mix sul ghiaccio sotto il cofano.
- Trapianto intraventricolare
- Preparare la gabbia con la madre e i cuccioli P0 su un tavolo lontano dalla zona operatore chirurgico.
- Posizionare una gabbia di recupero su un carrello vicino al cofano.
- Mettere una miscela di segatura prelevata dalla gabbia della madre sul fondo della gabbia di recupero e posizionarla sotto una lampada.
- A parte, impostare una scatola di ghiaccio coperta da un foglio di alluminio per l'anestesia dei cuccioli p0.
- Poco prima del trapianto, aggiungere un volume di 1/10 della soluzione di tracciamento cellulare (dal passo 2.2.3) a 1 volume di sospensione cellulare (dal passo 3.1.16) e individuare 3 L della risultante "miscela di iniezione" su un pezzo di pellicola di sigillazione di laboratorio.
- Posizionare il cucciolo sul foglio di alluminio fresco per 1 min e verificare che sia completamente anetizzato.
NOTA: Per confermare l'anestesia, spremere delicatamente una zampa e monitorare il cucciolo per mancanza di movimenti, mentre si respira ancora. - Nel frattempo, aspirare il 3 OL di miscela di iniezione (dal passo 3.2.5) nel capillare di vetro.
- Pulire delicatamente la testa del cucciolo anetizzato con il 70% di etanolo.
- Posizionare il mento del cucciolo sulla punta della fibra ottica per identificare chiaramente gli emisferi corticali.
NOTA: A P0-P1, la pelle della testa è molto sottile, consentendo una semplice identificazione visiva degli emisferi appena sopra i bulbi oculari e dietro i bulbi olfattivi. - Mantenere il capillare (caricato come descritto nel passaggio 3.2.7) in uno dei due piani intermedi (sinistra o destra), sopra il bulbo olfattivo, e forare la pelle della fronte alla sua intersezione con il piano frontale contenente i centri degli occhi. Prestare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. Inserire il capillare nella corteccia frontale e accedere alla cavità ventricolare (Figura 4A).
- Per evitare danni accidentali dell'eminenza ganglionica, ruotare l'ago lateralmente di 30 gradi, puntando la sua punta caudale-mediale-reparto (Figura 4B).
- Iniettare delicatamente le cellule nella cavità ventricolare e monitorarne la diffusione mediante Verde veloce (Figura 4C).
- Attendere 5-10 s.
- Rimuovere l'ago di vetro avendo cura di non aspirare la sospensione cellulare e scartarlo in un contenitore di smaltimento adatto.
- Prima del recupero del cucciolo dall'anestesia iniettare 150 -L di soluzione doxyciclica intraperitonealmente per mantenere l'espressione transgenica ancora fuori dopo il trapianto.
- Dopo l'iniezione, posizionare immediatamente il cucciolo sotto la lampada per il recupero.
- Lasciare i cuccioli sotto la lampada per 5-10 min e, una volta completamente sveglio, metterli nella gabbia con la madre.
- Osservare i cuccioli operati per 2-3 h, per assicurarsi che la madre li accetti.
- Fornire alla gabbia acqua potabile contenente doxycycline da 0,5 mg/mL e 50 g/L di saccarosia per mantenere l'espressione transgenica.
- Sostituire l'acqua contenente doxycycline con acqua priva di 4 giorni dopo il trapianto, attivando così il transgene nei neuroni post-mitotici. Tenere i topi in regime senza per 6 giorni e eutanasia a P10 per inalazione di anidride carbonica seguita da decapitazione.
4. Analisi dei cervelli trapiantati
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Istologia e immunofluorescenza
- Eutanasia i cuccioli trapiantati 10 giorni dopo il trapianto di cellule per inalazione di anidride carbonica seguita da decapitazione. Fissare i cervelli dei cuccioli di eutanasia nel 4% di paraformaldeide (PFA) a 4 gradi centigradi durante la notte.
AMMONIenza: l'APIS è altamente tossico; maneggiarlo con cura, rigorosamente conforme alle prescrizioni del produttore, sotto una cappa di fumi chimici; scartare il residuo della soluzione PFA in un contenitore di rifiuti etichettato. - Rimuovere la soluzione PFA e sostituirla con la soluzione di saccarosio 30%.
- Lasciare il cervello a 4 gradi centigradi o fino a quando non affondano sul fondo della fiala.
- Trasferire il cervello in uno stampo di incorporamento usa e getta circa mezzo pieno con mezzo crio-inclusione.
- Congelare i cervelli inclusi a -80 gradi centigradi.
- Tagliare le sezioni coronali spesse 60 m utilizzando un criostato.
NOTA: Evitare di utilizzare sezioni più sottili, in quanto ciò può comportare una perdita inaccettabile di informazioni riguardanti l'intera architettura dei singoli neuroni. - Sezioni di processo per immunofluorescenza18,19, utilizzando anticorpi anti-GFP [1:400] e anti-RFP (mCherry) [1:500]. Controstain nuclei con 1 soluzione daPI mg/mL [1:200].
- Eutanasia i cuccioli trapiantati 10 giorni dopo il trapianto di cellule per inalazione di anidride carbonica seguita da decapitazione. Fissare i cervelli dei cuccioli di eutanasia nel 4% di paraformaldeide (PFA) a 4 gradi centigradi durante la notte.
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Morfometria
- Impostare i parametri di lavoro del microscopio confocale come segue: altezza dello stack z : 40 m; passo: 2 m.
- Raccogli immagini di fette immunoasconsiderate selezionando campi fotografici positivi ai neuroni GFP, ciechi della distribuzione del segnale RFP.
- Esportare le immagini come file .nd2.
- Generare il numero massimo di proiezioni di z come file .tiff (Figura 5A).
- Per consentire la scheletrizzazione neuronale subsequenziale non vedente al genotipo delle cellule, nascondete il segnale rosso. A tale scopo, aprire ogni file .tiff da un software adatto e aggiungere un livello di regolazione. Selezionare "livelli", "rosso", quindi impostare "output" su zero. Salvare il file come tale.
NOTA: La scheletrizzazione viene successivamente eseguita da un nuovo operatore che non aveva accesso precedente ai file rossi semplici originali. - Per ogni file rosso nascosto, aggiungere un livello di disegno all'immagine principale e selezionare lo strumento matita (colore bianco). Tracciare il soma sulla base del segnale GFP, quindi tracciare i neuriti.
NOTA: lo strumento matita può essere impostato su 40 pixel per il soma e su tre pixel per i neuriti. - Salvare il file multilivello incluse le sagome neuronali (Figura 5B).
NOTA: L'analisi successiva dello scheletro neuronale può essere eseguita da entrambi gli operatori. - Creare un nuovo file in scala di grigi a 16 bit 1024 x 1024 con sfondo nero, uno per neurone.
- Copiare e incollare singole sagome neuronali dall'immagine primaria al nuovo file in scala di grigi. Torna al file multistrato e spegni lo strato di regolazione per svelare i genotipi neuronali. Salvare il file in scala di grigi a 16 bit annotando il genotipo neuronale corrispondente.
- Importa immagini in scala di grigi in ImageJ una alla volta e analizza gli scheletri dal plugin NeurphologyJ del software ImageJ20 (Figura 5C).
- Copiare i dati primari di NeurphologyJ (neurite_length, attachment_points e endpoint ;per ognuno, prendere i valori "Total Area"), incollarli in un foglio di calcolo e utilizzarli per calcolare parametri morfometrici secondari ( lunghezza media dei neuriti, indice di diramazione(Figura 5D).
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Representative Results
Esistono cinque set di dati primari che forniscono informazioni utili sugli aspetti chiave della procedura, il primo è (1) l'efficienza della trasduzione e co-trasduzione dei precursori neurali da parte dei vettori lentivirali. (2) Un esempio di caratteristiche chiave dei promotori impiegati per guidare il "gene di prova". (3) Un esempio di cellule ingegnerizzate pronte per il trapianto. (4) Una vignetta che include i dettagli procedurali chiave della microiniezione cellulare nel cervello neonale. (5) Una sinossi dell'intero gasdotto morfometrico.
Per quanto riguarda (1), è stata valutata la capacità dei prototipi di vettori lentivirali consegnati a diversi MOI (2,4,8) per trasdurre efficacemente i precursori neocorticali. Nel primo analisi, i precursori neurali provenienti dalle prime neocortize wild-type sono stati infettati da un reporter lentivirale, che ospita la sequenza di codifica mCherry (cds) sotto il controllo del promotore di pT-1 neurono-specifico di derivazione, al MOI 2, 4, 8, poi permesso di differenziare. La co-immunoprofiling delle loro progenie per mCherry e il marcatore pan-neuronale Tubb3 ha mostrato che i neuroni sono stati effettivamente trasdotti a frequenze del 64%, 69% e 78%, rispettivamente (Figura 1A). In un secondo saggio, i precursori neocorticali sono stati acutamente coniati da due reporter lentivirali, esprimendo EGFP e mCherry, sotto il controllo del promotore di pPgk1, ai MOI (2,2), (4,4) e (8,8). Pochi giorni dopo, la profilazione co-immuno-immuno-immuno-immunodeista dei loro derivati ha mostrato che il rapporto tra EGFP,mCherry e EGFP,cellule mCherry, era rispettivamente dell'80%, 88% e 93%, (Figura1B). Questi dati suggeriscono che, al momento della consegna del protocollo ingegneristico previsto per il presente studio, (a) la stragrande maggioranza dei neuroni sono traducibili e (b) quasi tutti i neuroni trasdotti hanno ricevuto l'insieme lentivirale completo necessario per la loro caratterizzazione.
Figura 1 : Efficienza della trasduzione delle cellule precursori neurali mediante vettori lentivirali. I gruppi di esperti riferiscono una valutazione dell'efficienza con cui le cellule precursori neocorticali E12.5 vengono trasdotte (o co-trasdotte) alla consegna di reporter lentivirali dedicati in diverse molteplicità di infezione (MMI). Nel primo caso (A), le cellule sono state afettamente infettate dal lentivirus (LV) pT-1-mCherry al MOI 2, 4, 8, coltivate in mezzo proliferaper 2 giorni, trasferite al mezzo differenziatore e hanno permesso di differenziarsi per 1 settimana. Al momento della fissazione al giorno in vitro (DIV) 9, le colture sono state co-immunoprofiled per mCherry e il marcatore pan-neuronale Tubb3. I segnali mCherry ed EGFP sono stati rilevati da anticorpi primari anti-RFP e anti-EGFP e rivelati rispettivamente dagli anticorpi secondari coniugati Alexa-594- e Alexa-488. Infine, i rapporti mCherry,Tubb3,/ mCherryTubb3, sono stati calcolati, mediati e tracciati rispetto ai corrispondenti MOI. In quest'ultimo caso (B), le cellule sono state affettate acutamente da una combinazione 1:1 di due lentivirus, codificando per i transgeni pPgk-mCherry e pPgk-EGFP diversi (2, 4, 8 per ogni virus). Le cellule sono state coltivate in mezzo proliferale per 4 giorni, ho cercato e, alla fissazione, profilate per l'immunofluorescenza mCherry ed EGFP come sopra. Infine, sono stati calcolati, calcolati e tracciati i rapporti mCherry,EGFP e mCherryEGFP, calcolando la media e tracciata rispetto ai MOI corrispondenti. Le barre di errore rappresentano S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per quanto riguarda (2), i modelli di attività di pT-1 e pSyn possono essere dedotti sulla base dei profili di espressione dei geni della fluoroproteina sotto il loro controllo. In questo esempio, tale controllo è diretto in caso di mCherry (Figura2A) e indiretto [cioè mediato da un'interfaccia di seconda generazione tetON (Figura 2E)], nel caso di EGFP (Figura2B,C,D). Entrambi i promotori sono specificamente attivi all'interno di Tubb3- neuroni postmitotici (Figura 2B,C,D), ma anche il pT-1 viene attivato in un sottoinsieme di Ki67- precursori intermitotici (neuronogenici) (Figura 2A). In questo caso, per fornire un'idea di limitata variabilità dell'attività promotrice quando le cellule sono progettate in base a queste condizioni standard (Figura 2E), pT - 1- e pSyn-driven livelli di espressione EGFP all'interno di Tubb3- neuroni sono stati quantificati da Photoshop CS6 Istogramma plugin. Quindi, i dati grezzi sono stati normalizzati rispetto ai mediani e tracciati rispetto ai promotori (Figura 2F). Sorprendentemente, i livelli di fluorescenza unicellulare erano densamente raggruppati intorno ai mediani: il primo e il terzo quartile equiparavano rispettivamente a 0,86 e 1,16, così come 0,89 e 1,12 nei casi di pT, 1 e pSyn, rispettivamente.
Figura 2 : Profiling di promotori specifici del tipo di precursore neurale adatti a guidare la sovraespressione GOI. I pannelli si riferiscono alla caratterizzazione dei promotori di Tubulin alpha 1 (pT) e Synapsin (pSyn), specificamente attivi all'interno dell'intero lignaggio neuronale e dei neuroni postmitotici, rispettivamente. I test sono stati eseguiti in precursori neocorticali raccolti in eree diverse (En),acutamente infettati da miscele lentivirali dedicate [pT-1-mCherry in (A); pT-tTA, TREt-EGFP in (BpSyn-rtTA, TREt-EGFP in (C,D); /ml doxy ab initio], e coltivato in mezzo prolifera (A), proliferativo (2 giorni) seguito da mezzo differenziatore (B,C) o mezzo differenziatorio (D). Al momento della fissazione al giorno in vitro (DIV) n, i neuroni postmitotici sono stati identificati da "Tubb3" e i precursori intermitotici con immunofluorescenza di .Ki67; mCherry ed EGFP sono stati rilevati come illustrato nella figura 1. I segnali sono stati rivelati come mostrato nella Figura 1. Barre della scala: 100 m in (A,B) e 50 m in (C,D). Le miscele lentivirali dedicate (E) utilizzate in questo studio con riferimenti ai pannelli di figure. Mostrato è un (F) un grafico a dispersione di segnale EGFP pT -1 e pSyn-driven in Tubb3: celle a cui si fa riferimento in (B) e (D), rispettivamente. Le celle in scatola sono celle che cadono tra il 25th e il 75esimo percentile; baffi si riferiscono a 10th e 90th percentiles. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per quanto riguarda (3), 3 giorni dopo la trasduzione lentivirale, le neurosfere "verdi" MtaptEGFP/ s esprimono la proteina fluorescente pgk1p-driver, mCherry red fluorescente ("controllo") o no ("sfere di prova") (Figura 3A, B). Tutte le sfere sono dissociate su singole cellule, assicurando che non ci siano grumi a sinistra, e le sospensioni corrispondenti sono mescolate 1:1. Il mix risultante (Figura 3C) viene posto sul ghiaccio e utilizzato entro 20 min per il trapianto.
Figura 3 : Esempio di neurosfere DIV2 di prova ("solo verde") e controllo ("verde-rosso") e sospensioni cellulari pronte per il trapianto. (A,B) Queste sfere sono state ottenute da precursori neocorticali MtaptEGFP/eE 12,5, acutamente infettati da miscele lentivirali "pCACAG_lac, Pgk1p_tTA, TREt_GOI" (A) e "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP" (B), rispettivamente, ogni LV a MOI 8, e mantenuto in mezzo prolifera. (C) Sospensione cellulare è stata ottenuta dissociando "test" e "controllo" neurosfere (A,B) a singole cellule e mescolandole 1:1. Barre della scala: 200 m in (A,B) e 100 m in (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per quanto riguarda (4), la procedura per l'iniezione cellulare nel cervello neooatale include tre passaggi chiave. Il capillare, posto sul piano medio-parasagittale, viene inserito nella cavità ventricolare laterale attraverso la parete corticale frontale (Figura 4A). Successivamente, per evitare danni all'eminenza ganglionica, il capillare viene ruotato di 30 gradi all'interno del piano orizzontale, in modo che la punta punti mediamente/caudally (Figura 4B). Infine, la sospensione cellulare viene delicatamente espulsa nella cavità ventricolare laterale, dove forma una "nuvola" facilmente identificabile e azzurra (Figura 4C).
Figura 4 : Schemi della procedura a tre fasi impiegata per l'iniezione cellulare nel cervello neodeterminato. (A) Il capillare viene inserito nel ventricolo laterale attraverso la parete neocorticale frontale. Poi, (B) viene ruotato mediamente verso il basso, per evitare danni di eminenza ganglionica. Infine (C), la sospensione cellulare viene iniettata delicatamente nel ventricolo laterale, dove forma una nuvola azzurra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per quanto riguarda (5), la procedura analitica comprende quattro fasi principali. In primo luogo, le sezioni ottiche confocali di campi trapiantati ricchi di neuroni vengono appiattite, secondo la modalità MAX di proiezione in modo da generare file RGB .tiff. Qui, ad esempio, solo i neuroni "green test" e i neuroni "controllo giallo", provenienti da precursori co-trapiantati, possono essere facilmente distinti (si dovrebbe notare che mCherry può essere usato in alternativa per etichettare i neuroni "test") (Figura 5A). Quindi, una versione idealizzata della fotocamera lucida dell'immagine viene generata da un software grafico adatto (vedere il passaggio 4.2.6) (Figura 5B) da un operatore cieco di canale rosso. La cecità del canale rosso è di fondamentale importanza per evitare qualsiasi distorsione involontaria nella valutazione dei dati. Successivamente, le sagome mononeuronali vengono inserite nel software NeurphologyJ come immagini in bianco e nero e valori dei tre parametri primari "numero totale di exitpoint" (attachment_points), "numero totale di endpoint" (endpoint) e "totale) neurite length" (neurite_length) vengono raccolti (Figura 5C). Infine, i parametri secondari di ogni neurone vengono calcolati, calcolati in media e valutati statisticamente dal software Excel (Figura 5D).
Figura 5 : Diagramma di flusso rappresentativo dell'analisi morfometrica dei cervelli trapiantati. I pannelli riga superiore mostrano: (A) un'immagine MAX z-projection .tiff di neocorteccia mediale, fissa 10 giorni dopo il trapianto di cellule ingegnerizzate (verde - Mtapt-driven, eGFP soggetto a neurone; rosso - mCherry, costitutivamente etichettatura "controllo" cellule; blu DAPI), il segnale del canale verde e (B) il rendering e-camera lucida scheletrato. Barre della scala: 50 m. La riga inferiore comprende: (C) parametri morfometrici primari estratti dagli scheletri neuronali dall'analisi software NeurphologyJ (neurite_length come come fineN ) e (D) i parametri secondari calcolati sulla loro base. Questa cifra è stata modificata da Chiola et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Aspetti/passaggi specifici di questa procedura sono fondamentali e richiedono particolare attenzione. In primo luogo, (a) gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per manipolare in modo sicuro i lentivirus in un ambiente di laboratorio conforme a BSL-2. In secondo luogo, (b) prima di mescolare "test" e "controllo" preparati neurali, è obbligatorio lavare attentamente le due sospensioni neurosfera corrispondenti come descritto, al fine di prevenire qualsiasi infezione incrociata ritardata dei due preparati a causa di lentivirale indesiderato riportare. In terzo luogo, (c) durante il trapianto di cellule, la cura deve essere posta mentre si prende di mira la cavità ventricolare; a questo proposito, il tracciante Fast Green incluso nella sospensione cellulare è di sostanziale aiuto. Inoltre, (d) per prevenire il cannibalismo, i cuccioli trapiantati devono essere ritrasferiti alla madre solo dopo il loro pieno recupero dall'anestesia (di solito 10 min è sufficiente). e) La criosezione del tessuto trapiantato deve essere eseguita a 60 m; infatti, questo spessore consente contemporaneamente una facile penetrazione dell'anticorpo nel tessuto e limita la perdita di informazioni provenienti dalla frammentazione del neurone artifactuali. Infine, (f) per prevenire qualsiasi distorsione involontaria nella valutazione dei dati, sottolineiamo che la scheletrizzazione del neurone deve essere eseguita da un operatore cieco di canale rosso.
Il protocollo qui descritto si riferisce alle manipolazioni geniche GOF. In alternativa, i neuroni "test" possono essere progettati per downregolare la funzione GOI per mezzo della codifica lentivirus per gli effetti RNAi. Successivamente, di solito impieghiamo mCherry per etichettare "controllo" le cellule neurali; tuttavia, lo schema mCherry/"control" e Lac/test" può essere ovviamente invertito. Infine, il protocollo qui descritto si riferisce alle iniezioni di cellule intraventricolari; I neuroni "test" e "controllo" possono essere alternativamente co-iniettati nel parenchima neurale21.
Nonostante i suoi vantaggi, questo metodo ha due limiti principali. Pur consentendo distudiare il controllo genetico autonomo della neuroarchitettura cellulare, non si applica al controllo ambientale di essa. Inoltre, poiché i precursori neuronali trapiantati migrano dall'aspetto ventricolare della parete corticale alla loro posizione laminare finale dopo la nascita (cioè entro un lasso di tempo non fisiologico), questo metodo dovrebbe essere preferibilmente impiegato per modellare controllo neuroarchitettonica dopo il completamento della migrazione.
Infine, ma non meno importante, occorre prestare particolare attenzione all'interpretazione critica dei risultati. In particolare, se il gene X oggetto di indagine riduce la complessità morfologica dei neuroni "test", questo potrebbe non riflettere specificamente il suo impatto genuino sull'architettura dei neuroni. Piuttosto, tale fenomeno potrebbe essere un indice non specifico di danno neuronale suscitato dalla sovraespressione X. Per affrontare questo problema, può essere utile confrontare le densità locali dei neuroni trapiantati, "test" e "controllo", quindi cercare un possibile restringimento numerico della popolazione "test", come indice della sofferenza neuronale indotta da X [questo restringimento dovrebbe essere ancora più su un'ulteriore analisi ritardata dei cervelli trapiantati]. In questi casi, abbassando il livello di overepressione del gene X o passando a un progetto di perdita di funzione potrebbe risolvere il problema.
Il nostro metodo si aggiunge ad una vasta gamma di tecnologie impiegate per studiare il controllo genico della morfologia neuronale in vivo1,2,3,4,7,8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12. Come ricordato nell'introduzione, queste tecnologie si basano su una varietà di manipolazioni genetiche ad hoc volte a perturbare i livelli di espressione GOI e facilitare l'estrazione di informazioni morfologiche dai campioni biologici. Queste tecnologie di solito consentono una dissezione accurata di questo controllo; tuttavia, non richiedono preziose competenze sperimentali e risorse finanziarie. A questo proposito, il metodo offre tre vantaggi chiave. Permette un controllo accurato dei livelli di espressione GOI paragonabili a quelli peculiari dei modelli transgenici; tuttavia, in assenza di costi di manutenzione delle cocopie mutate. Non richiede sofisticate abilità sperimentali (chirurgiche). Spesso raggiunge un significato statistico dei risultati dopo l'analisi di un numero relativamente limitato di animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Mihn Duc Do per il suo contributo alla creazione anticipata di questa procedura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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